一种用于治疗心衰保护心脏功能的药物的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体来说是一种用于治疗心衰保护心脏功能的药物。

背景技术：
：

wnt经典信号通路是由质膜上的wnt受体frizzled和其共受体lrp5/6共同起始的。wnt配体与受体结合诱导的lrp5/6-frizzled复合体的形成是wnt/β-catenin通路激活所必需的。wnt信号通路的共受体低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6（lrp5/6）属于低密度脂蛋白受体家族成员。lrp5/6是i型跨膜蛋白，lrp5/6已报道可以和frizzled直接结合并抑制frizzled的功能。frizzled属于gpcr家族成员，然而对lrp5/6与其他gpcr家族成员的直接关系以及其生理意义报道有限。

gpcr受体家族是一个编码至少800个不同受体基因的大家族，能分别应答不同的胞外配体，包括激素、神经递质和环境刺激，参与了多种生理和病理过程。它是目前最为热门的一大类受体蛋白，糖尿病、心脏病、肿瘤、免疫、感染性疾病、神经和精神疾病的发生都和gpcr有着密切的联系，市场上大约50%药物都以它作为靶点。心脏中表达的gpcr也高达200种以上，这些gpcr积极地参与调节正常的心脏生理机能，而其功能的失调则会导致心脏疾病的发生。事实上，心衰的一个重要特征就是gpcr信号通路的过度激活。心脏中gpcr的长期慢性激活不仅是心衰发生的重要诱因也是心衰加重的重要原因。心脏中gpcr的激活会诱导其下游的g蛋白（gαβγ）信号通路的启动，然后通过激活pka/pkc及camkii等信号途径而诱导心肌细胞肥大，导致胎儿基因重编程及心肌细胞凋亡等。这些渐进式的病理性心肌细胞改变会促使心脏纤维化病变，导致心脏发生重塑，收缩能力下降，最终发生严重的心衰。

技术实现要素：
：

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于治疗心衰保护心脏功能的药物，所述的这种用于治疗心衰保护心脏功能的药物要解决心脏中gpcr的激活会诱导导致发生严重的心衰的技术问题。

本发明提供了lrp5或者lrp6蛋白在制备治疗心衰的药物中的应用。

本发明还提供了一种用于治疗心衰的药物，含有lrp5或者lrp6蛋白。

本发明还提供了lrp6胞外端结构域蛋白在制备治疗心衰的药物中的应用。

本发明还提供了一种用于治疗心衰的药物，含有lrp6胞外端结构域蛋白。

本发明还提供了一种蛋白质，所述的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.2所示。

进一步的，编码上述蛋白质的氨基酸的核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明提供了一种用于治疗心衰的药物，含有上述的蛋白质。

本发明发现，lrp5/6可以和frizzled直接结合并抑制frizzled的功能，进而发现lrp5/6可以和frizzled以外的其他gpcrs直接结合并抑制其功能。本发明选择一个特定的gpcr受体—β肾上腺素受体（βar）。结果表明心肌细胞内的lrp5/6具有抑制βar的功能，从而也证实了lrp5/6的确具有抑制gpcr而保护心脏功能的作用。

本发明首先通过免疫共沉淀技术以及farwestern技术证明lrp5/6和gpcr发生直接相互作用；其次通过荧光素酶双报告基因分析检测lrp5/6受体对ligand-gpcr激活的creresponsive-luciferase表达以及配体激活gpcrs瞬间的camp产量产生的影响；敲除心肌细胞的lrp5/6检测其对gpcr受体mrna表达的调控情况。由于lrp5/6与βar受体结合位点在lrp6胞外端结构域，分别在体外体内实验中检测lrp6胞外端结构域蛋白通过抑制βar信号通路在心衰疾病中发挥的作用。

本发明首次解析了lrp6受体与gpcr受体以直接结合的方式相互作用且lrp6受体可通过直接结合gpcr受体影响其活性且其主要结合发挥抑制作用的是其胞外端结构域。目前gpcr受体参与了大量的生理及病理过程尤其是心衰的发生。因此，lrp6胞外端结构域蛋白的确具有抑制gpcr而保护心脏的作用。

本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明发现lrp5/6和gpcrs受体可通过直接结合相互作用的方式影响gpcr受体的信号通路的激活进而对心脏功能具有保护作用。

附图说明

图1显示了免疫共沉实验显示：lrp6与βar受体发生免疫共沉。

图2a为荧光素酶双报告基因分析显示，用cre（campresponseelement）作为检测指标，过表达lrp6能抑制由iso激活的βar信号通路。

图2b显示了camp动力学分析显示梯度过表达lrp6受体能剂量依赖性地抑制由iso-βar介导激活的胞内瞬时camp产量。

图3显示了心肌细胞实验显示lrp6n可明显地抑制βar激活导致的anp（a）及bnp（b）的升高。

图4显示了在由βar激活导致急性心衰的体内实验中，心脏高表达lrp6n的转基因实验组小鼠在注射了iso后相比实验组的心脏射血分数值（a）以及左室短轴缩短率（b）明显升高。

