一种西伯利亚白刺果实总黄酮的制备方法与流程

本发明涉及一种西伯利亚白刺果实总黄酮的制备方法。

背景技术：

白刺属植物是一种开发潜力巨大的经济作物，具有非常优越的生态效益和社会效益。不仅具有防风固沙和保持水土的生态作用，而且因其富含多种维生素、黄酮、有机酸、萜类、甾醇、类胡萝卜素、不饱和脂肪酸等生物活性成分，在化妆品、保健食品和医药领域具有很好开发价值。白刺属植物在全世界共有12种，中国有8种，其中，新疆有6种，分别为帕米尔白刺(n.pamirica)、西伯利亚白刺(n.sibirica)、球果白刺(n.sphaerocarpa)、盐生白刺(n.schoberil)、大果白刺(n.roborouskiikom)和唐古特白刺(n.tangutorum)，其中西伯利亚白刺广泛分布于新疆各地。在新疆各地已有相当规模的白刺属植物资源，但很多地区白刺属植物资源破坏非常严重，皮山县的开发区5000多亩白刺属植物资源进行破坏开垦。因此，对新疆现有的资源进行保护，合理开发利用，使白刺成为我区经济发展，提高人民生活水平特种经济植物。

白刺属植物是一种具有非常优越的生态效益和社会效益的野生植物。白刺根系发达，根深1m以上。沙丘地可达到2-3m，根系最长可达10m，侧根极为发达，对根系保水，抗旱和抵御高温有良好的作用。白刺分枝多，枝茎机械组织发达，坚密，柔韧，近地面匍匐丛生，形成低矮的灌丛株形，对多风环境具有良好的适应能力，萌生能力强，被沙土埋覆后能产生大量不定根，从而形成新的植株，可拦蓄和固定大量流沙。并且由于它枝叶茂密，积累了大量枯枝落叶和腐殖质，从而增加了土壤有机质含量，改善了土壤的理化结构，降低土壤含盐量，使土壤肥力增加，可达到改良土壤的目的。通过合理布局和科学种植,扩大白刺栽培面积,发挥其防风固沙、保持水土、改良盐碱、增加植被、绿化环境及维护生态平衡的重要作用。通过本项目研究，一方面，以科技手段，提高白刺的综合利用能力，将其加工成为具有高附加值的经济作物，符合优势资源开发战略和可持续发展战略，同时大量种植白刺属植物，改变生态恢复只投入没有产出的状况，使生态治理走入良性循环，以林养林，以林致富，对新疆的生态建设、富民强边、稳固边防有重要的示范意义。另一方面，以人为本，通过科技手段将白刺属植物开发成为治疗新疆少数民族的良药，促进我国医疗健康事业的发展，创建我国自有知识产权新药有重要的科学意义。

根据对各地白刺属植物化学成分研究，其主要成分是：黄酮类、鞣质、脂肪酸醇酯、醇类、有机酸类、糖类、氨基酸类、矿物元素等。近年来，大量的药理研究表明：白刺属果实提取物不仅具有降血压、降血脂、降糖、抗抑郁等药理活性，而且还具有抗过敏、抗癌、抗辐射、抗氧化和延缓衰老等保健功能。

因此，对白刺果实总黄酮纯化富集工艺进行优化，利于更好的对其进行开发和利用，并为白刺相关产品的进一步开发提供物质基础，更好的发挥其药理作用和保健功效。本发明是通过溶剂提取的方法对白刺果实总黄酮进行提取，再通过大孔树脂对其进行纯化，该方法简单、可行，便于工业放大。

技术实现要素：

本发明目的在于，提供一种西伯利亚白刺总黄酮的制备方法，该方法是将西伯利亚白刺果实，通过乙醇-水体系提取，过滤，浓缩滤液，减压回收乙醇，再将浓缩液用大孔树脂进行纯化，真空干燥，用紫外-分光光度法法测定总黄酮含量,得到西伯利亚白刺果实总黄酮含量65％-75％的产品。该产品可以用于保肝、降血压、降血脂、降糖、抗衰老、抗抑郁等功能的保健食品、药品、化妆品和固体添加原料。

本发明所述的一种西伯利亚白刺果实总黄酮的制备方法，按下列步骤进行：

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为40-80℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量65-75％。

步骤b中的大孔树脂型号为hpd100、hpd300、hpd450、hpd-600、hpd750、d101、d141、nka-9、ab-8、dm131、ads-17或ads-7。

本发明所述的一种西伯利亚白刺果实总黄酮的制备方法，该方法通过对不同型号的大孔树脂对纯化物总黄酮含量的影响；大孔树脂不同上样液浓度对总黄酮吸附率的影响；大孔树脂不同吸附速度对纯化物总黄酮含量的影响；大孔树脂最大上样量，大孔树脂解吸剂对纯化物总黄酮含量的影响；60％乙醇的动态解吸；树脂与柱子径高比例；

