本发明通常涉及治疗领域，具体地涉及用于促进细胞损伤修复的组合物及其应用。
背景技术：
多发性硬化症、小儿脑瘫、帕金森氏病、重症肌无力症、慢性肾衰竭、肺纤维化、肾炎和溃疡性结肠炎等由于细胞损伤引起疾病，通常通过可能严重损害正常细胞的药物和外科手术治疗，治疗过程痛苦且漫长。
最近发现移植正常细胞来替代被破坏的或损伤的细胞的替代疗法对于这种疾病是有效的，特别地，能够分化和增殖为所需组织的神经细胞正在大力研究中。
干细胞是非特化细胞，其可以在非分化阶段无限增殖并可以在应答特异性刺激时分化为多种组织。可以形成神经元和/或神经胶质如星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或神经膜细胞的神经干细胞也是具有自我繁殖能力的未分化细胞。它们通过神经前体细胞或神经胶质前体细胞而分化为神经细胞，例如神经元或神经胶质。
已知可以分化为骨、软骨、脂肪组织、肌肉、腱、韧带、神经组织和其他的间充质干细胞对于细胞替代疗法是可行的。间充质干细胞主要自骨髓获得，但是这种间充质干细胞由于其有限的分化和增殖能力而仅提供有限的应用。而且，除了发现与患者具有相同的组织相容性抗原的供体以避免在骨髓移植中的移植物抗宿主反应的问题之外，对于这种细胞替代疗法还需进行包括数个步骤的复杂、通常痛苦的输液。
近年来，脐带血由于其高干细胞浓度而成为研究者的目标。已经进行了许多通过移植脐带血给患者来治疗血液病的试验，而且已经建立了以冷冻形式保存脐带血直至使用的脐带血库以用于自体移植疗法。
与骨髓不同，脐带血可以通过简单地从脐带获得而且其几乎不引起移植物抗宿主反应。为此，最近进行了关于脐带血临床应用的世界性研究。
技术实现要素：
为了解决至少部分上述技术问题，本发明的发明人在脐带血方面进行了深入研究并发现，包含脐血提取物和艾草提取物的组合物，具有化学趋向性，自动归巢修复损伤细胞。同时，能够调整细胞环境，从而解决细胞损伤引起的机体问题。
本发明的一方面，提供用于促进细胞损伤修复的组合物，其包含脐血提取物、艾草提取物和生理盐水。
在某些实施方式中，所述的用于促进细胞损伤修复的组合物中，所述脐血提取物和所述艾草提取物质量份数之比为2-4:1。
在某些实施方式中，所述的用于促进细胞损伤修复的组合物中，所述艾草提取物为利用水蒸气蒸馏法、大孔树脂吸附法、溶剂萃取法、微波萃取法和/或超临界流体萃取法从艾草中提取。
在某些实施方式中，所述的用于促进细胞损伤修复的组合物中，所述艾草提取物包含5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、木犀草素和3,4’,5,7-四羟基黄酮。
在某些实施方式中，所述的用于促进细胞损伤修复的组合物中，所述艾草提取物包含按照质量份计的，20-40份的5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、20-40份的5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、10-20份计木犀草素和40-60份的3,4’,5,7-四羟基黄酮。
在某些实施方式中，所述的用于促进细胞损伤修复的组合物中，所述艾草提取物占所述组合物的质量浓度为25-60μg/ml。
在某些实施方式中，所述的用于促进细胞损伤修复的组合物中，还包含戊巴比妥钠和6-ohda溶液。
本发明另一方面，还提供根据上述的组合物在制备用于修复受试者体内受损神经细胞的药物中的应用。
在某些实施方式中，所述受试者患有选自由多发性硬化症、小儿脑瘫、帕金森氏病、重症肌无力症、慢性肾衰竭、肺纤维化、肾炎和溃疡性结肠炎组成的组中的疾病。
有益效果：
本发明所述的提供用于促进细胞损伤修复的组合物，利用所述组合物进行回输治疗，组合物进入受试者体内，趋向性至受损细胞部位，主动分裂繁殖，促进受损细胞恢复，同时，改善人体内部环境，达到修复受损细胞的功能，治疗由细胞受损引起的疾病的目的。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限值以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
本发明中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。本发明中所述的“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。
