本发明属于医药技术领域，涉及一种从长春花、茎枝或全草中提取生物碱有效部位的方法及用途，具体涉及从长春花、茎枝或全草中提取生物碱有效部位的方法及其有效部位在制备治疗或预防老年痴呆等神经退化性疾病和高血压等心脑血管疾病的药物中的用途。
背景技术：
随着社会人口的老龄化，老年痴呆症与脑血管疾病、恶性肿瘤已被列为三大老年人疾病。老年痴呆(alzheimerdisease，简称ad)是一种病因不明的原发性脑部退行性疾病，是老年人的多发病和常见病。1907年aloisalzheimer首先描述此病，目前病因尚不明确，临床以进行性记忆和后天获得的知识丧失和生活能力最终丧失为特征。ad发病率约占痴呆病人的40％-60％，病理特征主要为皮质神经元纤维缠结(neurofibrillarytangles,nfts)和神经炎性斑(senileplaques,sp)的出现及大量神经元的死亡。据统计，当今世界约有5000多万老年人患有不同程度的痴呆。ad在确诊后平均生存期为7-8年。西方国家这类病人每年需花费约1.5万美元，我国虽没有这方面的统计，估计每年总花费约200亿人民币。由此可见，ad已是家庭和社会的沉重负担，不仅是一个重大的医学问题，而且是一个严重的社会问题。近十年ad的研究取得了很大进展，国外分析家预测在未来十年内ad患者将会增加到20％左右，ad药品市场的增长速度将有较大幅度的上升。
高血压指体循环动脉血压增高，是常见的临床综合症，亦可说其是以收缩和舒张压增高，常伴有心脑、肾等器官功能或器质改变为特征的全身性疾病，该病可由多种发病因素和复杂的发病机制所致，中枢神经系统功能失调，体液内分泌遗传，肾脑血管压力感受器的功能异常，以及细胞膜离子转运异常等均可导致高血压病。高血压病是常见病，又是导致人类死亡主要疾病如冠心病、脑血管疾病等的最重要危险因素，心、脑血管疾病的发病率和病死率均与患者血压水平密切相关，因此，世界各国均高度重视对高血压病的防治与研究。据全国卫生部门统计资料显示，我国现有高血压病患者已超过1亿人，每年新增300万人以上；现有脑卒中患者500余万，每年新发病150万人，死亡20万人。而且全世界范围的高血压病发病率仍呈上升趋势，我国已成为世界上高血压危害最严重的国家。
因此，研究开发治疗或预防老年痴呆等神经退化性疾病和高血压等心脑血管疾病的药物具有巨大的市场前景。
长春花始载于清代《植物名实图考》，味微苦，性凉归肝、肾二经，有清凉血降压，镇静安神的功效。2010年版《中国药典》规定了中药长春花为夹竹桃科植物长春花catharanthusroseus(l.)g.don的全草。文献报道，长春花生物碱成份具有镇静、降压、抗惊厥、抗癫痫、保护神经细胞、抗脑缺血/再灌注损伤等作用。临床上，有长春花制备的长春花总碱片可用于治疗高血压；长春花与天麻配伍可用于治疗血管性痴呆，能明显改善患者的认知功能和行为能力，还可以治疗肝阳上亢型高血压、高血压性脑出血等症。
但目前未见以长春花、茎枝或全草提取的总生物碱含量大于50％的生物碱有效部位为主要原料治疗或预防老年痴呆等神经退化性疾病和高血压等心脑血管疾病的口服制剂上市。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种从长春花、茎枝或全草中提取生物碱有效部位的方法及用途，在长春花、茎枝或全草中加入含水醇溶液冷浸、渗漉或热回流提取，滤过，减压回收至无醇味，浓缩提取液中加入水或醇溶液，滤过，滤液经填充有吸附材料的吸附柱，洗脱前选用水洗吸附柱至流出液为无色，用含有20～75％醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得稠膏，干燥后得生物碱有效部位。本方法不用有毒的有机溶剂，不污染环境，耗时少，效率高，提取工艺简单，成本低廉，可进行产业化生产，并达到了环保的要求。提取的生物碱有效部位可用作治疗或预防老年痴呆等神经退化性疾病和高血压等心脑血管疾病的药物。
