一种具有炎症靶向性的多功能制剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种具有炎症靶向性的多功能制剂及其制备方法和应用。

背景技术：

发炎是身体抵抗外来生物入侵和组织创伤的自然防御机制。在急性炎症中，病原体或炎症媒介会被清除出去，达到一种动态平衡；但在慢性炎症中，这种消解反应被削弱而导致慢性炎症和组织损伤。目前普遍认为，消炎功能受损是动脉粥样硬化、关节炎、神经退化、癌症等疾病恶化的一个主要原因。

随着科学技术的不断进步，尤其是分子生物学的发展，基因治疗逐渐在癌症、哮喘等疾病中得到应用。但是，临床数据和已有研究表明，单一疗法(化疗和基因治疗)无可避免存在不足，多种治疗的协同作用在肿瘤治疗以及一些炎症性疾病中具有巨大的发展前景，将多种治疗机制中的治疗因子装载到同一纳米载体运载到病灶部位，实现定点给药，可以互补单一治疗机制的缺陷，并且可以增强治疗效果。但是，由于基因与药物运载及作用体制截然不同，因此，构建低毒且高效的共传递体系是协同治疗过程的巨大挑战之一。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种具有炎症靶向性的多功能制剂及其制备方法和应用。

为实现本发明的目的所采用的技术方案是：

一种具有炎症靶向性的多功能制剂，包括两亲性的纳米复合物、表面带负电的基因片段和疏水性抗炎症药物，所述表面带负电的基因片段通过静电作用包裹在所述纳米复合物的内部，所述疏水性抗炎症药物通过疏水作用力包裹在所述纳米复合物的外部，其中两亲性的纳米复合物为pei-ba-ap(其中pei为pei1800，ba为1，4-二溴甲基苯硼酸，ap为抗坏血酸棕桐酸酯)，其结构式如下：

优选的，所述疏水性抗炎症药物为疏水荧光染料尼罗红。

优选的，所述基因片段为鲑鱼精dna。

本发明的另一方面还包括所述具有炎症靶向性的多功能制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备pei-ba-ap；

(2)将表面带负电的dna，通过静电作用与步骤(1)中的pei-ba-ap复合，形成纳米复合物；

(3)利用疏水作用力将疏水药物装载在所述步骤(2)得到的纳米复合物的外层。

优选的，所述pei-ba-ap是由表面富含邻二醇的抗坏血酸棕桐酸酯ap与苯硼酸ba修饰的超支化聚乙烯亚胺pei-ba在中性环境中发生键接而成，其反应式如下：

优选的，所述苯硼酸ba修饰的超支化聚乙烯亚胺pei–ba是由pei和ba通过取代反应制备的，反应式如下：

优选的，pei-ba-ap分子的制备方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)分别配置好pei1800和ba的甲醇溶液，pei1800的浓度为0.15mmol/ml，ba的浓度为0.45mmol/ml。

(2)在70℃的热油浴中，将上述溶液混于圆底烧瓶内，使混合溶液体积为15ml并使其充分搅拌，混合均匀，将磁子转速调整为600rpm，冷凝回流，反应12h。

(3)反应结束，用乙醚对反应产物进行提纯操作，提纯处理三次。

(4)将乙醚提纯处理的产物进行旋蒸处理，除去残留的乙醚。

(5)将旋蒸处理的反应产物溶于纯水，进行冷冻干燥处理，冻干后的pei-ba产物置于干燥器中保存备用。

(6)分别配置好pei-ba的水溶液，浓度为5mg/ml和ap的四氢呋喃溶液，浓度为10mg/ml。

(7)取pei-ba溶液1ml加入到圆底烧瓶内，加入5ml纯水，向其中缓慢滴加ap四氢呋喃溶液100μl，使最终产物浓度为1mg/ml。

(8)常温下搅拌12h，磁子搅拌速度调整为800rpm，反应过夜处理以充分去除thf。

(9)将所得溶液进行冷冻干燥处理，所得产物置于常温干燥器中备用。

优选的，所述步骤(2)中所用的分子为步骤(1)中所制备的pei-ba-ap冻干所得，在将其溶于dmso中，基因为表面带负电的dna，通过静电作用与上述pei-ba-ap的溶液进一步复合，形成表面带负电的纳米复合物，记为pei-ba-ap@dna。

优选的，pei-ba-ap与dna的复合时间为20-40min，优选为30min。

优选的，步骤(3)中所采用的疏水药物为疏水荧光染料尼罗红，通过疏水作用力包裹在pei-ba-ap@dna内，形成表面纤维结构，且得到的纳米复合物表面带负电。

优选的，所述pei-ba-ap@dna与疏水荧光染料尼罗红的复合时间为20-40min，优选为30min。

本发明的另一方面，还包括所述多功能制剂在制备抗炎药物上的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明所制备的基因药物协同多功能制剂，由于其表面带负电性，对炎症部位的正电性蛋白具有靶向吸附性，并且具有较好的生物相容性和生物安全性。本发明所制备的多功能纳米制剂可以实现基因与药物的共传递，在炎症性疾病的治疗具有应用前景。本发明制备简单，减小了对健康细胞和组织的伤害，在炎症性疾病治疗的过程中具有重要意义。

