鸦胆子苦醇在制备TLR4/NF‑κB通路的抑制剂以及治疗炎症性肠病的药物中的用途的制作方法

本发明涉及药物领域，具体而言，涉及鸦胆子苦醇在制备tlr4/nf-κb通路的抑制剂以及治疗炎症性肠病的药物中的用途。

背景技术：

炎症性肠病(ibd)是一种病因不明的慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎(uc)和克罗恩病(cd)。炎症性肠病的病因不清、临床症状不特异，易与其他疾病混淆。炎症性肠病已成为中国消化系统常见疾病和慢性腹泻的主要原因，且患者多为青壮年，因此日益受到重视。

溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,uc)是一种以慢性炎症和溃疡形成为主要病理特点的结肠粘膜层的消化道疾病。该病病程冗长，病变范围广泛，病变部位多局限于黏膜层以及黏膜下层，主要为黏膜的大片充血、水肿、糜烂以及溃病形成。uc具有急性暴发型病死率高、慢性持续型癌变率高、易反复发作等特点，临床表现为：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等症状，严重影响着人们的生活质量，且目前无特效药物。

克罗恩病(crohndisease,cd)，又称局限性回肠炎、局限性肠炎、节段性肠炎和肉芽肿性肠炎，是一种原因不明的肠道炎症性疾病。克罗恩病在整个胃肠道的任何部位均可发生，但好发于末端回肠和右半结肠。以腹痛、腹泻、肠梗阻为主要症状，且有发热、营养障碍等肠外表现。病程多迁延，常有反复，本病尚无根本的治愈方法。

临床研究表明，ibd在我国近年来的发病率有显著增高趋势。目前主要采用的传统疗法的疗效不明显，甚至会导致严重的副作用，如氨基水杨酸类药物可导致严重过敏和高热，糖皮质激素类药物可导致水牛背及骨质疏松，硫唑嘌呤会导致严重肝损伤，英夫利昔可能引起大出血和感染。

鸦胆子为苦木科植物鸦胆子bruceajavanica(l.)merr.的干燥成熟果实，始载于《本草纲目拾遗》，是我国民间传统常用中药，又名老鸦胆、鸦胆、苦参子等。2010年《药典》记录，鸦胆子性味苦寒，有小毒，归大肠经、肝经。具有清热解毒、截疟、止痢、腐蚀赘疣等功效，主治痢疾、疟疾，外治用于赘疣、鸡眼。现代科学研究发现鸦胆子具有抗肿瘤作用。鸦胆子苦醇为苦木科植物鸦胆子的干燥成熟果实中分离得到的单体。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种鸦胆子苦醇在制备髓样分化因子88介导的tlr4/nf-κb通路的抑制剂中的用途，为由髓样分化因子88介导的tlr4/nf-κb通路的异常活化所致的疾病提供新的治疗手段和思路。

本发明的第二目的在于提供一种鸦胆子苦醇在制备治疗炎症性肠病的药物中的用途。鸦胆子苦醇具有改善溃疡性结肠炎进程的功效，且疗效好、作用显著。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种鸦胆子苦醇在制备髓样分化因子88介导的tlr4/nf-κb通路的抑制剂中的用途。

一种鸦胆子苦醇在制备治疗炎症性肠病的药物中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

髓样分化因子88介导的tlr4/nf-κb通路的异常活化与多种疾病的发生相关，比如炎症性肠病。发明人研究表明，鸦胆子苦醇能够抑制髓样分化因子88介导的tlr4/nf-κb通路的活化，进而下调复杂的炎症细胞因子网络，消除氧化应激反应，实现对由tlr4/nf-κb通路的异常活化所致疾病的治疗，比如对炎症性肠病的治疗。

鸦胆子苦醇可显著降低炎症性肠病患者的疾病活动指数和病理学评分，恢复结肠长度，修复组织结肠病理学变化，改善炎症性肠病的症状，可用于制备治疗炎症性肠病的药物，为炎症性肠病的治疗提供新的治疗手段和思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为鸦胆子苦醇的结构式；