为解决以上问题，本发明的具体技术方案如下：一种从长春花叶、茎枝或全草中提取生物碱有效部位的方法，其特征是，其提取步骤如下：
a.在长春花叶、茎枝或全草中加入醇浓度为40～95％含水醇溶液，经冷浸、渗入或热回流提取，含水醇溶液用量为长春花叶、茎枝或全草重量的6～30倍，滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，得到长春花叶、茎枝或全草浓缩提取液；
b.在长春花叶、茎枝或全草浓缩提取液中加入长春花叶、茎枝或全草重量4～10倍的水或醇溶液，溶液中醇浓度为10～60％，滤过，得滤液；
c.滤液经填充有吸附材料的吸附柱；
d.洗脱前，选用体积为吸附材料4～8倍的水或20～40％的醇淋洗附柱至流出液为无色；
e.用含40～90％的醇溶液洗脱，洗脱液用量为吸附材料的4～10倍，收集洗脱液；
f.减压回收溶剂，得稠膏，稠膏经干燥后得长春花叶、茎枝或全草生物碱有效部位。
所述的醇溶液中所用的醇为乙醇或甲醇。
所述步骤c中的吸附材料为大孔吸附树脂或离子交换树脂中的任一种或两种并用，大孔树脂的型号有ab-8、sp-70、d101、dm-130、s-8、d3520、d4020或hp-20。
所述的步骤f中生物碱有效部位中总生物碱含量为50～90％，其中长春花碱、异长春花碱、去氢长春花碱和异去氢长春花碱的含量之和大于40％。
5、根据权利要求1所述的从长春花叶、茎枝或全草中提取生物碱有效部位的方法，其特征是：所述的步骤f中的提取生物碱有效部位可以与药学上可接受的载体或赋形剂结合制成片剂、胶囊、滴丸或颗粒剂。
所述的生物碱用途于预防老年痴呆等神经退化性疾病和高血压等心脑血管疾病。
本发明带来的有益效果为：在长春花、茎枝或全草中加入含水醇溶液冷浸、渗漉或热回流提取，滤过，减压回收至无醇味，浓缩提取液中加入水或醇溶液，滤过，滤液经填充有吸附材料的吸附柱，洗脱前选用水洗吸附柱至流出液为无色，用含有20～75％醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得稠膏，干燥后得生物碱有效部位。本方法不用有毒的有机溶剂，不污染环境，耗时少，效率高，提取工艺简单，成本低廉，可进行产业化生产，并达到了环保的要求。提取的生物碱有效部位可用作治疗或预防老年痴呆等神经退化性疾病和高血压等心脑血管疾病的药物。
具体实施方式
一种从长春花叶、茎枝或全草中提取生物碱有效部位的方法，其提取步骤如下：
a.在长春花叶、茎枝或全草中加入醇浓度为40～95％含水醇溶液，经冷浸、渗入或热回流提取，含水醇溶液用量为长春花叶、茎枝或全草重量的6～30倍，滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，得到长春花叶、茎枝或全草浓缩提取液；
b.在长春花叶、茎枝或全草浓缩提取液中加入长春花叶、茎枝或全草重量4～10倍的水或醇溶液，溶液中醇浓度为10～60％，滤过，得滤液；
c.滤液经填充有吸附材料的吸附柱；
d.洗脱前，选用体积为吸附材料4～8倍的水或20～40％的醇淋洗附柱至流出液为无色；
e.用含40～90％的醇溶液洗脱，洗脱液用量为吸附材料的4～10倍，收集洗脱液；
f.减压回收溶剂，得稠膏，稠膏经干燥后得长春花叶、茎枝或全草生物碱有效部位。
所述的醇溶液中所用的醇为乙醇或甲醇。
所述步骤c中的吸附材料为大孔吸附树脂或离子交换树脂中的任一种或两种并用，大孔树脂的型号有ab-8、sp-70、d101、dm-130、s-8、d3520、d4020或hp-20。
