纳米纤维膜与干细胞层层叠加的人工组织工程皮肤及其制备方法与流程

本发明属于高分子材料和生物医用材料技术领域，涉及一种纳米纤维膜与干细胞层层叠加的人工组织工程皮肤及其制备方法。

背景技术：

目前，大规模烧伤等人类皮肤组织损伤都是通过自体或异体皮肤移植的方法来治疗，这不仅造成供皮区新的创伤缺陷，而且经常受到供皮来源的限制。为解决这一技术难题，随着高分子生物材料的兴起，利用组织工程技术构建模仿细胞外基质的皮肤支架来治疗皮肤损伤成为了不错的选择。但至今没有真正理想的皮肤替代物得以应用。

理想的人工皮肤需要具备柔软、舒适、透气透湿的特点，能够与创面有良好的贴合，同时又需要有一定的延展性、韧性和机械强度。另外，人工皮肤需要提供一个良好的材料-细胞界面，以利于自身上皮细胞的长入、促进新生皮肤附属器的再生、抵御细菌入侵，以起到促进创面愈合、皮肤功能再生的目的。现有技术中多采用水凝胶与高分子复合膜作为人工皮肤。但壳聚糖、透明质酸钠、硫酸软骨素、硫酸皮肤素等水凝胶存在制成的人工皮强度不够，透气性差的问题，而且随着用量增加，有抑制成纤维细胞生长的作用。此外，聚氨酯、硅橡胶、聚乙二醇或对苯二甲酸乙二醇酯等医用高分子材料虽然可改善人工皮肤的强度问题，但是亲水性不佳，且体内降解速度缓慢、存留时间较久甚至不降解，造成异物残留，引起无菌性炎症，影响自身细胞在创面的定植和生长，而且由于这些材料不能参与进行生理代谢，往往只能用做外层敷料。故而利用支架与细胞的相互作用设计一种工艺简单，易于量产，容易保存，生物相容性好，应用便捷，价格低廉的人工组织工程皮肤，对于快速、高效修复创面具有重要意义。

干细胞是一种具有自我更新能力和多系分化潜能的原始细胞，是细胞移植组织再生及修复的理想细胞。虽然胚胎干细胞是最原始的及最有分化潜能的干细胞，但目前来源十分有限。而经过高表达干细胞因子诱导的干细胞也称ips细胞，其虽然具有诸多胚胎干细胞的特性，但因制备方法复杂，还涉及到使用病毒载体等安全性问题，目前临床应用还存在很多瓶颈。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,msc)是存在于人体组织中具有多系分化潜能的一种亚全能干细胞群，如骨髓干细胞、脂肪干细胞、脐带血干细胞等。脂肪干细胞来源丰富，比如可以取材于身体上多余的脂肪，游离方法简便，具有自我更新及多潜能分化能力，是一种理想的组织再生和修复材料。

目前已有异种脱细胞基质材料用于临床。因为经过脱细胞处理，材料内不存在异种细胞，这样将避免了人体对异种材料产生的免疫反应。但因为没有细胞成分，脱细胞基质材料因此是缺乏生物活性的材料，其对创伤、组织缺损等的修复作用有限。间充质干细胞大量存在于组织中，如来源于脂肪组织的脂肪干细胞等。但是目前干细胞用于组织器官修复的细胞治疗存在诸多问题，虽然有临床应用报道，临床效果不确定。特别是用于外表创伤修复、或者损伤组织或器官的替代，如果没有细胞外基质材料的支撑，干细胞很难发挥作用。

尽管目前有很多研究者研制开发了多种人工组织工程皮肤，多数基质为胶原凝胶或海绵，目前并没有任何通过纯天然高聚物来制备纳米纤维膜并结合层层自组装技术应用于组织工程皮肤的文献，申请号为“cn201410423055.3”与“201610353226.9”的专利分别报道了一种用于促进心肌组织再生和干细胞监测的壳聚糖-丝素蛋白复合纳米纤维多功能补片的制备方法与一种静电纺高壳聚糖含量的抗菌伤口敷料的制备方法，但并没有进行创面愈合效果的相关研究。申请号为“201610499353.x”与“201611008057.1”的专利分别报道了一种微纳米复合双层皮肤支架及其制备方法与一种柔性人工皮肤及其制备方法，但并无显著改善细胞在组织内分布与创面愈合促进效果的相关研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种纳米纤维膜与干细胞层层叠加的人工组织工程皮肤及其制备方法，其由纳米纤维膜和干细胞两部分交替组装复合而成，可用于各种组织的再生和修复。本发明是通过以下技术方案来实现：

