本发明涉及医药领域，尤其涉及一种包埋有负载抗癌药物碳量子点的纳米微粒的制备方法。
背景技术：
碳量子点由于自身独特的性能，引起了研究者的浓厚兴趣。量子点有独特的光学特性：荧光波长可通过改变粒径大小和组成进行调节，荧光强，光稳定性好，激发光谱广和发射荧光光谱窄等。随着量子点的广泛研究，量子点表现出诸多的研究价值：量子点已在生物领域、细胞生物传感、动物活体成像，肿瘤标志物检测等生物医学研究领域广泛应用。
将药物负载于量子点使其达到既具有生物成像的同时可用于癌细胞的治疗是研究的主要手段。但是目前，碳量子点对于药物的负载效果不够理想，仍有待于进一步提高，同时如何提高碳量子的荧光发光效果也有待于提高。因此，如何提高碳量子点对于抗癌药物的负载量以及提高碳量子点的荧光发光效果和成像是对细胞研究的最重要的方向。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种包埋有负载抗癌药物碳量子点的纳米微粒的制备方法。本发明通过柠檬酸与浓硫酸和浓硝酸混合酸液的作用先制备合成孔隙较大、比表面积较大的碳量子点，使其吸附抗癌药索拉菲尼得到负载药物的碳量子点。后采用二次乳化-溶剂挥发法来制备包埋负载药物碳量子点的聚合物纳米粒子，首先将负载抗癌药物碳量子点水溶液包埋于聚ε-己内酯油相，形成油包水初乳，随后加入bsa水相，得到水包油包水复乳液体系；后通过有机溶剂挥发得到包埋碳量子点的聚合物纳米微粒。该方法制备的聚合物微粒将在后期有望实现生物成像以及用于治疗癌细胞；同时该方法不会在后期的实验过程中对细胞产生显著影响，不影响实验结果的科学性，实验操作过程简单、无毒、无害、绿色环保。
本发明的具体技术方案为：一种包埋有负载抗癌药物碳量子点的纳米微粒的制备方法，包括以下步骤：
1）将400-500mg柠檬酸加入到20-30ml十六烷基胺中，得到混合液，密封保存。
本发明在步骤1）中将钝化剂十六烷基胺与柠檬酸混合，使制备的碳量子点表面修饰，使得产物发光量子点产率提高，提高其发光效率。
2）将步骤1）所得的混合液加入到由60-70ml的浓硫酸和25-30ml的浓硝酸配成的混合酸液中，对混合物先超声1-2h分散均匀，后在98-102℃下搅拌回流24-30h，将得到的溶液先冷却至室温，后加去离子水稀释至总体积为600-800ml。
本发明在步骤2）中将柠檬酸与浓硫酸和浓硝酸混合液的作用，通过酸化法制备的碳量子点，使其具有较大的洞隙、较大比表面积、较高的微孔分布率。
3）向步骤2）所得的溶液中添加碳酸钠用于中和过量的酸，使溶液的ph在7.5-8.5，将所得溶液通过旋转蒸发浓缩，将析出的无机盐过滤除去，收集滤液后经过透析，得到碳量子点水溶液。
4）将10-15ml的氨水、10-15ml的氯化亚砜先后加入到30-40ml步骤3）所得的碳量子点水溶液中混合均匀，将混合液加入到反应釜中，加热至150-200℃，保温4-6h；最后，冷却至室温后取反应液并离心处理，得上清液，获得纯净的氯化、氨基化的碳量子点水溶液，待用。
本发明在步骤4）中，将制备的碳量子点水溶液先通过氨水，对其进行氨基化，后通过氯化亚砜进行氯化改性，制备了含有o、n和cl改性的碳量子点。使含有n和o的碳量子点发光最强，含cl和o的碳量子点光催化效率最高。
5）将1.0-1.5g抗癌药索拉菲尼溶解分散于20-25ml四氢呋喃溶液中，均匀搅拌4-6min，超声0.5-1.5min使药物分散均匀，随后密封保存。
本发明在步骤5）中，将难溶于水的抗癌药物索拉菲尼先溶解于四氢呋喃，基于四氢呋喃易溶于水，从而实现抗癌药物的溶解，并使其能够均匀分散，以便于在碳量子点上负载。
6）量取10-15ml步骤5）所得的混合液加入到10-15ml步骤4）所得的碳量子点水溶液中，然后添加0.9-1.1g固化剂三乙烯四胺。
本发明在步骤6）中，通过加入三乙烯四胺固化剂，从而使得量子点和药物的结合率更高，从而实现终产物聚合物纳米微粒对药物的高负载率，并可实现药物的缓释作用。
7）将步骤6）所得的溶液配制成浓度为7-9wt%的碳量子点-索拉菲尼水溶液。
8）将聚ε-己内酯溶于peg中，配制成浓度为3-5wt%的聚ε-己内酯油相溶液。
9）将作为分散剂的bsa溶于水中，配制成浓度为6-8wt%的bsa水溶液。
10）取3-5ml碳量子点-索拉菲尼水溶液，将其加入到8-12ml的聚ε-己内酯油相溶液中，超声乳化1-2min，超声功率为500-600w，制得油包水初乳液，再将油包水初乳液立即转移到18-24ml的bsa水溶液中，超声1-2min，制得水包油包水复乳液。