所述的步骤f中生物碱有效部位中总生物碱含量为50～90％，其中长春花碱、异长春花碱、去氢长春花碱和异去氢长春花碱的含量之和大于40％。
所述的步骤f中的提取生物碱有效部位可以与药学上可接受的载体或赋形剂结合制成片剂、胶囊、滴丸或颗粒剂。
所述的生物碱用途于预防老年痴呆等神经退化性疾病和高血压等心脑血管疾病。
发明所制备的生物碱有效部位的药效学及初步毒理学研究：
1、长春花生物碱有效部位和主要生物碱单体化合物的抗小胶质细胞活化活性
小胶质细胞介导的慢性炎症反应是几种主要神经退行性疾病如阿尔茨海默病(alzheimer’sdisease,ad)、帕金森病(parkinson'sdisease,pd)等发生、发展过程中的重要环节，各种原因激活小胶质细胞所释放的前炎症细胞因子和自由基等启动或加重了神经元的损伤，而神经元的损伤反过来又会进一步激活小胶质细胞，形成一个恶性循环的病理过程。因而，抑制小胶质细胞激活可有效阻断或减轻这一恶性循环造成的后果。本实验通过体外脂多糖(lps)激活小胶质细胞异常活化模型，以激活小胶质细胞释放no为指标，评价长春花生物碱有效部位和主要生物碱成份通过抑制小胶质细胞异常激活发挥的保护神经系统作用。
a、原代小胶质细胞的培养
无菌条件下取新生大鼠(生后2d以内)大脑皮层，置于d-hanks液中，剥除脑膜及血管。0.25％胰酶消化10～15min，以含10％胎牛血清的imdm培养基终止消化，巴氏吸管吹打，200目筛网机械过滤，制备混合细胞悬液。计数，将细胞密度调整为(3～5)×106cells/ml，按每瓶5～10ml种植于75cm2带螺口帽细胞培养瓶中，培养基成份：imdm培养液，5％胎牛血清，补加抗菌素(青霉素100μg/ml、链霉素100μg/ml)。松盖静置培养于co2培养箱(37℃,5％co2,95％空气)中，48h后用等量培养基换液一次以去除死亡细胞碎片。以后间隔3～4d换液一次，培养至11～14d，收集细胞。收获前一日换无血清培养液，次日拧紧瓶口，置37℃恒温摇床摇振约2小时，250rev/min，收集上清，此时上清细胞密度一般不低于5×105cells/ml。将收集得到的细胞悬液转移重新种植于75ml细胞培养瓶内，co2培养箱静置培养约4小时后，室温下轻摇培养瓶以去除贴壁未牢的成分(主要为少突胶质细胞和星形胶质细胞)，吸出后加入新鲜培养液。
b、griess法检测长春花生物碱有效部位和主要生物碱单体化合物对lps激活小胶质细胞的抑制作用
取对数生长期的大鼠原代小胶质细胞，用含5％胎牛血清的新鲜imdm培养基将细胞密度调至5×105cells/ml，接种于96孔扳内，100μl/well，于37℃，5％co2的培养箱内培养。细胞贴壁培养24h后换成无血清的新鲜培养液，同时进行加药处理，与lps共同作用。每个浓度设三个平行孔。同时设空白对照和阳性对照(白藜芦醇)。各给药组及阳性对照组中lps终浓度为1μg/ml。细胞加药后继续培养48h后，收集上清液，griess比色法检测上清液中no2-含量。将lps刺激组的no释放量设定为100％，其余各组的no释放量表示为相对与lps刺激组的百分含量。结果见表1。
结果：长春花生物碱有效部位对lps诱导小胶质细胞no释放半数有效剂量(ic50)为6.3μg/ml，生物碱单体化合物的ic50值范围在13.7-19.0μm，均表现出显著的抑制作用。但长春花或茎枝粗提物均未能显示明显的抑制作用。因此，采用大孔树脂纯化而得的生物碱有效部位富集了长春花生物碱类成分，提高了药理活性，并减少给药剂量，具有药用价值。
表1长春花生物碱有效部位和主要生物碱单体化合物对lps诱导小胶质细胞no释放的抑制作用
2、长春花生物碱有效部位的急性毒性试验