本发明中，所述“细胞损伤”是指任何类型的细胞损伤，特别是神经系统中的细胞损伤，此类细胞损伤可引起神经系统损伤。神经系统损伤容易导致例如伴随由于受损的运动或感觉神经导致的行为功能障碍的疾病，例如多发性硬化症、小儿脑瘫、帕金森氏病、重症肌无力症、慢性肾衰竭、肺纤维化、肾炎和溃疡性结肠炎等。
本发明中，所述“脐血”是指哺乳动物(例如，人类)胎儿娩出、脐带结扎并离断后残留在胎盘和脐带中的血液。优选地，胎盘和脐带可从动物体分离后经冷冻保存。更优选地，胎盘和脐带为从动物体分离的新鲜胎盘和脐带。更优选地，胎盘和脐带为从动物例如人体分离后1-12小时，优选1-5小时之内的胎盘和脐带。新鲜的胎盘和脐带具有更多高活性的物质。因此，本发明的脐带血优选为新鲜胎盘和脐带中的血液。
本发明中，所述“脐血提取物”是指包含脐血成分的液体。优选地，包含利用一定提取方法从脐血中提取的物质。示例性地所述提取方法包括将脐带血样品与细胞稀释剂接触的步骤；随后加入细胞沉淀剂的步骤；待分层后取出上层细胞液离心浓缩获得沉淀，随后将所述沉淀铺到分层剂上层，离心分离得到中间的油状层的步骤。
本发明中，所述稀释剂为下列水溶液之一：0.1-30％氯化钠注射液和0.1-20％的脑蛋白水解物组成的水溶液，或者0.1-30％的ph为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1％-20％的脑蛋白水解物组成的水溶液。优选地，所述稀释剂为0.1-15％氯化钠注射液和0.1-10％的脑蛋白水解物组成的水溶液。更优选地，所述稀释剂为0.1-3％氯化钠注射液和0.1-5％的脑蛋白水解物组成的水溶液。例如，所述稀释剂为0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1.2％、1.5％、1.8％、2.1％、2.4％、2.7％或3％氯化钠注射液和0.1％、0.5％、0.7％、0.9％、1.5％、1.8％、2.1％、2.7％、3％、3.7％、4.2％、4.7％或5％的脑蛋白水解物组成的水溶液。优选地，所述稀释剂为0.1-30％的ph为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1％-20％的脑蛋白水解物组成的水溶液。优选地，所述稀释剂为0.1-15％的ph为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1％-10％的脑蛋白水解物组成的水溶液。更优选地，所述稀释剂为0.1-3％的ph为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1％-5％的脑蛋白水解物组成的水溶液。例如，所述稀释剂为0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.8％、0.9％、1.2％、1.5％、1.8％、2.1％、2.4％、2.7％或3％的ph为7-7.5的磷酸盐缓冲液和0.1％、0.5％、0.7％、0.9％、1.5％、1.8％、2.1％、2.7％、3％、3.7％、4.2％、4.7％或5％的脑蛋白水解物组成的水溶液。
在某些实施方案中，所述脑蛋白水解物为选自下列产品之一：国药准字h20052182、国药准字h20003386、国药准字h20003384或国药准字h20003385。
在某些实施方案中，所述沉淀剂为0.1-30％羟乙基淀粉水溶液或0.1-20％甲基纤维素水溶液。优选地，所述沉淀剂为1-10％羟乙基淀粉水溶液或0.3-1.5％甲基纤维素水溶液。更优选地，所述沉淀剂为3-7％羟乙基淀粉水溶液或0.3-1％甲基纤维素水溶液。例如，所述沉淀剂为3％、4％、5％、6％或7％的羟乙基淀粉水溶液。再例如，所述沉淀剂为0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％的甲基纤维素水溶液。
在某些实施方案中，所述分层剂包含密度为1.0-1.2g/ml的聚蔗糖和泛影葡胺的水溶液。优选地，液聚蔗糖和泛影葡胺的密度为1.01-1.088g/ml、优选1.035-1.08g/ml、更优选为1.075g/ml。
在某些实施方案中，将所述稀释样品与所述沉淀剂按体积1:1混合。
在某些实施方案中，将所述稀释样品与所述沉淀剂按体积2:1混合。
在某些实施方案中，将所述稀释样品和所述沉淀剂按照体积2:1混合后，摇匀1-8分钟，静置3分钟-180分钟，待分层后吸取上层细胞液，分装至50ml离心管中，以500-4000转/分钟，离心1-20分钟，弃上清液得到所述浓缩样品。
在某些实施方案中，用生理盐水稀释所述浓缩样品，将稀释后的所述浓缩样品铺设在所述分层剂上，以500-4000转/分钟转速，离心1-60分钟，收集脐血提取物。进一步地所述脐血提取物为位于所述离心管中间位置的2-4mm厚的油状细胞层。