图2为实验例中鸦胆子苦醇对dss诱导uc小鼠体重和dai评分的影响(n＝10)。其中，a：dai评分；b：体重变化趋势；c:小鼠结肠宏观变化；d：小鼠结肠组织长度差异，##p<0.01与对照组比较：*p<0.05和**p<0.01与dss组比较；

图3为实验例中鸦胆子苦醇对dss诱导uc小鼠结肠组织病理学分析。其中，a：he染色结肠组织；b：组织学病理损伤评分(n＝6)。##p<0.01与对照组比较：*p<0.05和**p<0.01与dss组比较；

图4为实验例中鸦胆子苦醇对dss诱导uc小鼠结肠组织中a：tnf-α.b：ifn-γ.c：il-1β.d：il-6.e：il-4.f：il-10的影响(n＝6)。##p<0.01与对照组比较：*p<0.05和**p<0.01与dss组比较；

图5为实验例中鸦胆子苦醇对dss诱导uc小鼠结肠组织中a：mpo.b：mda.c：gsh-px.d：sod的影响(n＝6)。##p<0.01与对照组比较：*p<0.05和**p<0.01与dss组比较；

图6为实验例中鸦胆子苦醇对dss诱导uc小鼠结肠组织中tlr4,myd88和nf-κbp65蛋白表达的影响(n＝3)。其中，a：结肠组织中tlr4、myd88、nf-κbp65蛋白表达图.b：tlr4的蛋白表达变化.c：myd88的蛋白表达变化.d：nf-κbp65蛋白表达变化。##p<0.01与对照组比较：*p<0.05和**p<0.01与dss组比较。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本实施方式第一方面提供鸦胆子苦醇在制备髓样分化因子88介导的tlr4/nf-κb通路的抑制剂中的用途，为由髓样分化因子88介导的tlr4/nf-κb通路的异常活化所致的疾病提供新的治疗手段和思路。

本实施方式中，鸦胆子苦醇(brusatol，br)的结构如图1所示，鸦胆子苦醇可直接购买得到，或者采用现代天然产物化学分离方法分离得到。

发明人研究表明，鸦胆子苦醇能够抑制髓样分化因子88(myd88)介导的tlr4/nf-κb通路的活化，进而下调复杂的炎症细胞因子网络，消除氧化应激反应，实现对由tlr4/nf-κb通路的异常活化所致疾病的治疗，比如对炎症性肠病的治疗。

一方面，鸦胆子苦醇通过抑制myd88介导的tlr4/nf-κb通路的活化，来调节结肠组织中toll样受体4(tlr4)、myd88和核因子-κbp65(nf-κbp65)等相关蛋白的表达。因此，鸦胆子苦醇可用于制备抑制toll样受体4、髓样分化因子88和核因子-κbp65中的至少一种的表达水平的药物。

tlr4/nf-κb通路是涉及一系列蛋白质和细胞因子在介导炎症反应和炎症性肠病中发挥关键作用的重要途径之一。tlr4为最近发现的toll样家族蛋白的成员，其识别脂多糖并介导跨膜信号转导。在与脂多糖相互作用之后，tlr4被激活，随后结合myd88作为tlr信号传导所必需的主要衔接分子。这反过来触发信号级联，其导致下游nf-κb的活化。nf-κb是免疫应答调节期间的重要转录因子。nf-κb的激活可以增加促炎细胞因子和生长因子的诱导，最终导致炎症性肠病的发展，其中p65是nf-κb家族中的主要功能亚基。发明人研究发现，用鸦胆子苦醇治疗使结肠组织中tlr4、myd88和nf-κbp65表达的显著减弱。该结果提示，对tlr4连接的nf-κb信号通路的抑制是鸦胆子苦醇对炎症性肠病的治疗中起关键作用。