小鼠50只，雌雄各半，体重为18－20g。按体重和性别随机分为5组，每组10只。禁食不禁水16小时后，每组动物分别灌胃给予不同剂量的长春花生物碱有效部位，起始剂量为2500mg/kg，给药容量为0.2ml/kg，相邻组间剂量比为1：0.75，然后连续观察7天，记录小鼠急性毒性反应及死亡数，解剖死亡小鼠及存活小鼠，观察各主要脏器组织有无异常。使用综合计算法计算长春花生物碱有效部位灌胃给药的ld50值。结果见表2。
结果表明：小鼠灌胃分别给予长春花生物碱有效部位5分钟后，剂量>1054mg/kg的部分实验动物活动范围减少，呼吸急促、颤抖，最后挣扎而死，死亡高峰时间为60分钟。但死亡小鼠及存活小鼠，各主要脏器组织均无异常。小鼠灌胃给予长春花生物碱有效部位的ld50值为1406.4±198.9mg/kg。由于长春花总碱抗高血压活性和抗脑血管痴呆活性的ed50值分别为20.0mg/kg和15.0mg/kg，因此，本长春花生物碱有效部位具有较高的治疗指数，临床用药安全范围较大。
表2小鼠灌胃给予长春花生物碱有效部位的ld50值
3、长春花生物碱单体化合物的细胞毒性快速筛选试验
采用中性红吸收法(neutralreduptakeassay，nru)：中国仓鼠肺细胞(chl)和中国仓鼠卵巢细胞(cho)用含10％牛血清的mem培养基在5％co2、37℃饱和湿度培养箱内常规培养。24h后细胞生长接近单层，向chl和cho细胞中分别添加供试样品，继续培养24h。培养结束前2h，每孔加入中性红(nr)溶液(250μg/ml)50μl。培养结束后，用pbs洗涤细胞，每孔中加入抽提液(1％醋酸-50％乙醇水溶液)100μl，室温放置20min，使细胞中的nr全部溶出。充分振荡后使用酶标仪在波长540nm下测定吸光度。将空白组的细胞存活率设定为100％，其余各组的细胞存活率表示为相对与空白组的百分含量。结果见表3。
表3长春花生物碱类单体化合物对chl和cho细胞的毒性作用
结果可见，长春花生物碱有效部位中各组成成分的生物碱单体化合物对cho细胞未见明显毒性，ic50>300μm；但长春花碱，异长春花碱，去氢长春花碱，异去氢长春花碱对chl细胞的存活率影响较大，ic50值分别为273、10.9、180、70.9μm，喜果苷对chl细胞未见明显毒性，ic50>300μm。结论：长春花生物碱有效部位中各组成成分在各剂量下对cho细胞未见明显毒性，仅在较高剂量下对chl细胞表现出一定的细胞毒性，属于低毒物质。
4、morris水迷宫实验
a、动物及模型：12-24个月龄健康雌性sd大鼠75只,体重340±37g，以morris水迷宫实验筛选学习记忆良好的大鼠70只,随机分为空白对照组、手术组和假手术组。
b、模型制作方法：永久性结扎双侧颈总动脉法。三组大鼠同条件下饲养，在术后1个月进行morris水迷宫试验，观察指标为平均逃避潜伏期，求得空白对照组平均值与标准差，以空白对照组为标准，大于此值的判为学习记忆能力障碍。从手术组中筛选出学习记忆能力障碍的大鼠,再次随机分为模型组、给药组和空白对照组。
c、用药方法：给药组灌胃给予长春花生物碱有效部位15mg/kg，每日1次，1周后给药剂量改为5mg/kg。用药1.5个月和2.5个月(即术后2.5和3.5个月)后，分别进行morris水迷宫试验以检测学习记忆能力。空白对照组用生理盐水替代长春花生物碱有效部位，其余与给药组方法一致。
d、morris水迷宫：水迷宫的水池直径100cm，深50cm，水深30cm，水温26±2℃，水面覆一层泡沫塑料屑，池壁上四个等距离点分水池为四个象限，任选一象限在其中央放置平台。平台无色透明，直径6cm，高28cm，平台没于水面下2cm，水池周围参照物保持不变。
e、定位航行试验：实验历时5日，每日4次。操作者将大鼠面向池壁从不同象限放人水中，记录大鼠找到平台的时间(逃避潜伏期)，如果120s内找不到平台，则由操作者帮助其上平台。大鼠站立于平台10s后，将大鼠从平台上拿下来休息60s，再按序由下一象限人水进行试验。