具体实施方式

实施例1

gpcrs家族成员超过800个成员。gpcr受体当识别并结合相应配体后会发生诱导构象变化，并主要通过激活gαβγ异三聚体中的gα亚基亚家族（由gαs，gαi，gαq以及gα12/13构成）从而将细胞外信号转变成细胞内信号。lrp5和lrp6受体同属于低密度脂蛋白受体家族，两者无论结构和功能都非常相似并且共同参与wnt信号通路激活。因此两个受体通常被放在一起进行研究（即lrp5/6）。为了验证lrp5/6受体对gpcr受体的功能影响，本发明首先选取了在心脏功能中发挥重要作用的具有代表性的gpcr受体：β肾上腺素受体（βar）。免疫共沉淀结果显示，lrp6受体能和βar受体存在于同一个蛋白质复合体中(图1)。

进一步farwestern结果显示，lrp6受体能和βar受体直接结合且lrp6的结合位点位于胞外片端结构域。

实施例2

体外细胞实验利用ad-293细胞共同转染lrp6的质粒以及βar受体质粒，检测lrp6对βar受体下游信号通路活性的变化的影响。荧光素酶双报告基因分析显示，以cre-luciferase（campresponseelement）作为检测指标，lrp6能抑制iso-βar激活的cre应答(图2a)。camp动力学分析显示，梯度过表达lrp6受体能剂量依赖性地抑制由iso-βar介导激活的胞内瞬时camp产量（图2b）。

为了进一步验证lrp5/6受体对gpcr受体的表达的影响，利用sirna技术体外敲除心脏心肌细胞的lrp5/6，结果显示影响了很多gpcr的mrna表达水平。

实施例3

由于lrp6与βars结合位点在lrp6的胞外端结构域，lrp6的胞外结构域由四个β-螺旋/表皮生长因子（egf）重复序列（命名为e1，e2，e3,e4结构域）以及三个ldl重复序列（命名为ldlr结构域）组成。根据uniprot数据库查询其核酸序列构建了表达分泌型人lrp6胞外结构域的质粒并纯化蛋白（lrp6n）。

整个实验过程过程为：设计包含bamhi酶切位点的引物，通过pcr方法将humanlrp6胞外片段（1-1370aa）（基因核酸序列如seqidno.1所示）cdna钓取，bamhi酶切pcr产物和线性化pcdna3.1-6myc载体，分别纯化后用t4连接酶连接，转化、涂抗性板、挑单克隆、小抽，通过pcr验证其插入方向并测序验证。

构建好的质粒，用ad-293细胞系构建hlrp6n-6myc稳定表达株。15cm细胞培养皿扩培并收集无血清上清至15l，超滤浓缩至10ml左右后，用myc-agarose于4度亲和吸附浓缩，收集myc-agarose并经温和洗脱得到粗蛋白液，最后经过超滤浓缩，通过sds-page/银染和免疫印迹方法确认得到的蛋白即为lrp6n蛋白（氨基酸序列如seqidno.2所示）。

实施例4

使用纯化的分泌型lrp6胞外端结构域重组蛋白（lrp6n）检测了其在心肌细胞中对βars信号通路的抑制作用。

实验步骤：提取原代大鼠心肌细胞，对照组加pbs，实验组加入纯化的lrp6n蛋白预处理1h后，分别用10μmiso进行刺激。iso刺激48小时后收样。trizol法提取rna，进行q-pcr检测心肥大相关指标（anp、bnp）的变化情况。结果显示lrp6n可以抑制iso刺激所产生的心肥大作用（anp和bnp的升高），并且随着lrp6n浓度的增加，呈现梯度的抑制效果（图3）。

实施例5

在体内实验中，使用lrp6n转基因鼠，他莫昔芬（30mg/kg/day）诱导一个月后，进行iso（30mg/kg/day）连续皮下注射4周后，检测反应心功能的指标ef（左室射血分数）和fs（左室短轴缩短率）。

结果显示lrp6n转基因鼠，和对照组相比，二者的基线没有差异，iso注射后，lrp6n转基因鼠的心功能优于对照组，显示了lrp6n对iso诱导的心肥的保护作用（图4）。

综上所述，分泌性lrp6胞外端结构域重组蛋白（lrp6n）可通过直接结合gpcr受体并抑制其活性，是gpcr受体家族的一个直接调节蛋白。因此lrp6n可通过对gpcr受体的直接调控治疗心衰并保护心脏功能。

序列表

<110>上海市东方医院(同济大学附属东方医院)

<120>一种用于治疗心衰保护心脏功能的药物

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