另一方面，鸦胆子苦醇通过抑制myd88介导的tlr4/nf-κb通路的活化，来下调复杂的炎症细胞因子网络，进而来治疗由炎症因子的异常表达所致的疾病。

具体地，鸦胆子苦醇降低结肠组织中的促炎细胞因子的表达水平，因此，鸦胆子苦醇可用于制备抑制促炎细胞因子的表达水平的药物。其中，促炎细胞因子包括肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、γ-干扰素(ifn-γ)、白细胞介素-1β(il-1β)和白细胞介素-6(il-6)中的至少一种。

具体地，鸦胆子苦醇提高结肠组织中的抗炎细胞因子的表达水平，因此，鸦胆子苦醇可用于制备提高抗炎细胞因子的表达水平的药物。其中，抗炎细胞因子包括白细胞介素-4(il-4)和/或白细胞介素-10(il-10)。

研究表明，各种细胞因子被认为是肠道免疫系统中的关键信号，细胞因子控制uc中炎症反应的不同方面。促炎细胞因子和抗炎细胞因子之间的不平衡破坏了炎症的易感性，并进一步导致疾病的延长。tnf-α、ifn-γ、il-1β和il-6长期以来被认为是引起肠粘膜损伤和导致炎症的关键促炎介质。细胞因子如tnf-α和il-1β被释放，导致pge2的合成增强和组织损伤的恶化。因此，阻断这些细胞因子的产生可改善炎症性肠病患者的炎症。

抗炎细胞因子il-4和il-10，也称为强免疫抑制和免疫调节因子，可以有效抑制促炎细胞因子合成和抗原呈递，引起缓解炎症反应。这些细胞因子中的低表达水平促进肠粘膜的炎症反应并形成自发性严重的炎症性肠病。发明人研究发现，鸦胆子苦醇能够有效抑制促炎细胞因子的水平，并且显著促进抗炎介质的产生，从而体现出显著的抗炎活性，具有治疗炎症性肠病的功效。

再一方面，鸦胆子苦醇通过抑制myd88介导的tlr4/nf-κb通路的活化，来消除氧化应激反应，进而来治疗由氧化应激反应的异常所致的疾病。

具体地，鸦胆子苦醇能够降低结肠组织中过氧化物酶(mpo)和/或丙二醛(mda)的含量。因此，鸦胆子苦醇可用来制备降低过氧化物酶和/或丙二醛的含量的药物。

具体地，鸦胆子苦醇提高超氧化物歧化酶(sod)和/或谷胱甘肽过氧化物酶(gsg-px)的活性。因此，鸦胆子苦醇可用来制备提高超氧化物歧化酶和/或谷胱甘肽过氧化物酶的活性的药物。

氧化应激是炎症性肠病的发病和炎症过程另一个关键因素。氧化应激会损伤细胞大分子，如dna、脂质和蛋白质，这可能加剧自由基链反应，破坏肠粘膜屏障的完整性，并激活炎症介质。

mpo是一种在嗜中性粒细胞中发现的酶，触发各种炎症性疾病。同时，mda被认为是脂质过氧化的副产物，增加的mda水平引起蛋白质和核酸分子的交联和细胞毒性。sod和gsh-px是生物体中主要的抗氧化酶。sod是一种关键酶，通过将其转化为h2o2(一种更稳定的代谢物)而使超氧化物离子失活，并且h2o2通过过氧化氢酶或gsh-px进一步转化为水。gsh-px是一种抗氧化酶，有助于自由基的清除和失活，从而保护身体免受氧化应激。mda是gsh-px和sod的必需辅因子，并且通过结合gsh-px的活性位点起到显着的抗氧化作用。因此，酶活性的测量可以解释为用于评估急性肠炎症的表现。发明人研究表明，鸦胆子苦醇能够增强抗氧化酶的表达，包括sod和gsh-px，以及剂量依赖性抑制mpo和mda的活性。研究结果清楚地表明，鸦胆子苦醇可以通过调节氧化应激生物标志物，发挥其抗炎症性肠病的功效。

myd88介导的tlr4/nf-κb通路的异常活化与多种疾病的发生相关，比如炎症性肠病。鉴于此，鸦胆子苦醇为炎症性肠病的治疗提供新的治疗手段和思路。

本实施方式还提供鸦胆子苦醇在制备治疗炎症性肠病的药物中的用途。研究表明，鸦胆子苦醇可显著降低炎症性肠病患者的疾病活动指数和病理学评分，恢复结肠长度，修复组织结肠病理学变化，改善炎症性肠病的症状，可用于制备治疗炎症性肠病的药物，