本发明采用二次乳化-溶剂挥发法制备包埋碳量子点的聚合物微粒，该方法制备的聚合物微粒尺寸较小，有利于和细胞相互作用。
本发明采用聚ε-己内酯油相包埋碳量子点形成初乳液，使其包封率大大提高，牛血清蛋白水溶液包埋初乳液，不影响细胞实验的准确性。
11）将水包油包水复乳液逐滴加入到60-80ml水中，磁力搅拌，陈化30-60min，待有机溶剂挥发后，进行离心处理，收集微粒，并用去离子水将得到的微粒洗涤2-3次以除去残留的分散剂，最后冻干保存，制得包埋有负载抗癌药物碳量子点的纳米微粒。
作为优选，步骤2）中，所述浓硫酸的浓度为98wt%，所述浓硝酸的浓度为65wt%。
作为优选，步骤3）中，所述透析的过程为：将滤液装入规格为1000da的透析袋中透析3-4天。
作为优选，在步骤10）前，将步骤7）、步骤8）和步骤9）所得的各溶液在使用前，置于3-5℃的环境中预冷。
本发明在制备的负载药物的碳量子点水溶液、聚ε-己内酯油相溶液、bsa水溶液在使用前，置于冰箱中预冷，以减少在乳化过程中温度升高对制备过程的影响。
作为优选，步骤11）的所述离心处理为：使用冷冻高速离心机，在13000-15000rpm的转速下离心5-10min。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
本发明通过柠檬酸与浓硫酸和浓硝酸混合酸液的作用先制备合成孔隙较大、比表面积较大的碳量子点，使其吸附抗癌药索拉菲尼得到负载药物的碳量子点。后采用二次乳化-溶剂挥发法来制备包埋负载药物碳量子点的聚合物纳米粒子，首先将负载抗癌药物碳量子点水溶液包埋于聚ε-己内酯油相，形成油包水初乳，随后加入bsa水相，得到水包油包水复乳液体系；后通过有机溶剂挥发得到包埋碳量子点的聚合物纳米微粒。该方法制备的聚合物微粒将在后期有望实现生物成像以及用于治疗癌细胞；同时该方法不会在后期的实验过程中对细胞产生显著影响，不影响实验结果的科学性，实验操作过程简单、无毒、无害、绿色环保。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：
1）将400mg柠檬酸加入到20ml十六烷基胺，得到混合液，密封保存。
2）将1）所得到的混合液加入到60ml的浓硫酸（98wt%）和25ml的浓硝酸（65wt%）混合酸液中，混合物先超声1h分散均匀，后在100℃下搅拌回流24h。得到溶液先冷却至室温，后加去离子水稀释至总体积约600ml。
3）将碳酸钠加入2）中和过量的酸至溶液的ph到7.5左右。得到的溶液通过旋转蒸发浓缩，将析出的大量无机盐过滤除去，收集的滤液用透析袋（1000da）透析3d，即可得到纯碳量子点的水溶液。
4）将10ml氨水、10ml氯化亚砜先后加入到30ml3）的所得碳量子点溶液中混合均匀。将混合液加入到反应釜中，加热到150℃，并在该温度保温5小时。最后，冷却至室温后取反应液离心，得上清液，获得纯净的氯化、氨基化的碳量子点水溶液待用。
5）将1.0g抗癌药索拉菲尼溶解分散于20ml四氢呋喃溶液,均匀搅拌5min，超声1min使得药物分散均匀，随后密封保存。
6）将量取10ml5）所得混合液加入到10ml4）所得碳量子点的水溶液，将1.0g固化剂三乙烯四胺加入到索拉菲尼(sf)和量子点的混合液。
7）将6）得到的溶液配制成浓度为7%碳量子点-索拉菲尼水溶液。
8）将聚ε-己内酯溶于peg中，配制成浓度为3%的聚ε-己内酯油相。
9）将作为分散剂的bsa溶于水中，形成浓度为6%的水溶液。
10）上述7）、8）、9）配制的溶液在使用前，置于4℃的冰箱中预冷。以减少在乳化过程中温度升高对制备过程的影响。
11）将预冷后的3ml的碳量子点-索拉菲尼水溶液加入到82ml的聚ε-己内酯溶液中，使用超声乳化仪超声1min，功率为540w，制得w/o初乳将初乳立即转移到18ml的bsa水溶液中，超声1min，制得w/o/w复乳液。
12）将乳液逐滴加入到60ml水中，磁力搅拌，陈化30min，待有机溶剂挥发完全后，使用冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心5min，收集微粒，并用去离子水将得到的粒子洗涤2-3次以除去残留的分散剂，最后冻干保存。最终获得包埋负载抗癌药物的碳量子点聚合物微粒。