在某些实施方案中，所述方法还包括将所述脐血提取物用生理盐水清洗1-5次。
本发明中，所述“艾草提取物”是指从艾草中提取的物质。所述艾草提取物在所述组合物中的浓度为25-60μg/ml。进一步地，所述艾草提取物占所述组合物的质量浓度为30-45μg/ml。更进一步地，所述艾草提取物占所述组合物的质量浓度为30、32、35、37、40、42或45μg/ml。
本发明中，所述“艾草提取物”主要包含挥发油、黄酮类、三萜类衍生物、微量元素、鞣质、绿原酸、朝鲜蓟酸、脂肪酸、鞣酸和多糖。进一步地，所述挥发油主要包括单萜类化合物、单萜类衍生物、倍单萜类化合物及其衍生物；进一步地，所述挥发油包括叶脑、松油醇、α-侧柏烯、蒎烯、崁烯、香桧烯、1-辛烯-3-醇、对-聚伞花素、1,8-桉叶素、γ-松油烯、樟脑、龙脑、萜品烯-4-醇、α-松油醇、丁香酚、反-丁香酚、顺-β-合欢烯草烯、β-芹子烯、丁香烯氧化物、六氢金欢基丙酮基棕榈酸等。进一步地，所述黄酮类主要包括黄酮和黄酮醇化合物，进一步地，所述黄酮类主要包括游离黄酮，更进一步地，所述黄酮类包括5,7-二羟基-6,3,4-三甲氧基黄酮、5-羟基-6,7,3,4四甲氧基黄酮、5,7,4’-三羟基-6,3’-二甲氧基黄酮、5,3,7,3’,4-五羟基黄酮、5,7,4’-三羟基黄酮、芹菜素、木犀草素和单乃芬等。进一步地，所述三萜类化合物包括α-及β-香树脂醇、无羁萜、α-及β-香树脂醇的乙酸酯、羽扇烯酮、粘霉烯酮、羊齿烯酮、24-亚甲基环木菠萝烷酮、西米杜鹃醇和3β-甲氧基-9β、19-环羊毛甾-23(e)烯-25,26-二醇等。进一步地，所述微量元素包含金属锡(sr)、铬(cr)、钴(co)、镍(ni)、锰(mn)、铜(cu)、锌(zn)、铁(fe)、钠(na)、钾(k)、钙(ca)和镁(mg)。
本发明中，所述的“艾草提取物”是利用水蒸气蒸馏法、大孔树脂吸附法、溶剂萃取法、微波萃取法和/或超临界流体萃取法从艾草中提取的。进一步地，所述大孔径树脂吸附法是以大孔吸附试着xda-1吸附艾草提取液中的所述艾草合物，所述的超临界流体萃取法，是用临界二氧化碳萃取技术萃取艾草中的所述艾草提取物。更进一步地，将艾草叶放置于蒸馏烧瓶中，用40-60％的乙醇溶解摇匀，静止20-40分钟；用微波炉解冻档处理1-3分钟；将蒸馏烧瓶放置在55-70℃恒温水浴中回流2小时，趁热抽滤弃去滤渣。然后滤液转入分液漏斗中，用石油醚萃取滤液中的叶绿素、胡萝卜素和脂溶性脂类等杂质。弃去上层液，保留下层液。重复萃取2-5次，直至滤液颜色无色是，将滤液转入容量瓶中，用30-50％的乙醇除去多糖、蛋白质等可溶性杂质。每2ml去杂溶液加入12.5ml的30-50％的乙醇和1mlnano2，5-10分钟后，按照每2ml去杂溶液对应0.8ml6％的al(no3)3的比例加入al(no3)3，5-10分钟后，按照每2ml去杂溶液对应3.5ml10％naoh的比例加入naoh，震荡混匀，获取所述艾草提取物。
本发明的组合物可以根据本领域常规方法胃肠外施用，例如通过注射进入损伤区域以及注射进入脑脊液例如腰椎穿刺术和实质注射(parenchymalinjection)、静脉或动脉。优选地，其可以通过直接注射施用。另外，可以使用douglaskondziolka(douglaskondziolka，pittsburgh，1998)的临床方法将本发明的组合物施用给损伤区域。特别地，将对象的颅骨切开一个直径1cm的孔，将于hbss(hank’s平衡盐溶液)中的组合物的悬浮液通过长针注射器和立体定位架而注射进该孔。
所述组合物的典型剂量范围从1×105到1×107细胞/kg体重/注射，优选从5×105到5×106细胞/kg体重/注射，其可以单剂量或分份剂量施用。另外，应理解实际施用给某个患者的有效成分的量应根据多种相关因素包括被分化增殖的神经细胞的量、选择的施用途径和个体患者的体重、年龄和性别确定。例如，用量为，45ml的脐血提取物浓度为6.2×105个/ml组合物悬液，50ml的脐血提取物浓度为5.7×105个/ml组合物悬液，55ml的脐血提取物浓度为4.9×105个/ml组合物悬液，60ml的脐血提取物浓度为5.8×105个/ml组合物悬液，58ml的脐血提取物浓度为.5×105个/ml组合物悬液，61ml的脐血提取物浓度为5.8×105个/ml组合物悬液，60ml的脐血提取物浓度为5.7×105个/ml组合物悬液。
实施例
实施例1
获取脐血提取物、艾草提取物和生理盐水。
将所述脐血提取物、所述艾草提取和所述生理盐水按照体积比为2:1:1的比例混合，制得所述的用于促进细胞损伤修复的组合物。