一种纳米纤维膜与干细胞层层叠加的人工组织工程皮肤，包括多层干细胞层和多层多孔的具有三维结构的纳米纤维膜，干细胞层与纳米纤维膜交替层叠。

其中，所述交替层叠，指的是干细胞层与纳米纤维膜层层叠加，两者通过相互间隔的顺序叠加，使得干细胞层的两侧为纳米纤维膜，纳米纤维膜的两侧为干细胞层。

优选地，多层纳米纤维膜层叠形成纳米纤维支架；干细胞层中的干细胞作为种子细胞分布在纳米纤维膜表面。

优选地，所述干细胞为脂肪干细胞。

优选地，所述纳米纤维膜由聚己内酯和β-环糊精制备而成。

优选地，β-环糊精中包络有布洛芬。

优选地，纳米纤维膜的透氧率为50～60％，纳米纤维膜中的纳米纤维的直径为200～600nm。

所述的纳米纤维膜与干细胞层层叠加的人工组织工程皮肤的制备方法，包括步骤：

1)制备干细胞；

2)将干细胞与纳米纤维膜进行层层自组装共培养；

其中，步骤2)包括步骤：

21)以培养皿作为接收器，通过静电纺丝技术制备纳米纤维膜；

22)将干细胞接种在培养皿中；

23)重复步骤21)和22)，直至完成设定的接种层数；

24)在培养皿中，将纳米纤维膜与干细胞进行共培养。

优选地，在步骤21)中，在超净工作台中，通过静电纺丝技术制备纳米纤维膜；其中，静电纺丝过程中施加的直流电压为10～35kv；静电纺丝过程中针头与培养皿的距离为5～20cm；静电纺丝过程中注射器由注射泵以0.5～2.0ml/h的速度驱动；静电纺丝过程中环境温度为5～35℃；静电纺丝过程中环境相对湿度为20～80％；静电纺丝的时间为1～5min。

优选地，在步骤22)中，相对于纳米纤维膜的面积，干细胞接种的数量为1×10⁴～2×10⁴个细胞/cm²。

优选地，还包括步骤:3)将步骤2)制备的人工组织工程皮肤经过杀菌后密封包装，冷冻保藏。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的纳米纤维膜与干细胞层层叠加的人工组织工程皮肤，其包括多层纳米纤维膜，纳米纤维膜多孔且具有三维结构，为细胞的黏附和生长提供合适的表面形态，利于细胞的粘附与生长；干细胞可以分泌各种细胞因子，促进细胞的增殖，有助于组织的再生和修复；干细胞分成多层，与纳米纤维膜交替层叠，这使得干细胞在整个人工组织工程皮肤中的分布更为均匀。动物实验证明，该人工组织工程皮肤可以显著改善细胞在组织内分布，促进创面愈合。如此，该人工组织工程皮肤可用于各种组织的再生和修复，特别是创伤愈合、减少疤痕形成、皮肤再生等。

附图说明

图1为为本发明利用脂肪干细胞与聚己内酯-β-cd纳米纤维膜制备人工组织工程皮肤的过程示意图。

图2-1、图2-2和图2-3为为本发明制备的纳米纤维膜的微观结构(场发射扫描电镜)，其中图2-1放大2000倍，图2-2放大7000倍，图2-3放大15000倍。

图3-1、图3-2、图3-3、图3-4、图3-5、图3-6为脂肪干细胞接种于聚己内酯-β-cd单层纳米纤维膜后的扫描电镜图，分别为接种后1，3，5，7，9，11天。