实施例2：
1）将450mg柠檬酸加入到25ml十六烷基胺，得到混合液，密封保存。
2）将1）所得到的混合液加入到65ml的浓硫酸（98wt%）和27ml的浓硝酸（65wt%）混合液中，混合物先超声1h分散均匀，后在100℃下搅拌回流27h。得到溶液先冷却至室温，后加去离子水稀释至总体积约700ml。
3）将碳酸钠加入2）中和过量的酸至溶液的ph到8.0左右。得到的溶液通过旋转蒸发浓缩，将析出的大量无机盐过滤除去，收集的滤液用透析袋（1000da）透析3d，即可得到纯碳量子点的水溶液。
4）将13ml氨水、13ml氯化亚砜先后加入到35ml3）的所得碳量子点溶液中混合均匀。将混合液加入到反应釜中，加热到180℃，并在该温度保温5小时。最后，冷却至室温后取反应液离心，得上清液，获得纯净的氯化、氨基化的碳量子点水溶液待用。
5）将1.3g抗癌药索拉菲尼溶解分散于23ml四氢呋喃溶液,均匀搅拌5min，超声1min使得药物分散均匀，随后密封保存。
6）将量取13ml5）所得混合液加入到13ml4）所得碳量子点的水溶液，将1.0g固化剂三乙烯四胺加入到索拉菲尼和量子点的混合液。
7）将6）得到的溶液配制成浓度为8%碳量子点-索拉菲尼水溶液。
8）将聚ε-己内酯溶于peg中，配制成浓度为4%的聚ε-己内酯油相。
9）将作为分散剂的bsa溶于水中，形成浓度为7%的水溶液。
10）上述7）、8）、9）配置的溶液在使用前，置于4℃的冰箱中预冷。以减少在乳化过程中温度升高对制备过程的影响。
11）将预冷后的4ml的碳量子点-索拉菲尼水溶液加入到10ml的聚ε-己内酯溶液中，使用超声乳化仪超声1min，功率为500w，制得w/o初乳将初乳立即转移到22ml的bsa水溶液中，超声1min，制得w/o/w复乳液。
12）将乳液逐滴加入到70ml水中，磁力搅拌，陈化45min，待有机溶剂挥发完全后，使用冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心7min，收集微粒，并用去离子水将得到的粒子洗涤3次以除去残留的分散剂，最后冻干保存。最终获得包埋负载抗癌药物的碳量子点聚合物微粒。
实施例3：
1）将500mg柠檬酸加入到30ml十六烷基胺，得到混合液，密封保存。
2）将1）所得到的混合液加入到70ml的浓硫酸（98wt%）和30ml的浓硝酸（65wt%）混合液中，混合物先超声2h分散均匀，后在100℃下搅拌回流30h。得到溶液先冷却至室温，后加去离子水稀释至总体积约800ml。
3）将碳酸钠加入2）中和过量的酸至溶液的ph到8.5左右。得到的溶液通过旋转蒸发浓缩，将析出的大量无机盐过滤除去，收集的滤液用透析袋（1000da）透析4d，即可得到纯碳量子点的水溶液。
4）将15ml氨水、15ml氯化亚砜加入到40ml3）的所得碳量子点溶液中混合均匀。将混合液加入到反应釜中，加热到200℃，并在该温度保温5小时。最后，冷却至室温后取反应液离心，得上清液，获得纯净的氯化、氨基化的碳量子点水溶液待用。
5）将1.5g抗癌药索拉菲尼溶解分散于25ml四氢呋喃溶液,均匀搅拌5min,超声1min使得药物分散均匀，随后密封保存。
6）将量取15ml5）所得混合液加入到15ml4）所得碳量子点的水溶液，将1.0g固化剂三乙烯四胺加入到索拉菲尼和量子点的混合液。
7）将6）得到的溶液配制成浓度为9%碳量子点-索拉菲尼水溶液。
8）将聚ε-己内酯溶于peg中，配制成浓度为5%的聚ε-己内酯油相。
9）将作为分散剂的bsa溶于水中，形成浓度为8%的水溶液。
10）上述7）、8）、9）配制的溶液在使用前，置于4℃的冰箱中预冷。以减少在乳化过程中温度升高对制备过程的影响。
11）将预冷后的5ml的碳量子点-索拉菲尼水溶液加入到12ml的聚ε-己内酯溶液中，使用超声乳化仪超声2min，功率为600w，制得w/o初乳将初乳立即转移到24ml的bsa水溶液中，超声2min，制得w/o/w复乳液。
12）将乳液逐滴加入到80ml水中，磁力搅拌，陈化60min，待有机溶剂挥发完全后，使用冷冻高速离心机，在14000r/m的转速下离心10min，收集微粒，并用去离子水将得到的粒子洗涤3次以除去残留的分散剂，最后冻干保存。最终获得包埋负载抗癌药物的碳量子点聚合物微粒。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。