大孔树脂解吸测试如下：

12种大孔树脂对西伯利亚白刺果实总黄酮的静态吸附与解吸试验：

准确称取预处理过的干燥大孔树脂各2.0g于磨口锥形瓶中，加入白刺果实提取液20ml，密封后置于振荡培养箱(28℃，100次/分钟)中振荡，充分吸附后，过滤。分别精密量取各树脂吸附后的溶液1ml于50ml容量瓶中，显色，510nm处测定吸光度，计算各滤液中总黄酮的浓度，按下面的公式计算总多酚吸附量:

吸附量ca(mg/g树脂)＝[(c0-c1)×v1]/w

吸附率(％)＝[(c0-c1)/c0]×100

(ca:吸附量(mg/g树脂)；c0:初始样品液质量浓度(mg/ml)；c1:吸附后上清液中样品液质量浓度(mg/ml)；v1:加入上柱样品液体积(ml)；w:大孔吸附树脂质量(g)。

将以上过滤后得到的12种大孔树脂分别放入三角瓶中，加入20ml，60％的乙醇溶液，密封后摇匀，在室温放置24h，时时振摇，使白刺果实总黄酮解吸附，过滤，测定滤液中总黄酮的含量，计算总黄酮的解吸率。精密量取各树脂解吸附后的溶液1ml,于50ml容量瓶中,显色,测定吸光度,计算各种树脂对白刺果实总黄酮解吸率。

解吸率t(％)＝[(c2×v)/(w×ca)]×100

(ca:吸附量(mg/g树脂)；c2:解吸液中多酚液质量浓度(mg/ml)；v:所加乙醇的体积(ml)；w:大孔吸附树脂质量(g)。

结果显示(表1)，可以看出12种大孔树脂中，ab-8、nka-9、ads-7、hpd600型号树脂对白刺果实黄酮具有较强的吸附性能，其中ab-8的解吸能力最强，解吸率达到了85.0％，比其他型号的大孔树脂强，是一种较为理想的吸附树脂。

表1为12种不同型号大孔树脂对纯化物总黄酮吸附量和解吸量的影响

本发明所述的一种西伯利亚白刺果实总黄酮的制备方法，该方法具有以下优点：

在整个实验方法中，以食用乙醇和水作为溶剂，价格低廉、无毒，乙醇可回收再利用；采用的大孔树脂为目前国内医药行业常用的大孔树脂，安全性较高，价格较低，且可重复利用。通过本发明所述方法获得的西伯利亚白刺果实总黄酮有效部位用紫外分光光度法测定总黄酮含量，含量可达到65-75％。

附图说明

图1为本发明使用ab-8大孔树脂不同浓度上样液对纯化物总黄酮含量的影响图；

图2为本发明使用ab-8大孔树脂不同吸附速度对纯化物总黄酮含量的影响图；

图3为本发明使用ab-8大孔树脂吸附泄露曲线图；

图4为本发明使用ab-8大孔树脂不同浓度解吸剂对纯化物总黄酮含量的影响图；

图5为本发明使用ab-8大孔树脂60％乙醇的动态解吸曲线图；

图6为本发明使用ab-8大孔树脂柱子径高比例对纯化物总黄酮吸附量的影响。

具体实施方式：

本发明将结合具体实施例作进一步说明，但不限于本实施例范围；

实施例1

a.取阴干后的西伯利亚白刺果实，用质量体积比10倍量的70％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为70℃，提取2次，时间2h，收集提取液；

b.将步骤a提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至质量浓度50mg/ml，将浓缩液用型号为ab-8大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为1bv/h，然后水洗，水洗脱体积为4bv，水洗流速为3bv/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为60％，乙醇洗脱量为4bv，乙醇洗脱速度为2bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到总黄酮含量72％产品。

实施例2

a.取阴干后的西伯利亚白刺果实，用质量体积比12倍量的80％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为60℃，提取2次，时间3h，收集提取液；

b.将步骤a提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至质量浓度50mg/ml，将浓缩液用型号为ab-8大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为2bv/h，然后水洗，水洗脱体积为4bv，水洗流速为3bv/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为60％，乙醇洗脱量为3bv，乙醇洗脱速度为2bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到总黄酮含量68％产品。

实施例3

a.取阴干后的西伯利亚白刺果实，用质量体积比10倍量的60％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为70℃，提取3次，时间2h，收集提取液；

b.将步骤a提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至质量浓度50mg/ml，将浓缩液用型号为ab-8大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为1bv/h，然后水洗，水洗脱体积为3bv，水洗流速为2bv/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为50％，乙醇洗脱量为4bv，乙醇洗脱速度为3bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到总黄酮含量70％产品。

实施例4

a.取阴干后的西伯利亚白刺果实，用质量体积比15倍量的50％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为50℃，提取2次，时间3h，收集提取液；

b.将步骤a提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至质量浓度50mg/ml，将浓缩液用型号为ab-8大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为1bv/h，然后水洗，水洗脱体积为3bv，水洗流速为4bv/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为60％，乙醇洗脱量为3bv，乙醇洗脱速度为3bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到罗布麻多酚66％产品。