图4-1为单层纳米纤维膜-脂肪干细胞复合物的染色结果(红色：纳米纤维；蓝色：dapi)，该图显示，细胞只分布于单层纳米纤维膜表面(一侧)。

图4-2为多层lbl制备的人工组织工程皮肤的染色结果(红色：纳米纤维；蓝色：dapi)，该图显示，经过层层纳米纤维膜-脂肪干细胞叠加之后，细胞可均匀分布于纳米纤维膜表面与层间整个结构中，细胞密度较单层纤维膜接种可明显改善。

图5-1、图5-2、图5-3为本发明的人工组织工程皮肤的创面愈合试验结果。结果显示，不同处理方式对于创面愈合得效果存在明显差异，其中，图5-1为对照组(常规纱布覆盖组)，图5-2为单层纳米纤维膜-脂肪干细胞复合物覆盖组，图5-3为人工组织工程皮肤覆盖组。

图6-1、图6-2为本发明的人工组织工程皮肤覆盖创面至完全愈合后的he染色结果，其中图6-1对照组(未处理组)；图6-2人工组织工程皮肤组。

图6-3、图6-4为本发明的人工组织工程皮肤覆盖创面至完全愈合后的masson染色结果，其中，图6-3为单层纤维膜-脂肪干细胞复合物组；图6-3为人工组织工程皮肤组。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，其目的在于帮助更好的理解本发明的内容，但这些具体实施方案不以任何方式限制本发明的保护范围。

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种利用脂肪干细胞作为种子细胞与纳米纤维支架层层叠加的人工组织工程皮肤及其制备方法。将静电纺丝技术、高分子络合技术与纤维-细胞层层自组装技术相结合，制备具有良好的可塑性及适宜的力学特性、高度孔隙度的三维立体结构及生物相容性的组织工程皮肤，该纳米支架可调控生物降解速率，适合用于皮肤再生组织工程。

现有的脱细胞基质材料采用异种皮经脱细胞处理，使之成为不具抗原性的生物材料。由剩下的细胞外基质材料(主要由胶原和弹性蛋白组成)提供组织创面的覆盖，提供组织修复的支架而在临床应用中有一定的价值。但由于这种基质材料缺乏应有的和组织修复有关的细胞因子，其用途及有效性受到很大影响。大量研究表明，间充质干细胞如游离自脂肪的脂肪干细胞具有多分化潜能，可作为组织修复理想的种子细胞。间充质干细胞来源广泛，取材方便，免疫原性低，且不产生畸胎瘤，连续传代培养和冷冻保存后仍保留多向分化潜能，可作为组织修复理想的种子细胞。其中，脂肪干细胞(ad-msc)大量存在于脂肪组织，易于扩增，旁分泌作用和分化能力好，作为医学整形的废料，还可加以回收利用，具有良好的临床应用前景。所以，本发明采用脂肪干细胞作为组织工程皮肤的种子细胞。

当前，在人工组织工程皮肤支架领域，用于皮肤支架制备的材料大致分为两类：一类是天然生物衍生材料，如胶原、壳聚糖、透明质酸、羧甲基壳聚糖及丝素蛋白等。另一类是人工合成生物高分子材料，主要有聚乙交酯、聚己内酯、聚羟基烷酸酯、聚碳酸酯类等聚酯类材料；大多数皮肤支架都是运用生物材料通过静电纺丝技术来制造。虽然由静电纺丝得到的纳米纤维为细胞的黏附和生长提供合适的表面形态，利于细胞在支架上的粘附与生长，然而由静电纺丝制备的皮肤支架由于孔径太小，不利于细胞在深度方向上的迁移、增殖，且难以实现细胞在纤维支架上分布的有效调控，这限制了人工皮肤支架在皮肤损伤医学治疗领域中的应用。同时，作为干细胞生长的支架和外基质(ecm)，良好的亲水性、合适的表面电荷、适当的孔隙尺寸更适合细胞的附着生长。