f、观察指标：逃避潜伏期。
g、数据统计：用spss.10.0统计软件对平均逃避潜伏期进行单因素方差分析(one-wayanova)及重复测量(repeatedmeasures)数据的方差分析,dunnett-t检验和lsd检验。结果见表4。
h、结果：术后3.5个月(即用药2.5个月)，给药组大鼠平均逃避潜伏期较模型组和空白对照组大鼠明显缩短。结果表明，长春花生物碱有效部位可改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力。
表4各组大鼠在不同时段平均逃避潜伏期的比较(s)
5、长春花生物碱有效部位对大鼠实验性高血压的影响
a、测大鼠正常血压：取健康体重200g左右的大鼠，随机分组，用大鼠测压仪测正常血压值，连续测量3天，并记录。
b、复制高血压模型：连续测定血压3天后，每日皮下注射丙酸睾丸素4mg，共14天。当大鼠血压明显升高至1.3kpa(10mmhg)，可以进行实验治疗。
表5长春花生物碱有效部位对大鼠实验性高血压的影响
c、实验治疗：每天灌胃给与大鼠长春花生物碱有效部位20mg/kg，连续16天，然后每4天测1次血压；另两组分别给利血平和蒸馏水作对照。结果见表5。
e、结果表明：长春花生物碱有效部位具有明显降压作用。
6、长春花生物碱有效部位对血小板聚集的影响
动物sd大鼠，雄性，体重250～350g，分为4组。分别静脉注射给予不同剂量的长春花生物碱有效部位、阿司匹林(asa)或对照液，20min后取血，加3.8％枸橼酸钠(9：l)抗凝，离心，分离富血小板血浆(prp)及贫血小板血浆(ppp)，调节prp中血小板数为4×108/ml，按比浊法，用pam-2型ppp自动平衡血小板聚集仪(上海医科大学产品)测定血小板聚集反应。诱导剂为花生四烯酸(aa)200μmol/l，腺苷二磷酸钠盐(adp)4.0μmol/l及胶原40μg/ml。
结果：大鼠静脉注射给予长春花生物碱有效部位10、20mg/kg或阿司匹林30mg/kg后，其血小板聚集率较对照组大鼠明显下降，见表6。结果表明，长春花生物碱有效部位有可能成为一种临床有效的抗血小板聚集药物。
表6长春花生物碱有效部位对aa、adp或胶原诱导的血小板聚集的抑制作用
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
随着世界老龄化社会的到来，老年性记忆力减退、老年性痴呆等老年性记忆功能障碍的防治显得日益重要。国内外的大量研究资料表明每十个老年人就有一个显现不同程度的痴呆症状，严重影响着人们的健康和生活质量。此外，高血压病也是导致人类死亡的主要疾病，如冠心病、脑血管病的最主要致病因素，是危害人类健康的常见病和多发病。因此，研究开发治疗或预防老年痴呆等神经退化性疾病和抗高血压等心脑血管疾病的新药具有巨大的市场前景。
本有效部位的制备不用有毒的有机溶剂，不污染环境，是在常规含水溶媒提取方法的基础上，采用了吸附材料的吸附分离技术，耗时少，效率高，提取工艺简单，成本低廉，可进行产业化生产，并达到了环保的要求。而且，乙醇可以回收重复使用，大孔树脂和离子交换树脂也可以处理后再用途，降低了生产成本，便于推广，因此，在国内外市场上有强劲的竞争力。长春花、茎枝或全草取自天然资源，长春花、茎枝或全草中提取的生物碱有效部位毒副作用较小，安全可靠，具有多种生物活性，其强烈的神经细胞保护作用和降压作用，对治疗或预防老年痴呆等神经退化性疾病和高血压等心脑血管疾病十分有益。长春花、茎枝或全草在我国自然资源十分丰富，从长春花、茎枝或全草中提取生物碱类有效成分用于新药研制，是有效利用自然资源的一项有力措施。本发明通过药效试验证明长春花、茎枝或全草中提取的生物碱有效部位对神经细胞有保护和治疗作用和抗高血压作用，为临床推广用途提供了理论依据。
