本发明涉及一种抗菌止血材料的制备方法及应用，尤其是涉及一种抗菌止血壳聚糖的制备方法及其应用。
背景技术：
：创伤造成的出血和感染威胁着病人的健康和生命，如何在给创口止血的同时能够防止创口感染，是医学对生物医用材料提出的要求，也是目前生物医用材料研究的热点。壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-b-d葡萄糖。壳聚糖是自然界唯一带阳离子电荷的碱性多糖，能促进血细胞和血红蛋白聚集，从而促进凝血；壳聚糖可通过介导细胞增殖而促进伤口愈合；壳聚糖在弱酸溶剂中易于溶解，溶解后的溶液中含有氨基，这些氨基通过结合负电子来抑制细菌。尽管壳聚糖具有诸多优点，但其并不具有较强的杀菌和抑菌作用。cn102388908a中公开了一种银/壳聚糖复合抗菌剂的制备工艺，先通过氯乙酸与壳聚糖反应制得羧甲基壳聚糖，再通过羧甲基壳聚糖与银离子进行复合得到银/壳聚糖复合抗菌剂。作为抗菌止血材料，其缺陷在于：抗菌剂是由壳聚糖和银复合而成，所增强的抗菌效果由银产生，但是银容易出现过度沉积，影响抗菌效果。cn101721733a中公开了医用壳聚糖抗菌敷料及其制备方法，以壳聚糖纤维为原料，在壳聚糖纤维上喷涂附着有载银纳米二氧化钛颗粒，从而使其持久缓释银离子，从而达到持久抗菌的效果。作为抗菌止血材料，其缺陷在于：壳聚糖纤维的吸液效果差，在大量渗血出血的情况下无法吸收大量的渗液因此无法快速激活凝血机制，止血效果差。cn101766188a中公开了一种壳聚糖抗菌剂，通过乙二胺四乙酸将聚季铵盐和壳聚糖复合到一起，大大提高了壳聚糖的杀菌效率。作为抗菌止血材料，其缺陷在于：聚季铵盐通过乙二胺四乙酸与壳聚糖复合在一起，稳定性差，聚季铵盐容易逸出，产生较大的毒性并影响抗菌效果。cn102040670a中公开了一种羧甲基壳聚糖季铵盐与制备及其制备天然化妆品抗菌剂的应用。该专利通过在羧甲基壳聚糖上修饰市场上现有的季铵化试剂，从而得到羧甲基壳聚糖季铵盐，具有抗菌防腐作用。但是这种方法的制备条件苛刻，需要特定制备的羧甲基壳聚糖作为原料，同时，选择市场上现有的季铵化试剂制备的最终产品材料在医用止血材料上的效果并不如意。技术实现要素：本发明要解决的第一个技术问题是提供一种抗菌止血壳聚糖的制备方法。该制备方法简单快捷，制得的壳聚糖具有优异的抗菌性，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等都具有优异的抗菌性能，依据gb/t20944.3-2008标准，测定金黄色葡萄球菌抑菌率≧98％，大肠杆菌抑菌率≧90％；同时，利用制得的壳聚糖制成的抗菌止血海绵不仅具有优异的抗菌性能，还增强了壳聚糖海绵的止血效果，止血时间≦60秒；且利用壳聚糖制得的抗菌止血海绵无明显细胞毒性，可生物降解。本发明要解决的第二个技术问题是提供一种通过上述制备方法制得的壳聚糖在医用抗菌止血材料上的应用。为解决上述第一个技术问题，发明采用如下的技术方案：一种抗菌止血壳聚糖的制备方法，包括如下步骤：s1、季铵化试剂的制备：将阳离子试剂溶液滴加到环氧试剂溶液中，控制反应温度在25-90℃，反应2-24h，反应结束后减压蒸馏，得到季铵化试剂；将季铵化试剂溶解在溶剂中，制得季铵化试剂溶液；s2、抗菌止血壳聚糖的制备：将壳聚糖加入到碱溶液中，然后加入步骤s1制得季铵化试剂溶液，搅拌反应，反应结束后将得到的粗产物用洗涤液洗涤，干燥后得到抗菌壳聚糖。