根据以上特点，本发明通过静电纺丝技术，使聚己内酯-β-cd纳米纤维支架在纳米级水平加工为适合细胞生长分化的互相贯通的多孔三维微观结构，并可根据需要包被各种细胞因子或药物，还利用层层自组装(lbl)技术进行纤维-细胞层层叠加，从多个方面促进干细胞的附着和生长，提高干细胞治疗的效率。基于上述理由，本发明结合纳米纤维基质材料和间充质干细胞技术提供一种有生物学活性的生物材料，该生物材料可用于各种组织的再生和修复，特别是创伤愈合、减少疤痕形成、皮肤再生等。

如图1所示，将脂肪干细胞接种于聚己内酯-β-cd纳米纤维膜，借助层层自组装技术进行纳米纤维膜-脂肪干细胞层层叠加，从而形成人工组织工程皮肤。

脂肪干细胞分离培养、纯化、鉴定方法

实施例1、细胞分离纯化

脂肪组织转入预先装有pbs的无菌培养皿中，用眼科剪剪去外包膜与明显结缔组织，用pbs清洗两次后剪碎；将剪碎的脂肪组织转入50ml离心管中，加入0.2％ⅰ型胶原酶，置于37℃5％co2培养箱中2小时，每30min混匀一次；将消化至糊状的组织通过250目金属筛过滤，滤液转入15ml离心管中，1500rpm10min离心后，吸弃漂浮的脂肪块和上清液，pbs吹洗3次后离心，加入含10％fbs的dmem培养液用吸管轻轻吹打，使之再重悬；接种于预先装有培养基的培养瓶中，置于37℃5％co2培养箱中培养；静置24h后弃去培养基，用pbs清洗两次以去除未贴壁细胞，结缔组织与碎片，更换新鲜含10％fbs的dmem培养液，每隔2天换液，观察。

实施例2、脂肪干细胞鉴定

取培养的第3代细胞，吸出培养基后，先用pbs清洗两次，加入预热的0.25％胰酶消化，之后加入含10％fbs的dmem终止消化，轻轻吹打成单细胞悬液1000rpm条件离心5min后，弃去上清，pbs清洗两次；取10个上样管，每管加入1ml单细胞悬液，分别依次加入10μligg-fitc，igg-pe，鼠抗人cd29-fitc,cd44-fitc，cd49d-fitc，cd73-fitc，cd90-fitc，cd105-fitc，cd34-pe，cd45-pe单克隆抗体工作液；室温下避光孵育20min；pbs清洗两次以去除未结合抗体，500μlpbs重悬后采用流式细胞仪检测。

实施例3、细胞扩增

待细胞生长至80-90％汇合后进行传代，吸出培养基，先用pbs清洗两次，然后加入0.25％胰酶，置于37℃恒温培养箱2min，随后加入含10％fbs的dmem培养液中止消化，吸管轻轻吹打使细胞脱落，收集细胞，移入15ml离心管中。1000rpm5min，弃上清，pbs清洗两次，加入含10％fbs的dmem重悬细胞沉淀，按1:2密度接种于培养瓶中，加入含10％fbs的dmem置于37℃5％co2培养箱中继续培养，显微镜下观察细胞形态，获得扩增的脂肪干细胞。

实施例4、一种聚己内脂-β-cd纳米纤维膜的制备方法

在超净工作台内，将聚己内酯(pcl,mn＝70-90kda,sigmaaldrichco.,usa)溶解至质量比为1:(1～3)的n,n-二甲基甲酰胺—二氯甲烷混合溶液中，配置成质量浓度为8％的聚己内酯溶液；向聚己内酯溶液中加入β-cd，使得β-cd的质量分数为0.1％，加热至50～70℃，搅拌均匀，搅拌时间为6～12小时，得聚己内酯-β-cd溶液；

其中，β-cd中可以预先包络有布洛芬：称取摩尔质量比为1:10～1:1的β-cd与布洛芬混合物于干燥研钵中，在密封环境中向研钵中加入13％去离子水，室温研磨1～3h，将制好的包和物在真空干燥箱内35-60℃下干燥6-12h，得到β-cd/布洛芬包合物。