附图说明

图1pei-ba-ap的化学结构式

图2pei-ba的核磁图

图3pei-ba-ap的紫外光谱图

图4pei-ba-ap@dna@nilered的粒径分布图及电势

图5pei-ba-ap@dna@nilered的tem图

图6pei-ba-ap@dna@nilered的炎症趋向性

图7pei-ba-ap@dna@nilered的酶响应性

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

pei购买于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，ba购买于北京华威锐科化工有限公司，ap购买于西格玛，dna为鲑鱼精dna,购买于凯玛特(天津)化工科技有限公司，尼罗红购买于凯玛特(天津)化工科技有限公司。

分别用托盘天平称量540mgpei1800和193.4mgba，用移液枪分别向上述两种试剂中加入2ml甲醇，将上述溶液混于圆底烧瓶内，在向其中加入11ml甲醇，使混合溶液体积为15ml。

设置好油浴锅的温度70℃和转速600rpm并搭好冷凝循环装置。将上述圆底烧瓶置于油浴锅中，加入小磁子，使其充分搅拌混合均匀，开启冷凝水，保证冷凝口有水珠滴下，反应12h。

反应结束后，关闭油浴锅，取出圆底烧瓶，用磁铁吸出小磁子。将反应物在搅拌条件下慢慢滴加入200ml冰乙醚中，搅拌30min后静置30min，然后用吸管吸出上层的液体，再将沉淀物溶于少量甲醇中，再慢慢滴加至200ml冰乙醚中，提纯产物。重复上述操作两次。

将提纯操作三次后得到的反应产物旋蒸以除去残余的乙醚，并用少量纯水溶解旋蒸瓶中产物，将其置于50ml离心管中冻干。

分别用托盘天平称量5mgpei-ba和1mgap，将pei-ba溶于1ml纯水中，ap溶于100μl四氢呋喃中，取1mlpei-ba溶液加入到圆底烧瓶内，向其中缓慢滴加100μlap的四氢呋喃溶液，使最终产物浓度为1mg/ml。常温下溶液充分搅拌，磁子搅拌速度调整为800rpm，反应过夜处理。将所得溶液如上步所示进行冷冻干燥处理，所得产物置于常温干燥器中备用。

称取1mg将所制备pei-ba-ap溶于1mldmso中配成1mg/ml溶液，配备10mg/ml的nilered的四氢呋喃溶液，取0.8μl上述pei-ba-ap材料和5μldna水溶液(200μg/ml)置于1.5ml离心管内，加入100μl纯水，在37℃下复合30min。取0.5μlnilered溶液快速滴入上述复合dna溶液中，随后涡旋10s，制得基因药物共载纳米粒子(pei1800-ba-ap@dna@nilered)。

pei-ba-ap的紫外光谱图中，pei-ba所形成的硼酸酯键峰在263nm左右，而与ap反应后，在紫外图中峰值发生了明显偏移，说明了材料的合成成功。

具有炎症靶向性的多功能纳米制剂的纳米结构及粒径和电势分别采用透射电镜(tem)、动态光散射仪(dls)进行表征。如图4和图5所示。表明所制备纳米制剂具有纳米球形结构且电势为负值。

具有炎症靶向性的多功能纳米制剂的炎症靶向性和酶响应性定点释放是通过体外模拟论证。

炎症靶向性是通过将带正电转铁蛋白(100μg/ml)溶于pbs中，带负电的粘蛋白(3μg/ml)溶于hbss中，将转铁蛋白加入到24孔ps板中，37℃过夜放置，粘蛋白加入24孔ps板中，室温下轻晃2h，转铁蛋白和粘蛋白分别模拟炎症部位和正常组织。随后加入制得的炎症靶向性的多功能纳米制剂1ml，室温下轻晃1h，避光处理。未做任何处理的板子作为对照组同样进行药物处理。随后孔板分别用pbs清洗三次，在荧光显微镜下成像处理。激发波长为590nm。从图中可以看出，本纳米粒子对模拟炎症环境具有一定的靶向性，是由于材料与炎症环境条件下的正电蛋白静电作用所致。

酶响应性实验是通过向纳米制剂中加入100u/ml脂酶及未加入脂酶的数码照片，未加入脂酶的制剂保持稳定未生成沉淀，而加入脂酶4h后既有沉淀生成，验证了炎症环境下的药物释放过程。

依照本发明内容进行工艺参数的调整，均可制备本发明的pei-ba-ap@dna@nilered，并表现出与实施例基本一致的性能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。