专利名称：一种长春花生物碱类活性成分的诱导提取方法
技术领域：
本发明涉及一种获得长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵的长春花类生物碱 提取物的诱导提取方法，属中药化学领域。
背景技术：
长春花是夹竹桃科长春花属一种重要的药用植物，含有多种具有生物活性的生 物碱类物质，其中长春碱和长春新碱是治疗霍其金氏病和儿童急性白血病的特效药，是 目前国际上应用最广泛的天然抗肿瘤植物提取物之一，在国际市场上很有开发潜力，市 场前景十分广阔。我国长春花资源丰富，因此急需开发具有我国自主知识产权的抗肿瘤 植物提取物生产工艺，发展国民经济。
传统的提取方法如煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流提取及索式提取过程都是在 完整植物细胞的情况下，通过浸润与渗透、使溶剂进入组织细胞、溶解细胞内物质并使 其扩散至溶剂主体，这使溶剂提取细胞内生物活性成分成为可能。但由于细胞壁的屏障 作用，决定了中药材有效成分的提取效率有一定限度。
酶诱导是利用酶(如半纤维素酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等)将细胞壁的成 分水解或降解，破坏细胞壁结构，使有效成分充分暴露出来，加速有效成分的释放，从 而提高提取效率。发明内容
本发明的目的在于提供一种以长春花为原料，采用酶诱导-负压空化提取方法 高效地获得富含长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵四种生物碱类活性成分的长春花 提取物，从而提高长春花的资源利用度。
本发明的技术方案新鲜的长春花与酶溶液混合一勻浆一震荡酶解一酶解液抽 滤一负压空化提取一抽滤一合并酶解液和提取液一浓缩一溶剂除杂一萃取富集一浓缩至 干，即得富含长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵四种活性成分的长春花提取物。具 体方案如下
(1)酶诱导勻浆提取将新鲜的长春花和浓度为0.3 1.5mg/mL酶溶液按固液 比1 5 15 (g mL)混合，调节pH值为3.5 6.0，勻浆0.5 2η ι，然后将勻浆液 放入恒温摇床中，在25 50°C酶解8 40h，转速80 120rpm。
(2)负压空化提取将酶提取液抽滤，固形物加入提取溶剂，固液比为1 8 25 (g mL),室温提取2 4次，每次10 40η ι，将抽滤后的酶解液和提取液合并， 浓缩，得到浓缩物。
(3)溶剂除杂将浓缩物用水溶解，以等体积的溶剂萃取3 5次。
(4)富集精制将经过除杂的水相层用等体积的溶剂萃取3 5次。合并萃取 液，浓缩至干，得到长春花生物碱类活性成分的提取物。
本发明所述步骤(1)酶诱导勻浆提取过程中所用的酶为纤维素酶、β-葡萄糖苷酶和果胶酶其中的一种或两种以上的组合。本发明所述步骤(2)负压空化提取中所用的提取溶剂为醇-水(包括甲醇、乙醇 和丙醇)、丙酮-水体系。本发明所述步骤(3)溶剂除杂中所用的溶剂为石油醚、乙醚、溶剂油、正己烷 其中的一种或两种以上的组合。本发明所述步骤(4)富集精制中所用的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙 酯、正丁醇其中的一种或两种以上的组合。按照本发明所述优选的酶诱导负压空化提取条件对长春花中生物碱类活性成分 进行高效诱导提取，提取物中文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱四种生物碱类活性 成分的含量分别可达到 11.30 17.56%，6.52 10.79%，3.10 — 5.86%, 0.98 — 1.72%, 比传统方法对照组提高了 10 80%。本发明的优点(1)该方法具有操作条件温和、提取温度低、提取率高的特点。(2)耗能低，生产成本低，可实现大规模产业化生产。