上述方案中，所述艾草提取物占所述组合物的质量浓度为25μg/ml。
且所述艾草提取物包含按照质量份计的，20份的5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、20份的5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、10份的木犀草素和40份的3,4’,5,7-四羟基黄酮。
上述方案中，所述组合物还包含戊巴比妥钠和6-ohda溶液。
实施例2
获取脐血提取物、艾草提取物和生理盐水。
将所述脐血提取物、所述艾草提取和所述生理盐水按照体积比为3:1:1.5的比例混合，制得所述的用于促进细胞损伤修复的组合物。
上述方案中，所述艾草提取物占所述组合物的质量浓度为60μg/ml。
且所述艾草提取物包含按照质量份计的，40份的5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、40份的5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、20份计木犀草素和60份的3,4’,5,7-四羟基黄酮。
上述方案中，所述组合物还包含戊巴比妥钠和6-ohda溶液。
实施例3
获取脐血提取物、艾草提取物和生理盐水。
将所述脐血提取物、所述艾草提取和所述生理盐水按照体积比为4:1:2的比例混合，制得所述的用于促进细胞损伤修复的组合物。
上述方案中，所述艾草提取物占所述组合物的质量浓度为40μg/ml。且所述艾草提取物包含按照质量份计的，30份的5-羟基-6,7,3’,4’四甲氧基黄酮、30份的5,7-二羟基-6,3’,4’-三甲氧基黄酮、115份计木犀草素和50份的3,4’,5,7-四羟基黄酮。
上述方案中，所述组合物还包含戊巴比妥钠和6-ohda溶液。
药理实验
动物饲养于spf级实验动物实验室条件下，室内温度19-22℃，相对湿度40％-50％，给予全价颗粒饲料，自由摄食、饮水。
精神神经系统实验：
取质量18-22g的km小鼠80只，雌雄比例均为1:1，随机分为四组，依次为实验组1、实验组2、实验组3和对照组，每组20只，雌雄各半。实验组1至实验组3给药组分设0.5、1.0、2.0ul/kg的脐血提取物浓度为8×107个/ml组合物悬液，对照组给予5％葡萄糖注射液，均按0.1ml/10g体重尾静脉注射给药。
实验内容
给药后10min，观察小鼠的一般行为表现，步态、姿势、肌肉紧张度、瞳孔变化、流涎、二便、皮毛等，同对照组比较，了解受试药对动物的影响。
给药后10min，置小鼠于自发活动测定仪中，稳定5min后，测定10min内自主活动次数，用组间t检验进行统计处理。
实验结果
1.小鼠一般行为的硬性：实验各组动物在用药后60min内的一般行为，步态、肌紧张度、活动、饮食、皮毛及二便，均无显著变化，未见有瞳孔大小改变，竖毛、倦伏、流涎等异常症状，同对照组相比，差异无统计学意义。
2.小鼠协调运动的影响：各组动物于给药前及给药后各观测点的跌落率均为0，表明在实验所用0.5、1.0、2.0ul/kg剂量下对小鼠协调运动无明显影响。
3.对小鼠自主活动的影响：组合物悬液各剂量组对小鼠自主活动的影响，实验组1.0、2.0ul/kg剂量时，活动次数略有减少，但同对照组比较，差异并无统计学意义，表明组合物悬液对小鼠自主活动无明显影响，如表1所示。
表1对小鼠自主活动的影响
注：与对照组比较p＞0.05。
呼吸系统及心血管系统实验
以体重12-18kg的健康杂种家犬8只，设置实验组1、实验组2、实验组3和对照组，每组2只，雌雄各一只。实验组1至实验组3给药组分设0.5、1.0、2.0ul/kg的脐血提取物浓度为8×107个/ml组合物悬液，对照组给予5％葡萄糖注射液，均按1ml/10g体重股静脉插管给药，注射速度为30s。
实验内容
用戊巴比妥钠30mg/kg，静脉注射麻醉后，背位固定，分离右颈总动脉，插管连接tp—101型压力转换能以多导生理记录仪记录收缩压，舒张压及平均动脉压；以针形电极刺入四肢皮下记录ⅱ导联心电图，以立位转换能器连接胸骨记录呼吸频率及幅度。分别在静脉注射给药后1、2、5、10、15、20及30min时记录上述各项指标，观察组合物悬液对呼吸，心电及血压的作用，用t检验法进行用药前后显著性检验分析。
实验结果
1.对呼吸系统的影响：静脉注射各剂量后，分别在不同时间点描记呼吸频率及幅度的变化，结果表明给药组在0.5、1.0ul/kg剂量时静脉注射对麻醉犬各时间点的呼吸频率及幅度均无明显作用，在2.0ul/kg剂量时，频率及幅度均略有增加，但同对照组相比，差异无统计学意义。表明组合物悬液对犬的呼吸系统无显著影响，如表2所示。
