本发明涉及医药合成技术领域，具体涉及一种胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物及其制备方法。
背景技术：
结核病是一种世界范围内的流行性传染病，并且具有致命危险。对结核病治疗一般采用多种药剂合用，如异烟肼、利福平等组合使用六个月以上。患者将这些药物一起服用或分开服用，总的服用量比较大，而且服用方式给患者造成不便，患者需要记录好几种药物的服用时期。因此，制备几种药物的联合制剂对患者是有利的，目前临床上尚无治疗结核病的单一制剂。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的上述不足，提供一种胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物及其制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
提供一种胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物，所述包合物为壳聚糖包覆胸腺五肽和利福霉素-异烟肼杂合物得到的纳米颗粒。
按上述方案，所述利福霉素-异烟肼杂合物的制备方法如下：
1)合成噁嗪利福霉素：将利福霉素钠溶于n,n-二甲基甲酰胺中，得到利福霉素钠溶液，加入浓硫酸对利福霉素钠进行酸化，待溶液变为深红色后升温至35-50℃，缓慢滴加n,n-二羟甲基叔丁胺，滴加完毕后继续环合反应，反应结束后冷却至室温，用冰乙酸水溶液析出沉淀物，将沉淀物过滤、水洗、干燥得到噁嗪利福霉素；
2)合成利福霉素-异烟肼杂合药物：将步骤1)所得噁嗪利福霉素溶于无水乙醇得到噁嗪利福霉素溶液，然后向所述噁嗪利福霉素溶液中加入哌嗪和异烟肼，升温至55-60℃进行缩合反应，反应结束后后处理得到福霉素-异烟肼杂合物。
按上述方案，步骤1)所述利福霉素钠溶液浓度为0.02-0.08g/ml。
按上述方案，步骤1)所述浓硫酸浓度为98％，其中硫酸与利福霉素钠摩尔比为1:2。
按上述方案，步骤2)所述噁嗪利福霉素溶液浓度为0.03-0.08g/ml。
本发明还提供上述胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物的制备方法，其步骤如下：将利福霉素-异烟肼杂合物溶于naoh溶液中，得到利福霉素-异烟肼溶液，然后将利福霉素-异烟肼溶液加入胸腺五肽的naoh溶液中，再加入三聚磷酸钠的水溶液，充分混合得混合液，然后将混合液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中，室温搅拌30min，加入乳糖作为保护剂，进行冷冻干燥48h后得到胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物。
优选的是，所述利福霉素-异烟肼溶液浓度为0.001-0.004g/ml。
优选的是，所述胸腺五肽的naoh溶液的浓度为0.01-0.02g/ml。
优选的是，所述三聚磷酸钠的水溶液浓度为0.001-0.004g/ml。
优选的是，壳聚糖、利福霉素-异烟肼杂合物、胸腺五肽与三聚磷酸钠的质量比为5-10：0.5-1.5：1.5-3：1-2。
优选的是，将混合液缓慢滴加到壳聚糖醋酸溶液中得到的反应液中壳聚糖的浓度为1.5-6.0g/l。实验结果表明,只有在特定浓度范围内,即反应液中壳聚糖浓度范围在1.5-6.0g/l时才能够形成壳聚糖纳米颗粒。
本发明还包括包含上述胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物的药物组合物。
以及上述胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物用于治疗结核病的用途。
胸腺五肽(thymopentin，tp5)是人工合成的五肽，其氨基酸顺序和结构与由49个氨基酸组成的天然胸腺生成素(thymopoietin，tp)的32～36位氨基酸组成相同，即tp生物功能的活性基团arg-lys-asp-val-tyr，具有tp相似的生物活性，是一种双向免疫调节剂，现临床广泛用于类风湿性关节炎、恶性肿瘤、慢性肝炎及严重感染等疾病的治疗，有广阔的发展前景。