实施例5

a.取阴干后的西伯利亚白刺果实，用质量体积比10倍量的70％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为70℃，提取2次，时间2h，收集提取液；

b.将步骤a提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至质量浓度50mg/ml，将浓缩液用型号为ab-8大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为1bv/h，然后水洗，水洗脱体积为4bv，水洗流速为3bv/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为60％，乙醇洗脱量为4bv，乙醇洗脱速度为2bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到总黄酮含量75％产品。

实施例6

a.取阴干后的西伯利亚白刺果实，用质量体积比10倍量的60％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为40℃，提取2次，时间2h，收集提取液；

b.将步骤a提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至质量浓度50mg/ml，将浓缩液用大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为1bv/h，然后水洗，水洗脱体积为4bv，水洗流速为4bv/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为70％，乙醇洗脱量为3bv，乙醇洗脱速度为2bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到总黄酮67％产品。

实施例7

a.取阴干后的西伯利亚白刺果实，用质量体积比10倍量的70％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为60℃，提取2次，时间2h，收集提取液；

b.将步骤a提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至质量浓度50mg/ml，将浓缩液用型号为ab-8大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为2bv/h，然后水洗，水洗脱体积为3bv，水洗流速为3bv/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为60％，乙醇洗脱量为3bv，乙醇洗脱速度为2bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到总黄酮含量73％产品。

实施例8

a.取阴干后的西伯利亚白刺果实，用质量体积比15倍量的50％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为60℃，提取2次，时间3h，收集提取液；

b.将步骤a提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至质量浓度50mg/ml，将浓缩液用型号为hpd750大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为2bv/h，然后水洗，水洗脱体积为4bv，水洗流速为3bv/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为60％，乙醇洗脱量为4bv，乙醇洗脱速度为2bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到总黄酮含量70％产品。

实施例9

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为40℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用型号为hpd100大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量60％。

实施例10

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为50℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用型号为hpd300大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量70％。

实施例11

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为60℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用型号为hpd450大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量63％。

实施例12

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为70℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用型号为hpd-600大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量70％。

实施例13

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为80℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用型号为ads-7大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量72％。

实施例14

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为55℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用型号为d101大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量71％。

实施例15

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为75℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用型号为d141大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量65％。

实施例16

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为80℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用型号为nka-9大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量71％。

实施例17

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为45℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用型号为dm131大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量70％。

实施例18

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为65℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用型号为ads-17大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量66％。

实施例19

a.将原料西伯利亚白刺果实，用质量体积比1:10倍量的浓度为70％乙醇水浴加热回流提取，水浴温度为65℃，提取2次，每次提取时间2h，收集提取液，减压回收乙醇，得到提取液；

b.将步骤a提取液用真空旋转蒸发仪在温度45℃浓缩至质量浓度为110g/ml黄酮含量6mg/ml的药液，再将浓缩液用型号为ads-7大孔树脂进行纯化，用水洗脱，体积为3bv，水洗流速为2bv/h，再用浓度为60％的乙醇洗脱，乙醇洗脱量为2bv，乙醇洗脱速度为1－4bv/h；

c.收集步骤b的乙醇洗脱液，真空干燥，即可得到西伯利亚白刺总黄酮含量71％。

实施例20

用紫外分光光度法测定所得总黄酮的含量

1.对照品溶液的制备：

精密称取芦丁对照品35mg，置50ml容量瓶中，加乙醇适量，使之溶解(超声处理)，再用乙醇定容至刻度，摇匀即0.7mg/ml；

2.标准曲线的绘制：

精密量取对照品溶液1ml，2ml，3ml，4ml，5ml分别置25ml的容量瓶中，各加乙醇5ml,加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠溶液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，用紫外分光光度法，在510nm波长测定吸光度，以吸光度(a)为纵坐标，浓度(c,mg/ml)为横坐标，绘制标准曲；

3.供试品溶液的制备：

取阴干后的西伯利亚白刺果实3份，分别用质量体积比10倍量的70％乙醇采用水浴加热回流，水浴温度为70℃，提取2次，时间2h，收集提取液；

将3份提取液减压浓缩，回收乙醇，浓缩至质量浓度50mg/ml，分别将浓缩液用型号为ab-8大孔树脂进行纯化，上样液吸附速率为1bv/h，然后水洗，水洗脱体积为3bv，水洗流速为3bv/h，洗脱剂为乙醇，洗脱用乙醇浓度为60％，乙醇洗脱量为4bv，乙醇洗脱速度为2bv/h；分别收集3份乙醇洗脱液；

分别精密吸取3份供试品提取液8ml，置25ml量瓶中，按标准曲线的绘制方法，自加乙醇5ml开始，依法测定吸光度，精密量取供试液2ml，置25ml容量瓶，加水至刻度，作为空白试验，计算出总黄酮的含量。(表2)

表2为黄酮含量验证实验结果

从表中可以看出：通过本发明所述方法获得的西伯利亚白刺果实总黄酮有效部位用紫外分光光度法测定总黄酮含量，含量可达到65-75％。