表2对麻醉犬呼吸频率及幅度的影响
注：对照组和实验组与用药前比较p均＞0.05。
心血管系统的影响：
2.1平均动脉压和心率的影响，组合物悬液静脉注射1.0、2.0ul/kg时，对麻醉犬的心率计平均动脉压无明显作用，同对照组及用药前相比，差异均无统计学意义(p＞0.05)，表明组合物悬液在本剂量时无心血管刺激作用，如表3和表4所示。
表3对麻醉犬平均动脉压的影响(kpa)
注：与用药前比较p＞0.05。
表4对麻醉犬心率的影响(次/min)
注：与用药前比较p＞0.05。
2.2心电图检测，静脉注射组合物悬液0.5、1.0、2.0ul/kg计量时，对麻醉犬心电图无明显作用，其各波间隔时间及电压振幅均在正常范围内波动，用药前后及用药组同对照组相比，均未发现差异有统计学意义，表明组合物悬液在本实验所用剂量下，对麻醉犬的心电图无影响，如表5所示。
表5对麻醉犬ⅱ导联心电图(ecg)的影响
上述组合物悬液静脉滴注后，对小鼠的一般行为、协调运动及自主活动，和对麻醉犬的心率、收缩压、舒张压及平均动脉压检测均无不良影响，表明组合物悬液静脉滴注的安全性较高。
急性毒性实验
受试者：a组啮齿类动物组：周龄6-9周的sd大鼠，体重180-240g，其包括60只sd大鼠的实验组和20只sd大鼠的对照组，实验组和对照组的雌雄比例均为1:1；b组非啮齿类动物组：月龄6-10个月beagle犬，体重8-15kg，其包括30只beagle犬的实验组和10只beagle犬的对照组，实验组和对照组的雌雄比例均为1:1。
实验方法：给药后2h同时观察各组观察动物反应，以后每天上、下午各观察一次，连续观察15天。
给药量：a组实验组每20只分别按照起始剂量a、中间剂量b和最大剂量c给药；b组实验组每10只分别按照起始剂量a、中间剂量b和最大剂量c给药；
a组：a.大鼠2.5ml/kg、b.大鼠5.0ml/kg、c.大鼠10.0ml/kg；
b组：a.beagle犬1.25ml/kg、b.beagle犬2.5ml/kg、c.beagle犬5.0ml/kg。
实验记录：参与实验的大鼠及beagle犬在实验周期内皆未出现死亡，体重稍有增加，大鼠平均增加10-15g，犬平均增加400-900g，实验组与空白对照组相比无明显差别。除最大剂量组及空白对照组出现阳性表现外，其余各组均为出现有意义的阳性体征，如表6所示，症状阳性表现用“+”表示，阴性表现用“—”表示，并记录了阳性表现的出现比例及起始时间(实验结束后对全部实验动物进行大体解剖，其组织器官的体积，颜色，质地均未见异常。
表6急性毒性实验结果
注：
(1)a组实验组大鼠偶发呼吸急促(1/20)，给药后30min出现，持续2min。
(2)a组实验组大鼠自发活动增多(3/20)，表现为神经系统兴奋状态，给药后3-15天间歇性出现。
(3)b组实验组beagle犬自发活动增多(2/20)，表现为神经系统兴奋状态，给药后7-14天间歇性出现。
(4)a组空白对照组大鼠出现困倦(2/20)，表现为偶尔昏睡，正常饲养第8-13天间歇性出现。
(5)b组空白对照组beagle犬出现困倦(1/20)，表现为偶尔昏睡，正常饲养第9-11天间歇性出现。
(6)b组实验组beagle犬出现小微血管扩张(1/20)，表现为舌、耳、结膜、阴囊发红、体热等，给药后5-13天出现。
实验结果
1.最高剂量下，a组实验组大鼠偶发的呼吸急促，持续时间很短，考虑可能与该大鼠心肺功能不全有关。
a组实验组3只大鼠及b组实验组2只beagle犬在给药后分别出现了间歇性的自发活动增加，探究，梳理毛发，运动增加，考虑是由于干细胞增殖，增加了神经细胞的数量，刺激中枢神经系统使其表现为兴奋状态。
另有a组对照组2只大鼠及b组对照组1只beagle犬出现昏睡状态，但易警醒而恢复正常活动，睡眠中枢短暂受到抑制，考虑可能与饲养环境较封闭，运动减少，通风不良有关。
b组实验组1只beagle犬出现体表微血管扩张，微循环加快，考虑为心输出量增加，或局部环境温度过高所致。
2.起始剂量a到中间剂量b均未出现有意义的阳性表现，说明组合物悬液作用于动物的安全性高，最高剂量下偶发中枢神经兴奋，说明其不良反应少，受试者安全范围为大鼠0～5.0ml/kg，beagle犬0～2.5ml/kg，毒性反应小，对心脑肺等重要器官基本无不良影响，并且短时间内可恢复正常。
长期毒性实验
受试者：spf级sd大鼠，雌雄各半，体质量80-90g。动物饲养于spf级实验动物实验室条件下，室内温度19-22℃，相对湿度40％-50％，每笼6只动物，给予鼠全价颗粒饲料，自由摄食、饮水。
实验方法：