实验证实，鸦胆子苦醇能显著抑制促炎细胞因子(tnf-α、ifn-γ、il-1β和il-6)的水平，升高抗炎细胞因子(il-4和il-10)的生成，从炎症角度阐述了鸦胆子苦醇治疗炎症性肠病与其能抑制结肠组织促炎因子的表达密切相关。此外，鸦胆子苦醇还能够显著降低结肠组织中mpo和mda的含量，提高结肠组织中sod和gsg-px的活性，从氧化应激的角度表明了鸦胆子苦醇治疗炎症性肠病的机理。

进一步的，炎症性肠病包括溃疡性结肠炎、克罗恩病。

溃疡性结肠炎和克罗恩病是胃肠道的慢性炎性疾病，具有复杂的病因，严重影响了患者的生活质量。由于目前合成药物的不令人满意的结果，急需一种针对该病的特效药。目前，对鸦胆子的研究主要集中在其抗肿瘤活性，对其在治疗炎症性肠病的研究却很少。鸦胆子苦醇为鸦胆子的主要活性成分之一，其水溶性差，因此发明人将鸦胆子苦醇溶于微乳中来进行相关实验。

溃疡性结肠炎和克罗恩病这两类疾病的症状相似，且都与myd88介导的tlr4/nf-κb通路的异常活化相关。因此，鸦胆子苦醇对溃疡性结肠炎和克罗恩病的疗效显著，能够抑制myd88所介导的tlr4/nf-κb通路中蛋白的活化,进而下调复杂的促炎细胞因子，消除氧化应激反应，减轻肠道炎性反应和黏膜损伤。抑制发病期间病变部位的炎症因子表达，减少炎症细胞的浸润，缓解肠道炎症反应，维持肠组织正常结构，促进肠道对营养物质的消化吸收，改善腹痛、腹泻、便血等不良症状，对溃疡性结肠炎和克罗恩病具有较好的治疗作用，特别是对乙状结肠性的溃疡性结肠炎、直肠性的溃疡性结肠炎的治疗效果更佳。

本实施方式中，发明人采用小鼠由dss诱导的结肠炎的体内模型，其广泛用作与人类uc极为类似的化学诱导的结肠炎的验证模型。在发明人的研究中，观察到dss诱导模型的临床症状，包括体重减轻、腹泻、粪便血、溃疡、粒细胞浸润和缩短的结肠。与dss组的小鼠相比，鸦胆子苦醇的治疗效果明显，能够使模型小鼠的体重恢复以及肠出血减少；同时，疾病活动指数(dai)得分显著减弱，并且结肠长度以剂量依赖性方式显著恢复。此外，鸦胆子苦醇保护结肠组织免于炎症细胞的浸润和粘膜损伤，从而导致组织病理学损伤的显著减少。

为了使该药物快速、连续并在很长一段时间里释放活性成分，本发明的医药组合物可以根据公开在那些本技术领域中的常规方法制造。本实施方式的药物的给药途径可以为口服、鼻吸入、或肠胃外给药。该药物的制剂可以是片剂、软胶囊、硬胶囊、口服液、丸剂、栓剂、粉末、颗粒、乳剂、糖浆、气雾剂、灭菌注射剂、和灭菌粉等。

以下结合实验例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述：

实施例1

取鸦胆子苦醇40g，加入乳糖480g、淀粉1160g混合均匀，用7％的淀粉浆300g作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁20g混匀，压制成每片含鸦胆子苦醇4mg的片剂10000片，每片净重0.2g。口服，每日2次，每次1片，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等。