本发明创造性的选择通过化学方法合成的品类众多的季铵化试剂，然后通过化学修饰将其与壳聚糖连接起来，大大增强了壳聚糖的正电性，使抗菌壳聚糖具有优异的抗菌性，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等都具有优异的抗菌性能；同时，利用制备的抗菌止血壳聚糖制成的抗菌止血海绵不仅具有优异的抗菌性能，还大大增强了海绵的止血效果；制得的壳聚糖抗菌止血海绵无明显细胞毒性，可生物降解，是一款优异的医用抗菌止血材料。根据本发明的某些实施方式，步骤s1中，所述阳离子试剂选自乙二胺、n,n-二甲基乙二胺、三乙胺、n,n-二甲基丁胺、三正己胺、n,n-二甲基正辛胺、n,n-二甲基十二烷基叔胺中的一种或多种；优选自三正己胺和n,n-二甲基正辛胺中的一种或两种。当阳离子试剂选自这几种物质时，得到的壳聚糖抗菌止血海绵具有更好的抗菌和止血效果。根据本发明的某些实施方式，步骤s1中，所述环氧试剂选自环氧溴丙烷、环氧氯丙烷、1,2-环氧氯丁烷中的一种或多种；优选自环氧溴丙烷和环氧氯丙烷中的一种或两种混合。根据本发明的某些实施方式，步骤s1中，配制所述阳离子试剂溶液所用的溶剂选自去离子水、乙醇、乙醚、甲醇、正丁醇、环氧氯丙烷中的一种或多种，优选自乙醇和环氧氯丙烷中的一种或两种混合；配制所述环氧试剂溶液所用的溶剂选自去离子水、乙醇、乙醚、甲醇、正丁醇、环氧氯丙烷中的一种或多种。根据本发明的某些实施方式，步骤s1中，所述阳离子试剂和环氧试剂的质量比为0.1-8:1；例如，所述阳离子试剂和环氧试剂的质量比还可以为0.2-7:1，或0.2-6:1，或0.2-5:1，或0.2-4:1，或0.2-3:1，或0.2-2:1，或0.2-1:1，或0.4-8:1，或0.4-7:1，或0.4-6:1，或0.4-5:1，或0.4-4:1，或0.4-3:1，或0.4-2:1，或0.4-2:1，或0.4-1:1，或0.8-8:1，或0.8-7:1，或0.8-6:1，或0.8-5:1，或0.8-4:1，或0.8-3:1，或0.8-2:1，或0.8-1:1，或1-8:1，或1-7:1，或1-6:1，或1-5:1，或1-4:1，或1-3:1，或1-2:1，或2-8:1，或2-7:1，或2-6:1，或2-5:1，或2-4:1，或2-3:1，或3-8:1，或3-7:1，或3-6:1，或3-5:1，或3-4:1，或4-8:1，或4-7:1，或4-6:1，或4-5:1，或5-8:1，或5-7:1，或5-6:1，或6-8:1，或6-7:1。根据本发明的某些实施方式，步骤s2中，所述壳聚糖和季铵化试剂的质量比为1-16:1；例如，壳聚糖和季铵化试剂的质量比还可以是1-14:1，或1-12:1，或1-10:1，或1-8:1，或1-6:1，或1-4:1，或3-16:1，或3-14:1，或3-12:1，或3-10:1，或3-8:1，或3-6:1，或5-16:1，或5-14:1，或5-12:1，或5-10:1，或5-8:1，或8-16:1，或8-14:1，或8-12:1，或8-10:1等。根据本发明的某些实施方式，步骤s2中，所述壳聚糖选自原壳聚糖、壳聚糖衍生物中的一种或多种；所述原壳聚糖选自脱乙酰基程度高于70％的壳聚糖且分子量为1万-100万，所述壳聚糖衍生物选自壳聚糖盐酸盐、羧甲基壳聚糖中的一种或多种。