在超净工作台内，将获得的聚己内酯-β-cd溶液吸入静电纺丝设备的带金属针头的塑料注射器。注射器针头与作为收集器的培养皿相距10㎝，施加的直流电压为20千伏。注射器由注射泵以1.0ml/h的速度驱动，环境温度为25℃，相对湿度40％，静电纺丝时间为3min，获得纳米纤维膜，该纳米纤维膜被接收在培养皿中。

实施例5、一种聚己内脂-β-cd纳米纤维膜的制备方法

参照实施例4的方法，其中，聚己内酯-β-cd溶液中，聚己内酯的质量浓度为4％；β-cd的质量浓度为0.02％；针头与培养皿的距离为20cm，施加的直流电压为10千伏；注射器由注射泵以2.0ml/h的速度驱动，环境温度为35℃，相对湿度为20％，静电纺丝时间为5min。

实施例6、一种聚己内脂-β-cd纳米纤维膜的制备方法

参照实施例4的方法，其中，聚己内酯-β-cd溶液中，聚己内酯的质量浓度为12％；β-cd的质量浓度为0.2％；针头与培养皿的距离为5cm，施加的直流电压为35千伏；注射器由注射泵以0.5ml/h的速度驱动，环境温度为5℃，相对湿度为80％，静电纺丝时间为1min。

利用层层自组装技术(lbl技术)在聚己内脂-β-cd纳米纤维膜表面交替接种脂肪干细胞进行层层三维共培养

实施例7

在超净工作台内，参照实施例4～6的方法，制备被接收在培养皿中的纳米纤维膜，其中，培养皿的直径为30mm；将实施例3获得的扩增的脂肪干细胞接种在具有纳米纤维膜的培养皿中，接种的细胞悬浮液的体积为1ml，细胞数量为1×10⁵个细胞；然后再将该培养皿作为纳米纤维膜的接收器进行静电纺丝，静电纺丝结束后再进行脂肪干细胞接种，如此，每层接种1×10⁵个细胞，总共接种10层。因为整个过程发生在培养基表面，细胞在组装工程中一直保持水合状态，总共有10层细胞/纳米纤维交替的层层叠加成三维结构。将培养皿放置在37℃co2培养箱培养30分钟，然后加入dmem/f12补充培养基；继续培养1周以形成一种层层自组装形成的人工组织工程皮肤。其中dmem/f12培养液包括10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素。

其中，若在纳米纤维膜表面仅接种一次脂肪干细胞，借助层层自组装技术层叠纳米纤维膜和脂肪干细胞，通过培养后可以形成单层纳米纤维膜-脂肪干细胞复合物。

实施例8

参照实施例6的制备方法，其中，培养皿的直径为100mm，每层接种的脂肪干细胞的数量为1×10⁶个细胞。

实施例9

参照实施例6的制备方法，其中，培养皿的直径为100mm，每层接种的脂肪干细胞的数量为1×10⁶个细胞，总共接种20层。

实施例10实施例7～9所制备的层层自组装形成的人工组织工程皮肤，通过环氧乙烷杀菌后密封包装，包装袋中具有冷冻保护剂，包装后冷冻保存；包装后的工程皮肤可以冷冻在-78～82℃的冰箱中，也可以冷冻在液氮中。

实施例11

将1×1cm²的聚己内酯-β-环糊精纤维膜样品进行真空喷碳处理后，采用场发射扫描电子显微镜上观察纤维形貌，加速电压为15kv。所得实验结果展示在图2-1、图2-2和图2-3中，其中，图2-1放大2000倍，图2-2放大7000倍，图2-3放大15000倍。结果显示，制备的聚己内酯-β-cd纳米纤维膜呈交叉的立体3d结构，纳米纤维为粗细均一的细丝状，直径与孔隙分布均匀，呈无序排布结构，平均纤维直径为350±72nm。

实施例12

将脂肪干细胞接种于聚己内酯-β-环糊精纳米纤维膜上共培养3天后，采用戊二醛溶液在4℃下固定过夜后，用pbs清洗，经过一系列乙醇梯度脱水后进行真空冷冻干燥，干燥6h后进行真空喷碳处理，利用场发射扫描电镜观察细胞在纤维表面的生长情况。