实施例2

取鸦胆子苦醇40g，加入淀粉3594g混合均匀，用7％的淀粉浆350g作为粘合剂，湿法制粒，烘干，加入硬脂酸镁16g混匀，填充至1号胶囊制成10000粒，每粒净重0.4g，每粒胶囊内含鸦胆子苦醇4mg。口服，每日2次，每次1粒，用于治疗溃疡性乙状结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便、发热等。

实施例3

取鸦胆子苦醇30g，加入适量peg4000作为基质，适量液体石蜡为冷却剂；滴制法制成含有每丸含鸦胆子苦醇0.6mg的滴丸，每丸净重30mg。口服，每日2次，每次5粒，用于治疗用于治疗直肠性的溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等。

实施例4

称取2g鸦胆子苦醇，加入增溶剂普罗莎姆，和一定比例的乙醇，充分搅匀；然后加入适宜附加剂(如矫味剂、抑菌剂、抗氧化剂、着色剂)，溶解均匀，滤过澄清，将内容物装入安瓿或易拉盖瓶中，灭菌。规格为每瓶含鸦胆子苦醇6mg的口服液，每瓶净含量10ml。口服，每日1次，每次1瓶，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等。

实施例5

取鸦胆子苦醇2g，加入可可豆脂等辅料，配制成含鸦胆子苦醇2mg的栓剂。直肠给药，用于治疗直肠性的溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等。

实施例6

取中链脂肪酸10g，聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯40g和聚乙二醇-40020g作为油相、表面活性剂和助表面活性剂。在37℃的水浴中混合聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯和聚乙二醇-400，再加入中链脂肪酸，取鸦胆子苦醇700mg，加入一定量蒸馏水，形成了透明的鸦胆子苦醇微乳的浓度为1mg/ml，每次口服2ml，每日三次，连续使用一周，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便。

实施例7

取中链脂肪酸10g，聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯40g和聚乙二醇-40020g作为油相、表面活性剂和助表面活性剂。在37℃的水浴中混合聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯和聚乙二醇-400，再加入中链脂肪酸，取鸦胆子苦醇700mg，加入一定量蒸馏水，形成了透明的鸦胆子苦醇微乳的浓度为0.5mg/ml，每次灌肠4ml，每日1次，连续使用一周，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便。

实施例8

取鸦胆子苦醇2g，加入适量乳糖，再与防腐剂苯甲酸钠混匀，浓缩至每1ml含0.4mg鸦胆子苦醇，灭菌，冷却，分装于5ml塑料瓶中。直肠给药，用于治疗溃疡性结肠炎。症见：腹痛、持续性腹泻及血便、发热、腹胀等。

实验例

下面结合动物试验对本发明实施方式提供的鸦胆子苦醇对抗溃疡性结肠炎的疗效进行评价。

一、实验方法：

1.1实验动物

spf级balb/c小鼠，雄性，22-24g，购于广东省医学实验动物中心。实验动物分笼饲养，每2天更换一次垫料，适应性饲养7天，实验期间自由饮水和进食。饲养环境温度为22±2℃，相对湿度为60％，每天12小时光照和12小时黑夜循环。

1.2供试药品

模型组供试液(dss)：取中链脂肪酸(mct)，聚乙二醇-15羟基硬脂酸酯(hs15)和聚乙二醇-400(peg400)作为油相，表面活性剂和助表面活性剂。在37℃的水浴中混合hs15和peg400，再加入mct，在30℃温度下用磁力搅拌器以300rpm转速搅拌10min，比例为10:40:20(w/w/w)制成空白自乳化微乳制剂。

给药组供试液：称取一定量的鸦胆子苦醇(购买得到)加入空白自乳化微乳制剂中，分别配成0.1mg/ml(高剂量)、0.05mg/ml(中剂量)、0.025mg/ml(低剂量)的自微乳溶液。