根据本发明的优选具体实施方式，步骤s2中，所述壳聚糖分子量优选为10万-100万，此时制得的壳聚糖抗菌止血海绵的机械强度和吸液性能更好，止血效果也更佳。根据本发明的某些实施方式，步骤s2中，所述碱溶液和季铵化试剂溶液所用的溶剂选自去离子水、二甲基亚砜、乙醇中的一种或多种；优选自去离子水和乙醇中的一种或两种混合。根据本发明的某些实施方式，步骤s2中，所述碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙中的一种或多种；最优选为氢氧化钠。根据本发明的某些实施方式，步骤s2中，所述搅拌反应的温度为30-80℃，反应时间为6-48h；优选地，所述搅拌反应的温度为35-75℃，反应时间为6-24h。根据本发明的某些实施方式，步骤s2中，所述洗涤液选自去离子水、乙醇、丙酮、甲醇中的一种或多种。为解决上述第二个技术问题，本发明一种通过上述制备方法制得的抗菌止血壳聚糖在医用抗菌止血材料上的应用。根据本发明的某些实施方式，通过上述制备方法制得的抗菌止血壳聚糖在制备医用抗菌止血海绵上的应用，具体步骤如下：将抗菌壳聚糖溶于醋酸溶液，向其中加入甘油和发泡剂，搅拌反应，后将反应液转移到模具中，经低温冷冻、冷冻干燥，热处理和辐照灭菌后，即得壳聚糖抗菌止血海绵。根据本发明的具体实施方式，所述发泡剂选自泊洛沙姆发泡剂，如泊洛沙姆-188、泊洛沙姆-407等。根据本发明的具体实施方式，所述辐照灭菌采用的是co60辐照灭菌。本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。如无特殊说明，本发明中的各原料均可通过市售购买获得，本发明中所用的设备可采用所属领域中的常规设备或参照所属领域的现有技术进行。与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：本发明的制备方法中，通过对反应原料及反应步骤的控制，从而制备得到具有强抗菌效果的抗菌壳聚糖并用其制备了壳聚糖抗菌止血海绵。本发明的制备方法简单快捷，制得的壳聚糖具有优异的抗菌性，对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌等都具有优异的抗菌性能，依据gb/t20944.3-2008标准，测定金黄色葡萄球菌抑菌率≧98％，大肠杆菌抑菌率≧90％；同时，利用制得的壳聚糖制成的抗菌止血海绵不仅具有优异的抗菌性能，还增强了壳聚糖海绵的止血效果，止血时间≦60秒；且利用壳聚糖制得的抗菌止血海绵无明显细胞毒性，可生物降解，是一款可生物降解的环境友好型医用材料。附图说明图1是实施例1-3及对比例1-4样品的细胞毒性柱状图。具体实施方式为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。实施例1一种抗菌止血壳聚糖的制备方法，包括如下步骤：1)将1g环氧溴丙烷滴加到10ml乙醇溶液中，再向其中滴加5g三正己胺，将混合液于40℃加热搅拌反应4h，反应结束后减压蒸馏得到季铵化试剂a。