具体实施方式
实施例1
加入长春花茎枝粗粉重量8倍的75％乙醇溶液渗漉提取，滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，得到长春花茎枝浓缩提取液。将浓缩提取液用水稀释至长春花茎枝量6倍的药液，滤过，得滤液。将滤液流经填装有dm-130大孔树脂的吸附柱，用6倍量的80％乙醇洗脱，减压回收溶剂，得稠膏，稠膏经干燥得含总生物碱为76.0％(hplc法测)的干膏，其中长春花碱、异长春花碱、去氢长春花碱和异去氢长春花碱的含量之和为40.1％(hplc法测)。干膏采用超微粉碎工艺粉碎，取1份干膏粉与0.1份微晶纤维素，用70％乙醇溶液制粒，干燥，整粒，加入1％硬脂酸镁，混匀，灌装胶囊，每粒15mg。
实施例2
加入长春花粗粉重量10倍的75％乙醇溶液渗漉提取，滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，得到长春花浓缩提取液。将浓缩提取液用10％乙醇稀释至长春花8倍的药液，滤过，得滤液。将滤液流经填装有d101大孔树脂的吸附柱，先用6倍量的30％乙醇淋洗至流出液至无色，再用6倍量的75％乙醇洗脱，减压回收溶剂，得稠膏，稠膏经干燥得含总生物碱为70.3％(hplc法测)的干膏，其中长春花碱、异长春花碱、去氢长春花碱和异去氢长春花碱的含量之和为42.4％(hplc法测)。将1份粉碎后的干膏粉与0.1份微晶纤维素混合后用80％乙醇溶液制粒，干燥，整粒，加入1％硬脂酸镁，混匀，压片，包薄膜衣，得薄膜衣片，每片15mg。
实施例3
加入长春花粗粉重量12倍的75％乙醇溶液冷浸提取12h，滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，得到长春花浓缩提取液。将浓缩提取液用20％乙醇稀释至长春花量6倍的药液，滤过，得滤液。将滤液流经填装有ab-8大孔树脂的吸附柱，先用6倍量的30％乙醇淋洗至流出液至无色，再用6倍量55％乙醇洗脱，收集55％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得稠膏，稠膏经干燥得含总生物碱为76.6％(hplc法测)的干膏，其中长春花碱、异长春花碱、去氢长春花碱和异去氢长春花碱的含量之和为41.5％(hplc法测)。干膏粉碎后置己熔化的peg中，待药物完全分散在液态的载体中后，置滴丸设备中，滴入液体石蜡中，滴制成小丸。
实施例4
加入长春花全草粗粉重量8倍的75％乙醇溶液热回流提取2次，每次回流时间1.5小时，滤过，合并滤液，减压回收至无醇味，得到长春花全草浓缩提取液。将浓缩提取液用10％乙醇稀释至长春花全草量6倍的药液，滤过，得滤液。将滤液流经填装有hp-20的大孔树脂吸附柱，先用4倍量的20％乙醇淋洗至流出液至无色，再用6倍量的75％乙醇洗脱，减压回收溶剂，得稠膏，稠膏经干燥得含总生物碱为69.8％(hplc法测)的干膏，其中长春花碱、异长春花碱、去氢长春花碱和异去氢长春花碱的含量之和为40.3％(hplc法测)。干膏粉碎后分散到辛基十二烷醇中，并加工成软胶囊，每粒15mg。
实施例5
采用实施例2中的制备工艺制得干膏，将干膏粉碎，取l份干膏粉与0.1份低取代羟丙纤维素混匀，用80％乙醇溶液制粒，干燥，加入1％硬脂酸镁，混匀，压片，包薄膜衣，即得分散片。每片15mg。
以上所述的仅是本发明的优选实施例。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干变型和改进，也应视为属于本发明的保护范围。