图3-1、图3-2、图3-3、图3-4、图3-5、图3-6分别为为脂肪干细胞接种于聚己内酯-β-cd单层纳米纤维膜后1，3，5，7，9，11天的扫描电镜图。扫描结果显示，脂肪干细胞与纳米纤维膜黏附紧密，可明显观察到细胞的丝状与板状伪足伸展，细胞微丝互相缠绕或相互连接，呈网状结构，细胞部分或全部迁徙到材料孔隙内部，细胞表面及周围可见颗粒状结构，可能为细胞分泌的细胞因子或蛋白质，说明细胞生长状态良好。随着培养天数增加，部分细胞重叠呈三维生长，细胞间形成伪足识别，并形成复层(图3-6)，表明制备的纳米纤维膜具有良好的生物相容性，可显著促进脂肪干细胞的粘附与增殖。

实施例13

将脂肪干细胞接种于单层聚己内酯-β-环糊精纳米纤维膜，共培养3天，用pbs清洗3次；采用4％甲醛溶液(溶于pbs)固定30min，干燥5min；随后采用pbs清洗3次；并用0.5％tritonx-100渗透20min，随后用pbs进行清洗；采用dapi对细胞核在室温下进行染色10min(稀释度：1:1000)，随后采用罗丹明对纳米纤维进行染色5min。用pbs清洗来移除未结合的染色液，封片进行共聚焦观察。实验结果展示在图4-1中，其中，红色部分为纳米纤维，蓝色部分为dapi；该图显示，细胞只分布于单层纳米纤维膜表面(即只在纳米纤维膜一侧)。

将脂肪干细胞与聚己内酯-β-环糊精纳米纤维膜采用层层自组装技术进行交替叠加后，共培养3天，用pbs清洗3次；采用4％甲醛溶液(溶于pbs)固定30min，干燥5min；随后采用pbs清洗3次；并用0.5％tritonx-100渗透20min，随后用pbs进行清洗；采用dapi对细胞核在室温下进行染色10min(稀释度：1:1000)，随后采用罗丹明对纳米纤维进行染色5min。用pbs清洗来移除未结合的染色液，封片进行共聚焦观察。实验结果展示在图4-2中，其中，红色部分为纳米纤维，蓝色部分为dapi；该图显示，经过层层纳米纤维-脂肪干细胞叠加之后，细胞可均匀分布于纳米纤维膜表面与层间整个结构中，细胞密度较单层纤维接种可明显改善。

实施例14

选择健康、成年、清洁级sd大鼠，雌雄各半，体质量200-250g，spf级，由第四军医大学动物中心提供。按随机数字表法将其随机分为模型组与对照组，每组4只，共三组(对照组(常规纱布覆盖组)，单层纳米纤维膜-脂肪干细胞复合物覆盖组，人工组织工程皮肤覆盖组)，每组大鼠术前12h禁食。大鼠进行腹腔注射麻醉，剃净鼠背部毛，碘伏消毒背部皮肤，铺无菌巾单。在背部用模具量取2cm直径的皮肤范围，周边用实线标记，切除实线标记范围内的全层皮肤至深筋膜层，形成全层皮肤缺损创面。

对照组，单层油纱覆盖创面；

单层纳米纤维-脂肪干细胞复合物覆盖组：单层纳米纤维膜-脂肪干细胞复合物覆盖创面；

人工组织工程皮肤组：人工组织工程皮肤覆盖组

依照分组，将覆盖材料按照创面大小剪裁，覆盖创面，取材时间以各组动物的创面愈合时间为准。在创面形成后在不同周期对创面愈合情况进行实时监控，利用图像分析软件分析创面治疗前后照片，愈合率大于90％即判定为愈合。实验结果展示在图5-1、图5-2、图5-3中；其中，图5-1为对照组(常规纱布覆盖组)，图5-2为单层纳米纤维-脂肪干细胞复合物覆盖组，图5-3为人工组织工程皮肤覆盖组。结果显示，不同处理方式对于创面愈合得效果存在明显差异，经本发明制备的人工组织工程皮肤处理的创面愈合后再上皮化程度更高，说明该材料对于创面愈合的促进效果最佳。