2)将1g壳聚糖(脱乙酰度为80％，分子量为10万)加入到20ml氢氧化钠溶液(0.3％)中，将0.5g季铵化试剂a溶于5ml乙醇中，然后将季铵化试剂溶液滴加到壳聚糖溶液中，控制反应在45℃反应24h，反应结束后用体积分数为70％的乙醇溶液洗三次，再用无水乙醇洗一次，后真空干燥即可得到抗菌止血壳聚糖。利用上述抗菌止血壳聚糖制备抗菌止血海绵的制备方法，包括如下步骤：将1g抗菌止血壳聚糖溶于80ml醋酸溶液(0.3％)中，向其中加0.4g甘油,20ml发泡剂泊洛沙姆-188(0.15g)溶液，控制反应在27℃搅拌反应2h。将反应液倒入模具中，后将其置于-45℃冰箱中冷冻12h，并将其放入冷冻干燥机中冷冻干燥，经45℃热处理12h后，用co60辐照灭菌即可得到壳聚糖抗菌止血海绵。实施例2一种抗菌止血壳聚糖的制备方法，包括如下步骤：1)将1g环氧氯丙烷滴加到10ml乙醇溶液中，再向其中滴加2gn,n-二甲基正辛胺，将混合液于50℃加热搅拌反应2h，反应结束后减压蒸馏得到季铵化试剂b。2)将1g壳聚糖(脱乙酰度为85％，分子量为20万)加入到10ml氢氧化钠溶液(0.3％)中，将0.35g季铵化试剂b溶于3ml乙醇中，然后将季铵化试剂溶液滴加到壳聚糖溶液中，控制反应在35℃反应8h，反应结束后用体积分数为70％的乙醇溶液洗三次，再用无水乙醇洗一次，后真空干燥即可得到抗菌止血壳聚糖。利用上述抗菌止血壳聚糖制备抗菌止血海绵的制备方法，包括如下步骤：将1g抗菌止血壳聚糖溶于80ml醋酸溶液(0.2％)中，向其中加0.35g甘油,25ml发泡剂泊洛沙姆-407(0.15g)溶液，控制反应在35℃搅拌反应3h。将反应液倒入模具中，后将其置于-45℃冰箱中冷冻12h，并将其放入冷冻干燥机中冷冻干燥，经45℃热处理12h后，用co60辐照灭菌即可得到壳聚糖抗菌止血海绵。实施例3一种抗菌止血壳聚糖的制备方法，包括如下步骤：1)将1g环氧溴丙烷滴加到10ml乙醇溶液中，再向其中滴加5g三正己胺，将混合液于45℃加热搅拌反应3h，反应结束后减压蒸馏得到季铵化试剂a。2)将1g环氧氯丙烷滴加到10ml乙醇溶液中，再向其中滴加2gn,n-二甲基正辛胺，将混合液于40℃加热搅拌反应6h，反应结束后减压蒸馏得到季铵化试剂b。3)将1g壳聚糖(脱乙酰度为85％，分子量为30万)加入到10ml氢氧化钠溶液(0.3％)中，将0.25g季铵化试剂a和0.25g季铵化试剂b溶于6ml乙醇中，然后将季铵化试剂溶液滴加到壳聚糖溶液中，控制反应在60℃反应24h，反应结束后用体积分数为70％的乙醇溶液洗三次，再用无水乙醇洗一次，后真空干燥即可得到抗菌止血壳聚糖。利用上述抗菌止血壳聚糖制备抗菌止血海绵的制备方法，包括如下步骤：将1g抗菌止血壳聚糖溶于80ml醋酸溶液(0.2％)中，向其中加0.35g甘油,25ml发泡剂泊洛沙姆-407(0.15g)溶液，控制反应在35℃搅拌反应3h。将反应液倒入模具中，后将其置于-45℃冰箱中冷冻12h，并将其放入冷冻干燥机中冷冻干燥，经45℃热处理12h后，用co60辐照灭菌即可得到壳聚糖抗菌止血海绵。实施例4重复实施例3，不同之处仅在于，阳离子试剂用乙二胺代替三正己胺，最终效果比使用三正己胺略差。实施例5重复实施例3，不同之处仅在于，阳离子试剂用三乙胺代替三正己胺，最终效果比使用三正己胺略差。实施例6重复实施例2，不同之处仅在于，阳离子试剂用n,n-二甲基丁胺代替n,n-二甲基正辛胺，最终效果比使用n,n-二甲基正辛胺略差。