阳性对照组供试液1(sasp)：精密称取1.2g柳氮磺胺吡啶(sasp)溶于60ml蒸馏水，配成浓度为20mg/ml的供试液。

阳性对照组供试液2(aza)：精密称取78mg硫唑嘌呤(aza)溶于60ml蒸馏水，配成浓度为1.3mg/ml的供试液。

上述药物配制后，4℃冰箱保存备用。

1.3动物分组及模型建立

实验开始前取各小鼠，称重，按体重随机分组：正常组(control)，模型组(dss)，鸦胆子苦醇组(br低、中、高剂量组：brl、brm、brh，对应剂量为0.25、0.5、1mg/kg)，柳氮磺胺吡啶组(sasp：200mg/kg)，硫唑嘌呤组(aza：13mg/kg)，每组20只小鼠。

分组后，标号，再称量各小鼠体重，记录并计算相应给药体积(0.1ml/10g)。蒸馏水配制3％的葡聚糖硫酸钠(dss)(30mg/ml)水溶液，供与除正常组(给予蒸馏水)之外的各组小鼠自由饮用7天以诱导急性溃疡性结肠炎模型。

模型建立的同时，各组小鼠给予相应的药物进行治疗，其中control组，dss组给予治疗药物的相应溶剂，每日一次，持续给药7天。

1.4疾病活动指数(diseaseactivityindex，dai)评分

实验过程中，每天记录小鼠体重、活动状况、粪便性状、便血情况。dai评分按以下标准进行：

体重变化评分：体重未变化，记为0分；体重下降1-5％，记为1分；5-10％，记为2分；10-20％，记为3分；体重变化大于20％，记为4分。

大便性状评分：正常，0分；粪便较软，1分；粪便湿软2分；半稀便，3分；稀便，4分。

便潜血评分：无血便，0分；便血检测阳性，2分；明显血便，4分。

评分后计算3部分评分并求得平均值。dai评分的范围为0分(健康状态)-4分(严重结肠炎)。此外，实验第8天，剖取结肠后，立即观察结肠有无水肿、粘连、溃疡、坏死等。

1.5结肠取材及结肠组织病理学观察、组织损伤评分

实验结束后用颈脱臼法全部处死，并马上剖取结肠组织，测量结肠长度并拍照比较。每组随机取6只小鼠结肠等分为2份，一份放入4％多聚甲醛中固定，用于苏木精-伊红(he)染色，另每组随机取6只小鼠结肠，放入ep管中，用于后续wb测定；剩余小鼠结肠(10只)收取用于elisa及氧化试剂盒测定。收好材后，放入-80℃冰箱保存，以使用于后继实验。

参照文献进行结肠炎症和损伤程度组织学病理评分(histologicalscore)：

a.炎症程度—0分：无炎症；1分：浅显炎症；2分：轻微溃疡；3分：明显溃疡。

b.隐窝损伤程度—0分：形态正常；1分：少量隐窝变形；2分：中等水平隐窝变形；3分：高水平隐窝变形；4分：明显的隐窝缺失。

c.炎症浸润面积—0分：无炎症细胞浸润；1分：10％视野呈低水平炎症细胞浸润；2分：10-25％视野呈中等水平炎症细胞浸润；3分：25-50％视野呈高水平炎症细胞浸润；4分：明显炎症细胞浸润。

d.肠壁炎症深度—0分：无炎症；1分：炎症限于黏膜层；2分：炎症逐步深入黏膜下层：3分：炎症深入固有层。

结肠炎症和损伤程度组织学病理评分的总分为0分(正常)—14分(严重肠炎)不等。

1.6结肠组织中炎症因子、氧化应激变化的测定

于冰上称取结肠组织，置于4mlep管中，冰上剪碎，立即加入9倍量的组织匀浆液(pbs)，匀浆1min，匀浆液于4℃、10,000×g离心15min，取上清，分装。

采用酶联免疫吸附剂测定法(elisa)来测定结肠匀浆中的炎症因子，如tnf-α、il-1β、ifn-γ、il-6、il-4、il-10等。以标准品在450nm和570nm处的吸光度的差值(od450nm-od570nm)为横坐标，对应的标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线并建立对应方程，再计算各样品的炎症因子的表达水平。