将组合物悬液每日上午以最大剂量2.0ul/kg尾静脉注射给药1次，对照组注射等剂量的蒸馏水，每周称1次体重并记录摄食量，根据体重的变化重新计算给药量。根据急性毒性试验、药效学试验结果确定组合物悬液高剂量组2.0ul/kg、中剂量组1.0ul/kg、低剂量组0.5ul/kg。
观察指标：
1.一般观察给药期间，观察动物的外观，行为活动，饮食、粪便及被毛的情况，并记录体质量(每周称重1次)、进食量、进水量。
2.血液学检查采用美国雅培cd-1200型全自动血球记数仪，测定红细胞(rbc)、白细胞(wbc)、血小板(plt)、红细胞压积容量(hct)、红细胞平均体积(mcv)、平均血红蛋白含量(mch)、平均血红蛋白浓度(mchc)、淋巴细胞数目(lym)、单核细胞数目(mid)、粒细胞数目(gra)、红细胞分布宽度(rdw)和血红蛋白(hgb)。
3.血液生化检测采用日本日立7610型自动仪，测定丙氨酸氨基转移酶(alt)、总蛋白(tp)、白蛋白(alb)、尿素氮(urea)、肌酐(crea)和总胆红素(tb)等。
4.系统尸解及脏器系数全面细致观察每只动物的脏器，并称量每只动物的心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺和脑等，并计算脏器系数。
表7组合物悬液对给药180d末期大鼠血液学指标的影响
表8组合物悬液对停药15d后大鼠血液学指标的影响
表9组合物悬液对给药180d末期大鼠血液生化学指标的影响
表10组合物悬液对停药15d后大鼠血液生化学指标的影响
表11组合物悬液对给药180d末期大鼠脏器系数的影响
结论：大鼠长期毒性实验以3个剂量(即2.0，1.0，0.5ul/kg)连续给药6个月及停药2周后，对大鼠一般状况、体质量增长无明显影响；血液学指标及血液生化学指标均在正常范围内，对大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑等重要脏器重量，脏器系数与对照组比较均无显著差异，并对大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、睾丸、子宫等重要脏器进行组织检查也未见明显病理改变。故本实验结果提示组合物悬液在大鼠6个月长期毒性实验中，未发现明显的毒性反应及延迟性毒性反应，可以安全地应用于临床。
血管刺激性、溶血、过敏性实验
材料：组合物悬液，其中干细胞的含量为8×107个/ml、5％葡萄糖注射液、甲醛、白蛋白、牛血清白蛋白、白百破三联疫苗和伊文思蓝。
受试动物：日本大耳白家兔，体重2-3kg，雌雄兼用；荷兰豚鼠，体重200-250g，雄性；sd大鼠，体重180-220g，雄性。
血管刺激性实验
实验开始前，动物预先饲养1周以观察其活动表现，动物室温度22-24℃，湿度40％-60％。取家兔3只，右侧耳缘静脉以无菌操作方法注射量为8.3ml/kg(注：由于该系列实验涉及到受试物的耐受性，因此选用干细胞悬液范围中的最大浓度进行试验)的组合物悬液，左侧耳缘静脉注射等体积5％葡萄糖注射液，1次/d，连续给药5d。上述两组均分别于末次给药后96h，肉眼观察注射部位有无红肿、充血等刺激现象，处死动物，以耳缘静脉注射点至向心方向，连续取3段血管连同周围组织，每段1cm，用10％甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切5μm薄片，he染色，光镜下做组织学检查，另一侧对照血管也同法处理。
溶血实验
制备2％兔红细胞混悬液，取健康家兔1只，自心脏取血约20ml，置于三角瓶中，用玻璃棒搅拌，除去纤维蛋白，然后将血移入刻度离心管内，加入生理盐水10ml，混匀后离心5min(2000-2500r/min)，去除上清液，再加生理盐水混匀离心，反复洗涤3-4次，至上清液无色透明，将所得红细胞按其容积用生理盐水稀释成2％的混悬液。
取干净试管7支，编号排列于试管架上，按配比量依次加入2％兔红细胞混悬液和生理盐水，混匀后，置于37℃恒温箱中30min，然后于1-5管中加入不同量的组合物悬液，分别为1ml、2ml、3ml、4ml和5ml，6号管中加入1ml生理盐水，7号管中加入1ml溶血素。(第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管)，摇匀，置37℃恒温箱中进行温育，观察0.25、0.5、0.75、1、2、3和24h有无溶血及凝集情况。
结果判定：
全溶血：溶液澄明红色，管底无细胞残留。
部分溶血：溶液澄明红色或棕色，管底有少量红细胞残留。
无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明。