实施例7重复实施例2，不同之处仅在于，阳离子试剂用n,n-二甲基十二烷基叔胺代替n,n-二甲基正辛胺，最终效果比使用n,n-二甲基正辛胺略差。对比例1壳聚糖海绵的制备方法，步骤如下：将1.0g壳聚糖溶于80ml醋酸溶液(0.2％)中，向其中加0.35g甘油,25ml发泡剂(0.15g)溶液，控制反应在35℃搅拌反应3h。将反应液倒入模具中，后将其置于-45℃冰箱中冷冻12h，并将其放入冷冻干燥机中冷冻干燥，经45℃热处理12h后，用co60辐照灭菌即可得到壳聚糖海绵。对比例2抗菌壳聚糖海绵对比样品的制备，步骤如下：将16mg权利要求1所制备的季胺化试剂滴加到0.15g对比例1所制备的壳聚糖海绵中，得到含季胺化试剂的抗菌壳聚糖海绵。对比例3抗菌壳聚糖海绵对比样品的制备，步骤如下：将17mg购自现有市场上的十二烷基三甲基氯化铵滴加到0.15g对比例1所制备的壳聚糖海绵中，得到含季胺化试剂的抗菌壳聚糖海绵。对比例4将1g壳聚糖(脱乙酰度为80％，分子量为10万)加入到20ml氢氧化钠溶液(0.3％)中，将0.3购自现有市场上的环氧丙基三甲基氯化胺溶于5ml乙醇中，然后将季铵化试剂溶液滴加到壳聚糖溶液中，控制反应在45℃反应24h，反应结束后用体积分数为70％的乙醇溶液洗三次，再用无水乙醇洗一次，后真空干燥即可得到抗菌止血壳聚糖。将1.0g上述抗菌止血壳聚糖溶于80ml醋酸溶液(0.2％)中，向其中加0.35g甘油,25ml发泡剂(0.15g)溶液，控制反应在35℃搅拌反应3h。将反应液倒入模具中，后将其置于-45℃冰箱中冷冻12h，并将其放入冷冻干燥机中冷冻干燥，经45℃热处理12h后，用co60辐照灭菌即可得到抗菌壳聚糖海绵。实验例1制备的样品进行金黄色葡萄球菌抑菌效果对比实验检测条件：将实施例1-3和对比例2-4的壳聚糖抗菌止血海绵及对比例1的壳聚糖海绵进行菌液供培养抑菌实验。检测用菌为金黄色葡萄球菌atcc29213。检测方法：将培养好的金黄色葡萄球菌在培养基里稀释至约1×105cfu/ml，分为6组，分别将15ml的含菌培养液加入到50ml的离心管中。再分别称取150mg实施例1-3和对比例2-4的的壳聚糖抗菌止血海绵及对比例1的壳聚糖海绵分别浸泡于前述含菌培养液的离心管中。再分别将离心管在37℃温度下轻微振荡培养18h，然后分别吸取0.1ml培养液加入96孔板中，用酶标仪读取各个孔在600nm处的吸收光强。为确保实验的准确性，每组样品测试5个平行样本，统计平均值。抑菌率结果如下表1所示。实施例1-3的壳聚糖抗菌止血海绵对金黄色葡萄球菌均具有优异的抑菌效果，和对比例2和3的壳聚糖抗菌止血海绵对金黄色葡萄球菌具有近似的抑菌效果，抑菌率更远高于对比例1壳聚糖海绵和对比例4的抗菌壳聚糖海绵。表1各实施例及对比例样品的抑菌实验结果分组抑菌率(平均值)实施例1样品99.65％±0.50％实施例2样品98.70％±0.70％实施例3样品99.20％±0.10％对比例1样品2.55％±0.55％对比例2样品99.62％±0.60％对比例3样品99.30％±0.20％对比例4样品0％±0％实验例2制备的壳聚糖抗菌止血海绵和壳聚糖海绵进行大肠杆菌抑菌效果对比实验检测条件：将实施例1-3和对比例2-4的壳聚糖抗菌止血海绵及对比例1的壳聚糖海绵进行菌液供培养抑菌实验。