具体实施例方式实例1配制纤维素酶浓度为0.3mg/mL调节pH在5.0 6.0之间。称取新鲜长春花 200.0g,以固液比为1 5的比例加入酶液，勻浆粉碎lmin，勻浆液放入45°C的恒温摇床 中，转速90rpm，震荡酶解24h，抽滤，固形物中以固液比1 10加入80%乙醇溶液负 压空化提取2次，每次25min，合并提取液，浓缩，浓缩物中加入15mL水，用石油醚除 杂3次，水相用乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，得到固形物0.65g，甲 醇定容，HPLC检测，所得固形物中文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的含量分别为 15.46%, 7.93%, 3.81%, 1.12%,比传统方法对照组提高了 17.5%、30.6%, 58.6%, 53.9%。对照组采用传统热回流法提取按照固液比1 15加入80%乙醇，80°C加热回 流两次，合并提取液，浓缩，浓缩物中加入15mL水，用石油醚除杂3次，水相用乙酸乙 酯萃取4次，合并乙酸乙酯层，浓缩至干，定容，HPLC检测。实例2配制纤维素酶β -葡萄糖苷酶浓度为0.5mg/mL、β -葡萄糖苷酶浓度为0.5mg/ mL的酶溶液，调节pH在4.5 5.5之间。称取新鲜长春花200.0g，以固液比为1 8 的比例加入酶液，勻浆粉碎1.5min，勻浆液放入40°C的恒温摇床中，转速lOOrpm，震荡 酶解18h，抽滤，固形物中以固液比1 15加入70%甲醇溶液负压空化提取3次，每次 30min,合并提取液，浓缩，浓缩物中加入15mL水，用石油醚除杂3次，水相用二氯甲 烷萃取3次，合并二氯甲烷层，浓缩至干，得到固形物0.73g，甲醇定容，HPLC检测， 所得固形物中文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱的含量分别为16.20%、8.07%, 4.76%, 1.43%,比传统方法对照组提高了 21.4%、33.6%, 72.5%, 70.8%。 对照组采用传统浸渍法提取按照固液比1 10加入70%甲醇，室温浸渍提取 三次，每次24h，合并提取液，浓缩，依浓缩物中加入15mL水，用石油醚除杂3次，水相用二氯甲 烷萃取3次，合并二氯甲烷层，浓缩至干，定容，HPLC检测。
权利要求
1.一种长春花生物碱类活性成分的诱导提取方法，包括如下操作步骤(1)酶诱导勻浆提取将新鲜的长春花和浓度为0.3 1.5mg/mL酶溶液按固液比 1 5 15(g mL)混合，调节pH值为3.5 6.0，勻浆0.5 2min，然后将勻浆液放 入恒温摇床中，在25 50°C酶解8 40h，转速80 120rpm。(2)负压空化提取将酶提取液抽滤，固形物加入提取溶剂，固液比为1 8 25 (g mL),室温提取2 4次，每次10 40min，将抽滤后的酶解液和提取液合并， 浓缩，得到浓缩物。(3)溶剂除杂将浓缩物用水溶解，以等体积的溶剂萃取3 5次。(4)富集精制将经过除杂的水相层用等体积的溶剂萃取3 5次。合并萃取液， 浓缩至干，得到长春花生物碱类活性成分的提取物。
2.按照权利要求1所述的一种长春花生物碱类活性成分的诱导提取方法，其特征在于步骤(1)中所述的酶为纤维素酶、葡萄糖苷酶和果胶酶其中的一种或两种以上的组合。
3.按照权利要求1所述的一种长春花生物碱类活性成分的诱导提取方法，其特征在于步骤(2)中所述的提取溶剂为醇-水(包括甲醇、乙醇和丙醇)、丙酮-水体系。
4.按照权利要求1所述的一种长春花生物碱类活性成分的诱导提取方法，其特征在于步骤(3)中所述的溶剂为石油醚、乙醚、溶剂油、正己烷其中的一种或两种以上的组合。
5.按照权利要求1所述的一种长春花生物碱类活性成分的诱导提取方法，其特征在于步骤(4)中所述的溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇。
全文摘要
本发明涉及中草药长春花活性成分的提取技术，目的在于提供一种经济快速的获得富含长春碱、长春新碱、长春质碱和文多灵四种生物碱类活性成分的长春花提取物的高效酶诱导提取方法。本发明针对传统提取方法提取时间长、提取温度高、提取率低等缺点，采用匀浆酶诱导提取、负压空化提取、溶剂除杂和富集精制等技术，获得富含四种生物碱类活性成分的长春花提取物，结果表明提取物中文多灵、长春质碱、长春碱和长春新碱四种生物碱类活性成分的含量分别可达到11.30～17.56％，6.52～10.79％，3.10～5.86％，0.98～1.72％，比传统方法提高了10～80％。该方法提取率高，无需高温加热，设备简单，操作安全，适于产业化生产，为中药提取现代化提供了一种新的方法和手段。
文档编号A61P35/02GK102018737SQ201010505108
公开日2011年4月20日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者付玉杰, 唐中华, 张宝友, 李庆勇, 牟璠松, 祖元刚, 罗猛, 郭晓瑞 申请人:东北林业大学, 祖元刚