参照试剂盒说明书(比如参照bestbio公司bca蛋白分析试剂盒说明书)，准确称定组织重量，制备组织匀浆液，来测定各组结肠组织中mpo、mda、sod和gsh-px的含量。

1.7westernblotting检测相关蛋白的表达水平

1.7.1总蛋白提取

组织块用冷pbs洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)冰上彻底匀浆。将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。12000g离心10min，收集上清，即为总蛋白溶液。

1.7.2细胞浆蛋白提取

把组织尽可能切成非常细小的碎片。按照20:1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂a和b。并加入pmsf至最终浓度为1mm配制成组织匀浆液。按照每60mg组织加入200μl组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或4℃进行。匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。4℃1,500g离心5分钟。把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。

1.7.3westernblotting检测蛋白表达

(1)配制10％的sds-page凝胶；上样并电泳，上样完成先75v电压电泳，再以120电压电泳；

(2)转膜，pvdf转移目的蛋白，快转，300ma恒流转膜半小时；慢转，转膜过夜，25v恒压转膜过夜；

(3)5％的脱脂奶粉(0.5％tbst配制)封闭1h；稀释一抗,4℃孵育过夜(快转)，或者4℃孵育抗体3小时(慢转)。用tbst洗膜，每次5min，洗三次；将对应的二抗抗体(1:3000)，水平摇床低转速摇晃30min，用tbst洗膜，每次5min，洗三次。

(4)用相应的显色液显色，化学发光检测。

1.8统计学分析

各数据以均数±标准差(x±sd)表示，应用graphpadprism6软件制图，spss23.0软件进行统计学分析，各组间差异比较，采用单因素方差分析(one-wayanova)，方差齐时，组间两两多重比较采用lsd法；方差不齐时，组间两两多重比较采dunnett’st3法，以p<0.05为标准，表示有显著性差异。此外与control组比较，#p<0.05，##p<0.01；与dss组比较，*p<0.05，**p<0.01。

二、实验结果：

1.2.1鸦胆子苦醇对uc模型小鼠一般症状的影响

研究证实dss诱导的小鼠肠炎模型与人类溃疡性结肠炎(uc)的临床特征相似，如体重减轻、腹泻、便血等。发明人经研究发现，正常小鼠体重保持上升趋势；而用dss造模后，各组小鼠前3天体重均呈下降趋势，第4天后，dss组小鼠体重明显下降且呈持续下降状态；给药各组体重呈增长趋势，其中brh(1mg/kg)组小鼠体重增长明显，brl(0.25mg/kg)、brm(0.5mg/kg)组及aza、sasp组体重增长趋势相似。各组体重变化如图2-b所示。

同时，在造模期间发现，dss组小鼠便血情况严重，而给药后明显缓解血便的症状。上述观察到的现象，结合小鼠体重变化及排便症状进行疾病活动指数评分，dai评分结果如图2-a所示，dss组小鼠较control组dai评分明显要高(p<0.01)，而给药后，各给药组dai评分明显降低(均有显著性差异，p<0.01)，鸦胆子苦醇给药组dai评分具有剂量依赖关系。

此外，如图2-c和2-d所示，造模后，dss组小鼠结肠显著缩短(与control组相比，p<0.01)；而给药治疗后情况有所恢复，且给药各组小鼠结肠长度均较dss组显著增长。综上，可知鸦胆子苦醇，尤其是高剂量组，可改善dss诱导的uc模型小鼠的宏观表现，具有明显抗uc的作用。

1.2.2鸦胆子苦醇对uc模型小鼠结肠组织结构的保护作用

由结肠组织病理切片he染色结果(如图3-a所示)可见，control组小鼠结肠组织结构完整，粘膜无明显缺损，腺体排列整齐、无萎缩，粘膜固有层无明显的炎细胞浸润。dss组结肠组织显示有明显的坏死灶侵及结肠粘膜的上皮层、黏膜层、黏膜下层，部分肠组织出现坏死。大量炎性细胞浸润粘膜下层，肠壁溃疡面覆盖有坏死的组织，粘膜、腺体排列紊乱，粘膜固有层中的腺体萎缩甚至消失，取而代之的是大量的炎性细胞。其组织病理学评分(histologicalscore)，显著高于control组(p<0.01)。