凝集：虽不溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不能分散。
全身主动过敏实验
实验开始前，动物预先饲养1周以观察其活动表现，动物室温度22-24℃，湿度40％-60％。
取48只健康雄性豚鼠，随机分成5％葡萄糖注射液组、阳性药物组(白蛋白组)、组合物悬液大剂量组和组合物悬液小剂量组，每组12只。分别给各组豚鼠隔日腹腔注射5％葡萄糖注射液、阳性药物25mg/kg，组合物悬液4.16ul/kg，体积为0.5ml，共注射3次，然后每组内分成两批，第1次给药后14d及21d分别静脉注射5％葡萄糖注射液、阳性药物50mg/kg和组合物悬液16.64ul/kg，体积为1ml，观察豚鼠在静脉注射后30min内有无表12中的躁动、搔鼻、竖毛、呼吸困难、痉挛、甚至死亡等过敏反应症状。
表12过敏反应症状
被动皮肤过敏实验
制备大鼠含ige的抗血清，清取4只健康雄性sd大鼠，按注射剂大鼠同种被动皮肤过敏试验的要求，分别腹腔注射5％葡萄糖注射液、牛血清白蛋白25mg/kg、组合物悬液4.16ul/kg和白百破三联疫苗1ml/只，隔日1次、共3次。11d后眼眶取血，分离血清，－20℃保存，备用。
实验开始前，动物预先饲养1周以观察其活动表现，动物室温度22-24℃，湿度40％-60％。
取16只健康雄性sd大鼠，随机分为5％葡萄糖组、阳性组(牛血清白蛋白组)、组合物悬液大剂量组和小剂量组。分别在各组大鼠背中线两侧距脊柱约1.5cm处备皮，4cm×4cm。
取上述含ige的抗血清，用5％葡萄糖注射液按1:2、1:4、1:8和1:16比例分别稀释成4个稀释度，将稀释的抗血清按逆时针方向(左上-左下-右下-右上)皮内注射于大鼠背部预先备皮部位，每一稀释度注射一个点，每点注射0.1ml。致敏24h后，各组静脉注射与致敏剂量相同的激发抗原加等量的0.8％伊文思蓝染料共1ml，进行激发。30min后处死各组大鼠，测量皮肤内层的蓝色反应斑直径，直径大于5mm者判定为阳性。不规则斑点的直径为长径与短径之和。
结果：
1.血管刺激性实验：给药组3只家兔耳缘静脉注射部位均未见红肿、充血等刺激现象。光镜病理组织学检查：组合物悬液给药组和5％葡萄糖对照组家兔耳缘静脉注射部位血管结构完整，血管内皮细胞无肿胀、变性、坏死，管壁无炎细胞浸润，管腔内无血栓形成。
2.溶血性实验：在0.25-3h及24h内除第7管(阳性对照管)溶液呈现澄明红色，其余6管均末见澄明红色，且红细胞全部下沉，上层液体无色澄明，经振摇后红细胞能均匀分散。表明组合物悬液无溶血及无凝集作用。
3.全身主动过敏实验：5％葡萄糖注射液组、组合物悬液大剂量组、组合物悬液小剂量组在静脉给药30min后，豚鼠活动正常，未出现1-20级反应症状，判定为过敏反应阴性。而阳性药组豚鼠出现痉挛、抽搐、休克死亡，判定为过敏反应极强阳性。
4.被动皮肤过敏实验：组合物悬液大剂量组、组合物悬液小剂量组和5％葡萄糖注射液组大鼠背部皮肤均未见蓝色反应斑点。阳性组注射部位皮肤均不同程度的出现蓝色斑点反应，其中1:16处有3例出现蓝斑，1:8处有4例出现蓝斑，1:4与1:2处6例均出现蓝斑，蓝斑直径均大于5mm，判定为阳性反应。结果表明：组合物悬液无同种被动皮肤致敏作用。
结论：
本实验采用的方法简便、准确、可靠，4项指标检测组合物悬液均未出现阳性结果，说明组合物悬液对血管无刺激性，无溶血作用，全身主动过敏反应阴性，无同种被动皮肤致敏作用。表明组合物悬液安全性好，可供临床应用。
试验例1
使用实施例1至3任一的所述组合物，对6-羟多巴胺损毁制备的帕金森病大鼠模型行为学的影响进行试验。
以体重250～300g的健康雄性wistar大鼠80只为受试者，以60只雄性wistar大鼠作为建模群体，
1)构建模型
a.建模群体的大鼠称重并腹腔注射戊巴比妥钠48mg/kg麻醉。
b.将麻醉后的大鼠固定于江湾i型脑立体定位仪上，头部正中切口，剥离骨膜，止血。参照george图谱，用牙科钻在颅骨顶钻孔，定位坐标为：门齿与耳杆平行，前囱后3mm，旁开3.0mm，颅骨表面下9.0mm，将自制同心套管插入右侧ns区(套管外径0.7mm，内管外径0.4mm，内管比外管前端长1.5mm),用502胶和自凝牙托粉固定。
c.微量注射器吸6-ohda溶液4μl(含9.0μg6-ohda和8.8μg抗坏血酸)，速度为1μg/min，注射后留置4min退出，缝合皮肤。
d.21天参照francois的实验方法(包括行动迟缓实验、抓握实验和尾强直实验记录强直症状的变化、震颤实验)记录帕金森氏病的三大症状.并记录肌电图变化，以鉴别大鼠模型建立是否成功。判断标准如下：①出现行动迟缓实验持续35min②抓握实验持续55min、尾强直实验持续30min③震颤频率在48次/分以上和肌电图群放电位频率在4-8次/秒。