tp5在体内很快由蛋白酶和氨肽酶降解为氨基酸。目前tp5临床应用制剂均为注射用，通过进行化学结构修饰、加入酶抑制剂或改变给药途径(如鼻腔给药)可增加蛋白酶和氨肽酶稳定性或提高吸收度。其结构式如下：
利福霉素类抗生素，是由地中海链丝菌产生的一类抗生素，它具有广谱抗菌作用，对结核杆菌、麻风杆菌、链球菌、肺炎球菌等革兰氏阳性细菌，特别是耐药性金黄色葡萄球菌的抑制作用都很强。异烟肼是抗结核杆菌药，用于肺结核，皮肤结核等，最早发明于1952年，它的发明使结核病的治疗起到了根本性的变化。通过杂合技术将利福霉素和异烟肼两者结合在一起得到的利福霉素-异烟肼杂合物具有较好的药效活性。结构式如下：
根据“鸡尾酒疗法”将几种不同单一靶点药物联用或选择使用作用于多个分子靶标的“多靶点”药物治疗复杂疾病时则会有较佳疗效。通过药剂学中包合的方法，将具有不同靶点的药物分子包合起来以形成多靶点药物，由于两个药物分子缺少共性，所以在体内可各自保留原来分子的全部或部分结构特征。然后通过特定的给药方式，到达指定的给药部位，包合物分散开，两个或多个药物分子分别作用于各自的靶点而发挥作用。根据此发现，本申请人制备出胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物。通过对所合成的包合物的活性测试，发现此包合物相对其中任一组分都有较好的抗菌活性。
本发明的有益效果在于：本发明通过简单的包合作用将两种不同作用靶点的药物(胸腺五肽、利福霉素-异烟肼杂合物)包合在一起，得到胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物，其对结核分枝杆菌具有比利福霉素和异烟肼的混合物更好的抑菌效果，通过特定的给药方式将其送达给药部位后包合物分散开，两个或多个药物分子分别作用于各自的靶点而发挥作用，在保证药效的同时减少药物的服用量。
附图说明
图1为胸腺五肽(tp5)、壳聚糖纳米颗粒、实施例1步骤2)制备的利福霉素-异烟肼杂合药物以及实施例1步骤3)制备的胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物的红外光谱图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
实施例1
制备胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物，具体步骤如下：
1)合成噁嗪利福霉素：在三口瓶中装入利福霉素s-钠盐1.00g(0.0014mol),加入20mln,n-二甲基甲酰胺(dmf)将其溶解，放入搅拌用的磁子，常温下搅拌30分钟，待充分溶解后，加入98％的浓硫酸0.072g(0.0007mol)酸化，常温下搅拌30分钟，反应液由深蓝色变成深红色，然后升温至35～50℃，缓缓滴加n,n-二羟甲基叔丁胺0.352g(0.0026mol)，滴毕后，反应液由深红色变为深蓝色，继续保温反应2小时，冷却至室温，向反应液中加入滴加了2滴冰乙酸的水溶液200ml，间歇搅拌，有大量蓝色沉淀，反应结束后(用薄层层析硅胶板跟踪反应)析出，静置过夜，过滤，适量水洗，干燥后即可得到1.03g蓝色固体物质，即噁嗪利福霉素；
2)合成利福霉素-异烟肼杂合药物：将步骤1)所得噁嗪利福霉素用20ml无水乙醇溶解，得到噁嗪利福霉素溶液，在100ml三口瓶中装入噁嗪利福霉素溶液和哌嗪0.13g(0.0015mol)与0.039g的异烟肼，升温至55-60℃，反应液由深蓝色变为红棕色，保温反应3小时，反应结束后(用薄层层析硅胶板跟踪反应)，在旋转蒸发仪中于45℃下将溶剂乙醇旋干，得到砖红色固体物质，即利福霉素-异烟肼杂合药物；
3)合成胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物：
a.将10mg壳聚糖固体(cs)溶于5ml体积分数为0.25％的醋酸溶液，充分溶胀24小时，直至壳聚糖全部溶解，得到壳聚糖溶液；