药物治疗后，鸦胆子苦醇各剂量组较dss组情况有所好转，黏膜上皮脱落减少；固有层腺窝排列均相对整齐，此外黏膜层及下层炎症细胞减少；肌层及浆膜较完整，且鸦胆子苦醇修复肠组织的能力呈剂量依赖性。此外，经sasp及aza治疗后，坏死灶、溃疡与模型组比较有所减少，粘膜上皮和固有层腺体破坏有所减轻，淋巴细胞浸润粘膜层及粘膜下层与模型组有明显减少，炎症明显的减轻，炎性细胞浸润到粘膜层、粘膜下层有所减轻，溃疡面有所缩小。再者，给药各组病理学评分较dss组明显降低，且有统计学差异(p<0.01)。结合病理结构变化和病理学评分差异结果可知，鸦胆子苦醇、sasp和aza能有效改善dss所致的结肠组织损伤，以进一步缓解uc发病。

1.2.3鸦胆子苦醇对uc模型小鼠结肠组织中各细胞因子的影响

如图4(a-f)所示，dss组小鼠结肠组织中促炎因子(tnf-α、il-1β、ifn-γ、il-6)均显著升高而抗炎因子(il-4、il-10)显著降低(p<0.01，与对照组比较)。鸦胆子苦醇各剂量治疗后，促炎因子浓度显著下降而抗炎因子浓度显著上升(p<0.01与模型组比较)，且鸦胆子苦醇高剂量组(1mg/kg)效果最强。

上述结果表明dss诱导的uc模型小鼠结肠出现明显的炎症症状，而鸦胆子苦醇能有效减轻炎症症状，且效果较sasp和aza更好，表明其具有抗uc的作用。

1.2.4鸦胆子苦醇对uc模型小鼠结肠组织中氧化应激的影响

如图5所示，与对照组比较，dss组结肠组织中髓过氧化物酶(mpo)和丙二醛(mda)水平显着升高，而超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)的水平显著下降(p<0.01)。而与dss组相比，用鸦胆子苦醇给药治疗后可以明显减少结肠中的mpo和mda含量以及增强sod和gsh-px水平(p<0.01)，其治疗作用呈剂量依赖性方式。给予sasp和aza也有一定的治疗作用，但效果不及鸦胆子苦醇。

1.2.5鸦胆子苦醇对uc模型小鼠结肠组织中tlr4,myd88和nf-κbp65蛋白表达的影响

如图6所示，dss组的结肠组织中tlr4、myd88和nf-κbp65总蛋白的表达显着升高(p<0.01，与对照组比较)。然而用鸦胆子苦醇不同剂量的治疗后导致tlr4的表达以剂量依赖性方式显著减弱(p<0.01)。低剂量鸦胆子苦醇(0.25mg/kg)和sasp治疗后myd88和nf-κbp65蛋白没有明显的改变(p>0.05)，高剂量鸦胆子苦醇(1mg/kg)的导致结肠炎的小鼠中三种蛋白质的表达明显减少(p<0.01-0.05)。由此可知，鸦胆子苦醇是通过抑制myd88介导的tlr4/nf-κb信号传导通路的激活，从而减轻结肠炎症，体现出抗uc活性。

综上所述，鸦胆子苦醇具有抗炎症性肠病的活性，且其在保护肠组织免受dss诱导的炎症或损伤的过程中，其作用机制与抑制nf-κb通路的活化，进而下调复杂的促炎细胞因子网络，减轻肠道炎性反应、氧化应激和黏膜损伤有关。鸦胆子苦醇能够抑制发病期间病变部位的炎症因子表达，减少炎症细胞的浸润，缓解肠道炎症反应，维持肠组织正常结构，促进肠道对营养物质的消化吸收，改善腹痛、腹泻、便血等不良症状，对炎症性肠病具有较好的治疗作用。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。