本发明涉及生物医药工程领域，尤其是涉及一种羊膜干细胞凝胶及其制备方法和应用。
背景技术：
自体富血小板血浆(platelet-richplasma,prp)是自体血经分离产生的血小板浓缩物，自体prp来源于自体，安全性能好，可从根本上排除了疾病传播和免疫排斥等问题。大量临床研究报道，prp含有大量的各种血小板源性细胞生长因子，具有促进多种组织修复的作用，能促进骨和软组织的修复。prp促进骨缺损修复可能主要基于以下两种机制：一种为prp在激活剂作用下活化为富血小板凝胶(platelet-richgel,prg)，其中含有大量纤维蛋白原，能封闭创面，促进组织收缩和愈合；另一种为聚合过程中血小板收缩、脱颗粒释放多种高浓度生长因子，包括血小板衍生生长因子(pdgf)、转移生长因子(tgf-β)、血管内皮生长因子(vegf)和表皮生长因子(egf)等，这些细胞生长因子中最重要的是pdgf和tgf-β，prp的作用是多种生长因子通过不同途径形成一系列信号转导，激活相应基因表达来完成的，在组织修复与重建中起着重要作用：pdgf可刺激骨髓基质干细胞的有丝分裂，增加成骨细胞数量；还可刺激内皮细胞的有丝分裂，促进移植区的毛细血管生长，并增加胶原蛋白合成的能力；tgf-β则可促进前成骨细胞增殖并抑制骨吸收。prg中其他生长因子也同时具有良好的促进骨与软骨修复和再生的作用。因而国外许多发达国家已将prp用于临床治疗退化性关节炎，通过关节腔注射自体prp，治疗有效率达到80％以上。所以，自体prp在生物医学上具有重要的应用价值和广阔的开发前景
羊膜干细胞来自人的羊膜，单层排列生长在面向羊水的一面，呈上皮样结构，每张人的羊膜约有1亿个这种细胞。羊膜属于胎盘组织，由受精卵发育至第8天的囊胚内细胞团分化而来。目前已知，羊膜干细胞保留胚胎干细胞特性，能向三个胚层组织分化，具有较强的分化能力；具有较好的免疫耐受能力，移植时无需hla或基因配型；能够分泌多种抗炎因子，具有很好的抗炎症功能；因缺乏端粒酶，在细胞体内不会增殖，也就不会致癌，因而移植是安全的；人的羊膜容易取得，能够拿到大量细胞，制备工艺简单，质量容易得到控制。羊膜干细胞的这些特征，完全能够满足干细胞移植的标准要求，具有临床广泛应用的美好前景。
羊膜干细胞直接应用于创面时，其活性容易丢失，不能长时间维持，效果不佳。
技术实现要素：
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供一种高活性、活性维持时间长、修复效果好的羊膜干细胞凝胶。
本发明采用如下技术方案实现：一种羊膜干细胞凝胶，以重量份计，由如下组分组成：
优选地，所述的羊膜干细胞凝胶，以重量份计，由如下组分组成：
优选地，所述富血小板血浆来自用血细胞分离机直接采集的浓缩血小板(机采血小板)、静脉采集的全血(抗凝血)经两次离心法分离制备的血小板浓缩液(富浆法手工血小板)或商业富血小板血浆。
本发明还提供一种羊膜干细胞凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(a)凝胶前驱体溶液的制备
将羊膜干细胞、富血小板血浆、甘油、壳聚糖、棕榈酸、苯氧乙醇、三乙醇胺、谷胱甘肽、右旋糖酐、去离子水、聚丙烯酸钠、透明质酸钠、α-红没药醇、异壬酸异壬酯、肉豆蔻酸异丙酯、n-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯压敏胶、环聚二甲基硅氧烷、丙烯酸酯类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物和丙烯酸羟乙酯-丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物混合形成的亲水共聚物制成水溶液即凝胶前驱体；
对于易溶于水的物质，直接溶解即形成水溶液；
对于不溶于水的物质，通过改变条件溶解，具体为冷冻研磨、消化溶解或加温溶解；
(b)浸泡
在凝胶未形成之前，将羟乙基纤维素浸泡于所述前驱体溶液中；
(c)凝胶过程
经过化学凝胶或物理凝胶形成羊膜干细胞凝胶。
本发明所述的羊膜干细胞凝胶在制备适用于软/硬组织缺损、皮肤/粘膜难愈性损伤或溃疡、关节软骨退行性变、缺血性组织坏死等修复治疗的基质胶中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的凝胶具有很好的修复功能和保湿功能，并可实现富血小板血浆和羊膜干细胞活性物质的缓释，羊膜干细胞的增殖效果好，活性高，活性维持时间长，微环境下具有更好的组织修复功能，对难愈伤口、软骨损伤都有很好的效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明一种羊膜干细胞凝胶作进一步的详细说明。
实施例1