检测用菌为大肠杆菌atcc25922。检测方法：将培养好的大肠杆菌在培养基里稀释至约1×105cfu/ml，分为6组，分别将15ml的含菌培养液加入到50ml的离心管中。再分别称取150mg实施例1-3和对比例2-4的的壳聚糖抗菌止血海绵及对比例1的壳聚糖海绵分别浸泡于前述含菌培养液的离心管中。再分别将离心管在37℃温度下轻微振荡培养18h，然后分别吸取0.1ml培养液加入96孔板中，用酶标仪读取各个孔在600nm处的吸收光强。为确保实验的准确性，每组样品测试5个平行样本，统计平均值。抑菌率结果如下表2所示。实施例1-3的壳聚糖抗菌止血海绵对金黄色葡萄球菌均具有优异的抑菌效果，和对比例2和3的壳聚糖抗菌止血海绵对金黄色葡萄球菌具有近似的抑菌效果，抑菌率更远高于对比例1壳聚糖海绵和对比例4的抗菌壳聚糖海绵。表2各实施例及对比例样品的抑菌实验结果分组抑菌率(平均值)实施例1样品94.70％±0.60％实施例2样品92.60％±0.50％实施例3样品90.40％±0.90％对比例1样品3.65％±0.42％对比例2样品92.62％±0.30％对比例3样品91.80％±0.20％对比例4样品0％±0％实验例3制备的样品进行细胞毒性实验检测条件：将实施例1-3和对比例2-4的壳聚糖抗菌止血海绵及对比例1的壳聚糖海绵进行mtt细胞毒性实验。检测用细胞为人肾上皮细胞系293细胞。检测方法：采用无血清培养液作为浸提液浸泡材料24h。然后将浸提液与细胞共培养24h。浸提液用含血清培养液等体积稀释5个浓度。第一个浓度用双倍血清培养液稀释，其他浓度均用正常血清浓度培养液稀释。后按照mtt法测定材料的细胞毒性。细胞毒性结果如下图1所示，0组为对比例1的壳聚糖海绵；1、2、3组分别是实施例1、2、3的壳聚糖抗菌止血海绵；4、5组分别是对比例2、3的壳聚糖抗菌止血海绵。从实验结果可看出，实施例1-3壳聚糖抗菌止血海绵组的细胞存活率与对比例1壳聚糖海绵组无明显差异，说明本发明所构建的抗菌壳聚糖够对本发明所构建的季胺化试剂进行良好的接枝，所购建的抗菌抗菌糖海绵无明显细胞毒性。同时，实施例1-3壳聚糖抗菌止血海绵组的细胞存活率与对比例4抗菌壳聚糖海绵组无明显差异。说明本发明构建抗菌壳聚糖的方法具有普适性。图1示出了实施例1-3及对比例1-4样品的细胞毒性柱状图。实验例4制备的壳聚糖抗菌止血海绵和壳聚糖海绵进行止血效果对比实验检测方法：选取18只4-6周健康大鼠，随机分为6组，每组3只大鼠。将大鼠麻醉后固定于操作台上，打开腹腔后，漏出肝脏，将肝脏横向切开，令其自由喷血10s，然后根据分组将实施例1-3和对比例2-4的的壳聚糖抗菌止血海绵及对比例1的壳聚糖海绵进行加压止血处理，记录止血时间和止血效果。其中，每组样品分别测试三个平行样本，统计平均值。实施例1-3及对比例1-4的止血时间如表2所示。表2各实施例及对比例样品的止血实验结果分组止血时间(s)实施例1样品50±5实施例2样品60±2实施例3样品55±4对比例1样品105±5对比例2样品75±5对比例3样品70±3对比例4样品108±6由此可见，实施例1-3的样品止血效果明显优于对比例1-4的样品。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。当前第1页12