b.取1.7mg胸腺五肽固体(tp5)溶解在0.1ml浓度为0.1mol/l的naoh溶液中，使其充分溶解得到胸腺五肽溶液；
c.取3mg利福霉素-异烟肼杂合药物(hyd)溶于1ml浓度为0.1mol/l的naoh溶液中，从中取出0.3ml加入步骤b制备的胸腺五肽溶液中，再加入1ml浓度为2g/l的三聚磷酸钠(tpp)水溶液，充分混合，得到混合溶液；
d.将步骤c得到的溶有tp5，hyd，tpp的混合溶液缓慢滴加到步骤a所得溶胀后的壳聚糖溶液中，室温搅拌30min，加入少量乳糖做保护剂，然后冷冻干燥48h，得到胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物。
对胸腺五肽(tp5)、壳聚糖纳米颗粒、本实施例步骤2)制备的利福霉素-异烟肼杂合药物以及本实施例步骤3)制备的胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物进行红外测试，所得红外光谱见图1，其中1为胸腺五肽，2为利福霉素-异烟肼杂合药物，3为壳聚糖纳米颗粒，4为胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物，由图可看出，壳聚糖与tpp作用后，3409处的-oh伸缩振动吸收峰移至3383处，向低波端位移，这表明形成了较强的分子内和分子间氢键；tp5的特征吸收峰为酰胺峰1656,1566，1242cm，以及3346处的氨基伸缩振动峰，4中峰的强度增强，这是因为tp5的酰胺峰1656和1566与壳聚糖纳米颗粒的氨基峰1637和1564叠加，以上说明形成了壳聚糖包覆tp5和利福霉素-异烟肼杂合药物的包合物。
实施例2
测试实施例1制备的胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物(其中利福霉素-异烟肼杂合药物质量含量为6％，胸腺五肽质量含量为11.6％)的冻干物稀释至不同的倍数，测试其对培养好的结核分枝杆菌菌株的耐药性，并与利福霉素和异烟肼的混合物(利福霉素与异烟肼质量比为1:1)作对比。
实验方法：把上述包合物及混合物配成浓度为1mg/ml的药液，经灭菌后，用无菌膜密封起来备用。
(1)在无菌96孔板(1～12孔)中每孔加7h9培养基100μl。第1孔加适当稀释的抗结核药原液100μl，对倍连续稀释至第12孔。各孔药物最终浓度:利福霉素和异烟肼的混合物17～0.017μg/ml,胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物17～0.017μg/ml；
(2)在玻璃磨菌器底部加入2滴10％tween-80生理盐水及临床分离的2～3周菌龄的新鲜培养物，研磨至呈乳酪样，用生理盐水稀释成1号麦氏比浊管的浊度(1mg/ml)，用7h9培养基1:20倍稀释后1～8孔每孔接种100μl。空白孔为培养基对照；
(3)用无菌膜封板，放入湿盒内，37℃培养5d，第6天加入过滤除菌0.1g/l刃天青显色液30μl至第12孔，继续温育24h，如空白孔(未加药物)变成粉红色，则加同量刃天青显色液至其他各孔，24h后记录颜色变化。如空白孔仍为蓝色，分别在第7、9天观察。颜色从蓝色变为粉色即预示细菌生长。
将实施例1制备的胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物稀释成不同浓度后测试其对结核分枝杆菌的耐药性，并与同等浓度下的利福霉素和异烟肼的混合物进行对比，测试结果见表1。
表1
备注：r为对结核分枝杆菌的耐药性，即无活性；s为对结核分枝杆菌的敏感性，即为有活性(浓度单位为μg/ml)。
从表1可看到胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物浓度在0.133μg/ml的时候就开始出现抑菌效果，而利福霉素和异烟肼的混合物的浓度在1.063μg/ml的时候才出现抑菌效果，可认为胸腺五肽、利福霉素-异烟肼的壳聚糖包合物比利福霉素和异烟肼混合物的抑菌效果好。