一种羊膜干细胞凝胶，以重量份计，由如下组分组成：羊膜干细胞60份，富血小板血浆50份，甘油75份，壳聚糖60份，棕榈酸12份，苯氧乙醇7份，三乙醇胺17份，谷胱甘肽5份，右旋糖酐7份，去离子水600份，聚丙烯酸钠10份，透明质酸钠15份，α-红没药醇5份，羟乙基纤维素10份，异壬酸异壬酯8份，肉豆蔻酸异丙酯3份，n-羟甲基丙烯酰胺5份，聚丙烯酸酯压敏胶28份，环聚二甲基硅氧烷6份，丙烯酸酯类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物12份，丙烯酸羟乙酯-丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物5份。
所述富血小板血浆来自用血细胞分离机直接采集的浓缩血小板(机采血小板)、静脉采集的全血(抗凝血)经两次离心法分离制备的血小板浓缩液(富浆法手工血小板)或商业富血小板血浆。
所述羊膜干细胞凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(a)凝胶前驱体溶液的制备
将羊膜干细胞、富血小板血浆、甘油、壳聚糖、棕榈酸、苯氧乙醇、三乙醇胺、谷胱甘肽、右旋糖酐、去离子水、聚丙烯酸钠、透明质酸钠、α-红没药醇、异壬酸异壬酯、肉豆蔻酸异丙酯、n-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯压敏胶、环聚二甲基硅氧烷、丙烯酸酯类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物和丙烯酸羟乙酯-丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物混合形成的亲水共聚物制成水溶液即凝胶前驱体；
对于易溶于水的物质，直接溶解即形成水溶液；
对于不溶于水的物质，通过改变条件溶解，具体为冷冻研磨、消化溶解或加温溶解；
(b)浸泡
在凝胶未形成之前，将羟乙基纤维素浸泡于所述前驱体溶液中；
(c)凝胶过程
经过化学凝胶或物理凝胶形成羊膜干细胞凝胶。
所述的羊膜干细胞凝胶在制备适用于软/硬组织缺损、皮肤/粘膜难愈性损伤或溃疡、关节软骨退行性变、缺血性组织坏死等修复治疗的基质胶中的应用。
为了进一步证明本发明所述凝胶的疗效，申请人还分别进行了以下临床试验及分析：
1、方法与资料
两个试验中心共有200例患者入选，男女患者各100例，但由于观察过程中1例男患者5例女患者失访，2例男患者放弃治疗，退出试验，共8例患者脱落，有192例患者完成试验观察。病例采集均为糖尿病皮肤溃疡患者，年龄最小55岁，最大78岁，平均年龄66岁。192例患者分为两个试验中心进行试验观察，试验中心1有试验组与对照组各52例，试验中心2有试验组与对照组各44例,其中试验组采用本发明的凝胶进行治疗，试验中心1对照组采用普通凝胶进行治疗，试验中心2对照组直接应用羊膜干细胞进行治疗。
2、实验结果
2.1不同试验中心治疗组与对照组治疗前后7天内创面面积变化比较
表1：两个试验中心治疗组与对照组治疗后2天创面面积变化
表2：两个试验中心治疗组与对照组治疗后4天创面面积变化
表3：两个试验中心治疗组与对照组治疗后6天创面面积变化
表4：两个试验中心治疗组与对照组治疗后8天创面面积变化
表5：两个试验中心治疗组与对照组治疗后10天创面面积变化
表6：两个试验中心治疗组与对照组治疗后12天创面面积变化
表7：两个试验中心治疗组与对照组治疗后14天创面面积变化
由表1至7可以看出，治疗组在缩小创面面积方面明显更优于对照组。
安全性结果：未发现不良情况。
临床试验结论：本发明所提供的一种羊膜干细胞凝胶可以有效促进组织修复，在修复糖尿病皮肤溃疡创面方面效果非常明显，可以辅助治疗糖尿病皮肤溃疡。试验观察期间未发现不良情况，对患者的各项常规检查结果中未发现异常，说明本组合物在临床使用是安全的。
实施例2
一种羊膜干细胞凝胶，以重量份计，由如下组分组成：羊膜干细胞52份，富血小板血浆45份，甘油72份，壳聚糖58份，棕榈酸9份，苯氧乙醇6份，三乙醇胺15份，谷胱甘肽7份，右旋糖酐9份，去离子水630份，聚丙烯酸钠8份，透明质酸钠13份，α-红没药醇4份，羟乙基纤维素8份，异壬酸异壬酯9份，肉豆蔻酸异丙酯5份，n-羟甲基丙烯酰胺7份，聚丙烯酸酯压敏胶24份，环聚二甲基硅氧烷8份，丙烯酸酯类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物11份。
所述富血小板血浆来自用血细胞分离机直接采集的浓缩血小板(机采血小板)、静脉采集的全血(抗凝血)经两次离心法分离制备的血小板浓缩液(富浆法手工血小板)或商业富血小板血浆。
所述羊膜干细胞凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(a)凝胶前驱体溶液的制备
将羊膜干细胞、富血小板血浆、甘油、壳聚糖、棕榈酸、苯氧乙醇、三乙醇胺、谷胱甘肽、右旋糖酐、去离子水、聚丙烯酸钠、透明质酸钠、α-红没药醇、异壬酸异壬酯、肉豆蔻酸异丙酯、n-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯压敏胶、环聚二甲基硅氧烷和丙烯酸酯类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物混合形成的亲水共聚物制成水溶液即凝胶前驱体；