2)对比试验
选取建模成功的60只大鼠，并将其随机分为40只的试验组和20只模型对照着，以及以20只雄性wistar大鼠作为空白对照组
分别将试验组的40只大鼠自尾静脉注射组合物悬液0.5ml/100g。模型对照组的20只大鼠注射生理盐水0.5ml/100g。空白对照组大鼠不予处理。
观察方法：以上大鼠在相同环境下正常饲养12-16周，分别进行以下定量观察：1)直杆实验：测试实验动物的运动协调和平衡能力；2)悬挂实验：检测实验动物的神经肌肉异常和运动力量；3)游泳实验：检测实验动物的体力和运动能力。
3)实验结果：
直杆实验
建模前，各组大鼠在塑料杆上的表现均为合格，水平放置和倾斜位置时都能在杆上不掉下来。
建模后，大鼠不能全部完成直杆实验，大多数大鼠在横杆倾斜到45度之前掉落横杆，能够完成的合格率仅有3％。
试验组大鼠进行干细胞悬液注射处理后，82％的大鼠经过训练能够完成该实验，而经生理盐水注射处理的模型对照组大鼠仍然无法完成该实验。
钢丝悬挂实验
建模前，各组大鼠在钢丝笼盖上的表现均为合格，能够紧紧抓住翻转过来的盖子而不掉下来。
建模后，大鼠不能完成该实验，大多数大鼠在持续悬挂60秒左右掉落，合格率不足1％。
在对试验组大鼠进行干细胞悬液注射处理后，90％的大鼠经过训练能够完成该实验，而经生理盐水注射处理的模型对照组大鼠仍然无法完成该实验。
游泳实验
建模前，对各组大鼠进行连续3天，每天20分钟的适应性训练，全部大鼠在水槽中的表现均为合格，能够连续在水中运动，下沉次数较少。
建模后，大鼠不能全部完成该实验，95％的大鼠出现了易疲劳，反复下沉的表现。
在对试验组大鼠进行干细胞悬液注射处理后，89％的大鼠经过训练能够完成该实验，而经生理盐水注射处理的模型对照组大鼠仍然无法完成该实验。
试验例2
受试者：76岁男性帕金森病；
试验过程：经静脉滴注组合物悬液一次，用量分别为45ml的脐血提取物浓度为6.2×105个/ml组合物悬液；
试验效果：
受试前，3年前开始出现随意运动困难，动作缓慢，吃力。后逐渐出现右手静止性震颤，头部震颤，面部表情僵硬，走路时步幅缩短，步态慌张，双臂肌肉强直。睡眠差，易激惹。
受试45天后，该患者情绪明显稳定，精神好，头部震颤频率逐渐减低，肌肉较从前松弛，表情较从前增多，行走较从前稳健，睡眠规律，质量较前有明显改善，经自体对比可见，脐带血干细胞进入体内后，可以自动识别并移行至细胞损伤部位，分裂增殖成新的黑质细胞，替代退行的神经细胞分泌多巴胺，抑制乙酰胆碱的作用，从而缓解“震颤麻痹”的症状，逐渐恢复大脑功能和自主行为能力。
试验例3
受试者：68岁男性以震颤为首发症状的帕金森病；
试验过程：经静脉滴注组合物悬液二次，间隔2个月，用量分别为50ml的脐血提取物浓度为5.7×105个/ml组合物悬液和为55ml的脐血提取物浓度为4.9×105个/ml组合物悬液。
试验效果：
受试前，2年前左手手指开始出现缓慢节律性震颤，且症状表现逐渐加重，现已波及头部与左上肢。四肢及面部肌肉僵直，随意运动受限，走路步距小，呈慌张步态，对事物反应明显变慢。
受试6个月后，以上症状明显缓解，震颤频率降低，肌张力较前有所降低，精神状态较好，睡眠佳。
试验例4
受试者：82岁女性帕金森病患者，同时伴有老年性痴呆症状。
试验过程：经静脉滴注组合物悬液，用量为60ml的脐血提取物浓度为5.8×105个/ml组合悬液；
试验效果：
受试前，5年前逐渐出现震颤麻痹的症状，认知功能减退，自发运动减少，动作困难吃力，时常健忘，不能处理日常事务。
受试3个月后，患者震颤麻痹的频率较前明显降低，可做简单的自主运动，可主动与人交流，认知障碍也有所缓解。
试验例5
受试者：79岁男性重度帕金森病；
试验过程：经静脉滴注组合物悬液三次，每次间隔2个月，用量分别为58ml的脐血提取物浓度为5.5×105个/ml组合物悬液，61ml的脐血提取物浓度为5.8×105个/ml组合物悬液和60ml的脐血提取物浓度为5.7×105个/ml组合物悬液；
试验效果：
受试前，5年前出现震颤麻痹的症状，后逐渐出现僵直，协调功能障碍，累及运动功能，动作笨拙，缺乏面部表情，说话含糊，音量低，免疫功能低下，经常感冒，且情绪上伴有焦虑抑郁。
受试6个月后，经家属反馈患者精神状况得到改善，面部肌肉的僵直有所缓解，8个月后该患者震颤频率较前明显降低，自主动作较前灵活，可主动与他人进行简单的日常交流，且语句较清晰，音量增高。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。