实施例15

在实施例14的基础上，在创面完全愈合后取新生组织(带创缘部分)，经石蜡包埋、切片，采用常规苏木精-伊红(he)染色检测；检测结果展示在图6-1、图6-2中，其中，图6-1对照组(未处理组)，图6-2人工组织工程皮肤组。与对照组(无基底膜，表-真皮层分离)相比，人工组织工程皮肤组未观察到明显的表-真皮层分离，且可观察到真皮层有部分新生血管。

在创面完全愈合后取新生组织(带创缘部分)，经石蜡包埋、切片后进行烘片、脱蜡、梯度入水，漂洗后，依次采用r1，r2，r3，r4液进行染色(碧云天染色试剂盒)，中性树胶封片，采用荧光显微镜观察组织内胶原纤维、血管与其他皮肤结构。实验结果展示在图6-3、图6-4中，其中，图6-3为对照组(未处理组)；图6-4为人工组织工程皮肤组。masson染色结果显示，本发明制备的人工组织工程皮肤具有优良的体内降解性能，并且在材料植入后有新生血管生成。实验结果证实：本发明制备的人工组织工程皮肤在同一植入周期内具有更好的体内降解性能，且纤维内部可观察到新生血管生成。

formhals于1934年首次研发出一种借助高压静电场激发聚合物的带电射流，使射流固化得到超细结构的纳米纤维，通过该方法制备的纳米纤维具备超细纤维直径、较大比表面积和三维立体结构等独特优势，这使其逐渐成为皮肤创面修复领域的研究热点。本发明采用静电纺丝技术，其原因在于:首先，静电纺丝技术所构建的组织工程支架在结构上具有模拟细胞外基质(extracellularmatrix,ecm)的作用，可以促进成纤维细胞与角质形成细胞的粘附、增殖与迁移；其次，本发明的静电纺丝溶液中以具有良好生物相容性的聚己内酯为原料，这种纳米纤维支架可显著加速创面愈合。第三、β-cd(β-环糊精)具有外缘亲水而内腔疏水的特殊结构，可通过形成主客体包络物从而提高包和物的稳定性与药物缓释能力。本发明在此基础上，利用纳米纤维膜-细胞层层自组装的新技术进行纳米纤维层层叠加以实现细胞组装构成三维结构，这种三维结构可以良好控制细胞分布，允许共培养多种细胞，并且在物理上分隔各种细胞却不影响其物质交换。申请者所在实验室及课题组王红军最近建立起一种新兴的通过纳米纤维层层叠加实现细胞组装的技术，并已经成功将这种技术运用于构建三维组织(us20080112998a1)。在这种层层叠加细胞组装中，细胞被添加到纳米纤维膜之间。每层细胞层的细胞种类和密度以及每层纤维膜的组成和厚度都可以根据需要调节。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:

1)脂肪干细胞来源丰富，获取方法简单；

2)脂肪干细胞具有多分化潜能性，能分化成各种胚层的细胞，如上皮细胞、神经细胞、肌肉细胞、成纤维细胞等；

3)脂肪干细胞能分泌多种细胞因子，如血管生长因子、表皮生长因子(egf)、血小板衍生生长因子(pdgf)等，可以促进组织细胞再生；

4)因脂肪干细胞取自自身，因此不具抗原性；

5)静电纺丝聚己内酯组织工程支架在结构上具有模拟细胞外基质(extracellularmatrix,ecm)的作用，可以促进脂肪干细胞的粘附、增殖与迁移；并可显著加速创面愈合；

6)β-cd具有外缘亲水而内腔疏水的特殊结构，可通过形成主客体包络物从而提高包和物的稳定性与药物缓释能力；

7)利用纳米纤维-细胞层层自组装的新技术进行纳米纤维层层叠加以实现细胞组装构成三维结构组织。这种三维结构可以良好控制细胞分布，允许共培养多种细胞，并且在物理上分隔各种细胞却不影响其物质交换。