对于易溶于水的物质，直接溶解即形成水溶液；
对于不溶于水的物质，通过改变条件溶解，具体为冷冻研磨、消化溶解或加温溶解；
(b)浸泡
在凝胶未形成之前，将羟乙基纤维素浸泡于所述前驱体溶液中；
(c)凝胶过程
经过化学凝胶或物理凝胶形成羊膜干细胞凝胶。
所述的羊膜干细胞凝胶在制备适用于软/硬组织缺损、皮肤/粘膜难愈性损伤或溃疡、关节软骨退行性变、缺血性组织坏死等修复治疗的基质胶中的应用。
实施例3
一种羊膜干细胞凝胶，以重量份计，由如下组分组成：羊膜干细胞54份，富血小板血浆42份，甘油65份，壳聚糖55份，棕榈酸8份，苯氧乙醇5份，三乙醇胺13份，谷胱甘肽6份，右旋糖酐8份，去离子水650份，聚丙烯酸钠7份，透明质酸钠12份，α-红没药醇3份，羟乙基纤维素5份，异壬酸异壬酯9份，肉豆蔻酸异丙酯4份，n-羟甲基丙烯酰胺6份，聚丙烯酸酯压敏胶26份，环聚二甲基硅氧烷9份，丙烯酸酯类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物10份，丙烯酸羟乙酯-丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物3份。
所述富血小板血浆来自用血细胞分离机直接采集的浓缩血小板(机采血小板)、静脉采集的全血(抗凝血)经两次离心法分离制备的血小板浓缩液(富浆法手工血小板)或商业富血小板血浆。
所述羊膜干细胞凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(a)凝胶前驱体溶液的制备
将羊膜干细胞、富血小板血浆、甘油、壳聚糖、棕榈酸、苯氧乙醇、三乙醇胺、谷胱甘肽、右旋糖酐、去离子水、聚丙烯酸钠、透明质酸钠、α-红没药醇、异壬酸异壬酯、肉豆蔻酸异丙酯、n-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯压敏胶、环聚二甲基硅氧烷、丙烯酸酯类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物和丙烯酸羟乙酯-丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物混合形成的亲水共聚物制成水溶液即凝胶前驱体；
对于易溶于水的物质，直接溶解即形成水溶液；
对于不溶于水的物质，通过改变条件溶解，具体为冷冻研磨、消化溶解或加温溶解；
(b)浸泡
在凝胶未形成之前，将羟乙基纤维素浸泡于所述前驱体溶液中；
(c)凝胶过程
经过化学凝胶或物理凝胶形成羊膜干细胞凝胶。
所述的羊膜干细胞凝胶在制备适用于软/硬组织缺损、皮肤/粘膜难愈性损伤或溃疡、关节软骨退行性变、缺血性组织坏死等修复治疗的基质胶中的应用。
实施例4
一种羊膜干细胞凝胶，以重量份计，由如下组分组成：羊膜干细胞45份，富血小板血浆35份，甘油55份，壳聚糖50份，棕榈酸6份，苯氧乙醇4份，三乙醇胺8份，谷胱甘肽8份，右旋糖酐10份，去离子水700份，聚丙烯酸钠5份，透明质酸钠10份，α-红没药醇2份，羟乙基纤维素4份，异壬酸异壬酯10份，肉豆蔻酸异丙酯6份，n-羟甲基丙烯酰胺8份，聚丙烯酸酯压敏胶15份，环聚二甲基硅氧烷12份，丙烯酸酯类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物7份。
所述富血小板血浆来自用血细胞分离机直接采集的浓缩血小板(机采血小板)、静脉采集的全血(抗凝血)经两次离心法分离制备的血小板浓缩液(富浆法手工血小板)或商业富血小板血浆。
所述羊膜干细胞凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(a)凝胶前驱体溶液的制备
将羊膜干细胞、富血小板血浆、甘油、壳聚糖、棕榈酸、苯氧乙醇、三乙醇胺、谷胱甘肽、右旋糖酐、去离子水、聚丙烯酸钠、透明质酸钠、α-红没药醇、异壬酸异壬酯、肉豆蔻酸异丙酯、n-羟甲基丙烯酰胺、聚丙烯酸酯压敏胶、环聚二甲基硅氧烷和丙烯酸酯类/c10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物混合形成的亲水共聚物制成水溶液即凝胶前驱体；
对于易溶于水的物质，直接溶解即形成水溶液；
对于不溶于水的物质，通过改变条件溶解，具体为冷冻研磨、消化溶解或加温溶解；
(b)浸泡
在凝胶未形成之前，将羟乙基纤维素浸泡于所述前驱体溶液中；
(c)凝胶过程
经过化学凝胶或物理凝胶形成羊膜干细胞凝胶。
所述的羊膜干细胞凝胶在制备适用于软/硬组织缺损、皮肤/粘膜难愈性损伤或溃疡、关节软骨退行性变、缺血性组织坏死等修复治疗的基质胶中的应用。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。