本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种类白喉棒状杆菌作为免疫佐剂在禽用油乳剂灭活疫苗中的应用。
背景技术：
近年来特别是禽流感爆发后，禽用油乳剂灭活疫苗成为最重要的禽用疫苗种类。但是，禽用油乳剂灭活疫苗极易受到灭活抗原质量品质的影响，特别是高质量疫苗一般通过高倍浓缩抗原技术实现，高品质的禽用油乳剂灭活疫苗生产成本较高且产能有限，不能有效满足市场需求。因此，研究开发安全、高效、经济的禽用油乳剂灭活疫苗专用免疫佐剂成为研究重点。
免疫佐剂又称非特异性刺激剂，是指与疫苗抗原配合使用能增强机体对疫苗制品免疫应答反应的物质。常用的免疫佐剂有灭活的结核分枝杆菌(卡介苗)、胸腺肽、双链聚核苷酸、氢氧化铝铝胶佐剂及矿物油佐剂等。目前免疫佐剂普遍存在以下问题：(1)灭活的结核分枝杆菌佐剂，由于自然的结核分枝杆菌具有高毒力，对人和动物有致病力，因此目前都是采用减毒的卡介苗制备佐剂，但是仍然存在后续处理要求高，容易造成灭活不彻底导致作为佐剂应用时引发高度的动物健康危害性，此外还引起严重的动物不良反应或局部肉芽肿病变等，再加上细菌发酵条件严格、发酵周期长、生长缓慢、对营养要求高，因此其严禁应用于商品疫苗。(2)胸腺素已应用于人类肿瘤治疗，但价格较为昂贵，不可能用于动物疫苗。(3)双链聚核苷酸(聚肌胞)已经成为常规抗肿瘤药物，但是鉴于其半衰期短，体内呈一过性反应，其作为禽用油乳剂灭活疫苗免疫佐剂的效用仍不明确。(4)氢氧化铝铝胶佐剂是目前动物疫苗常用佐剂，其主要通过使抗原佐剂复合物在注射部位形成缓释效应，并且一定程度上刺激免疫反应而发挥佐剂效应，但是其在细菌性疫苗效果明显优于病毒性疫苗，且佐剂刺激作用有限。
综上所述，目前市场上缺乏真正高效、经济的动物疫苗用佐剂，因此新型的免疫佐剂用于改善动物免疫效果，成为畜禽养殖业亟待解决的重要问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种生物活性高、无生物毒性的类白喉棒状杆菌作为免疫佐剂在禽用油乳剂灭活疫苗中的应用，所述类白喉棒状杆菌具有与白喉棒状杆菌相似的佐剂作用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
类白喉棒状杆菌作为免疫佐剂在禽用油乳剂灭活疫苗中的应用。
所述的类白喉棒状杆菌是指在形态及生物学特性方面与白喉棒杆菌类似的棒状杆菌，即除高致病性白喉棒状杆菌外的低致病或非致病性棒状杆菌，主要包括但不限于如下细菌：如假白喉棒状杆菌、溃疡棒状杆菌、假结核棒状杆菌、痤疮丙酸杆菌(即短小棒状杆菌)等。
所述的类白喉棒状杆菌具有下述特征：好氧或兼性厌氧，好氧生长形成表面膜；接触酶阳性；革兰氏染色为强阳性，不易脱色；镜检呈单个、成对、v字形或平行排列，并且出现相当比例球杆菌状态的细菌，其镜检状态眼观与白喉杆菌具有高度相似性；细菌细胞壁肽聚糖为特征性的消旋二氨基庚二酸为主要成分；对人和动物致病力低，不致病或条件致病。
所述的类白喉棒状杆菌优选好氧培养；接触酶阳性；革兰氏染色为强阳性，染色固着力强不易脱色；镜检呈现大比例球杆菌状态；细菌细胞壁肽聚糖为消旋二氨基庚二酸结构；对人和动物常规条件不致病；具有佐剂活性的白喉棒状杆菌样的细胞壁肽聚糖和棒状杆菌酸。
目前的研究已经证明，白喉棒状杆菌由于具有特殊化学结构的细胞壁肽聚糖和棒状杆菌酸而具有强佐剂作用，但其具有高致病性，因而其生物安全性很低，限制了其作为佐剂的应用。本发明提供的类白喉棒状杆菌具有与白喉棒状杆菌化学结构上相似的细胞壁肽聚糖和棒状杆菌酸，因而具有与白喉棒状杆菌相似的佐剂作用，但同时生物安全性很高，代表株为假白喉棒状杆菌(corynebacteriumpseudodiphtheriticum)和假结核棒状杆菌(corynebacteriumpseudotuberculosis)；优选具有高度生物安全性，实验室条件下对实验动物无或极低致病力的假白喉棒状杆菌。
所述的假白喉棒状杆菌的特征如下：好氧培养，常见糖类发酵不产酸；接触酶阳性；革兰氏染色为强阳性，染色固着力强不易脱色；镜检呈现大比例球杆菌状态；细菌细胞壁肽聚糖为消旋二氨基庚二酸结构；对人和动物常规条件不致病；具有佐剂活性的白喉棒状杆菌样的细胞壁肽聚糖和棒状杆菌酸。
假白喉棒状杆菌作为佐剂具有如下优点：(1)具有高表达量的白喉棒状杆菌样的细胞壁肽聚糖和棒状杆菌酸，表现为革兰氏染色为强阳性，染色固着力强不易脱色；(2)自然无毒力，不会引起研究人员和生产人员发生意外感染，降低了实验室生物材料泄露造成的环境污染的可能；(3)需氧发酵，发酵条件要求低；(4)增殖速度快，发酵周期短；(5)营养要求不高，发酵成本低；(6)后处理简单，活性成分损耗小。
一种禽用油乳剂灭活疫苗的制备方法，采用了类白喉棒状杆菌作为免疫佐剂，包括下述步骤：
(1)佐剂液的制备：取类白喉棒状杆菌佐剂粉末1～10质量份，溶于生理盐水中制备成10～100mg/ml浓度的佐剂液，优选25mg/ml浓度；将佐剂液进行常规除菌处理后4℃保存备用；
(2)抗原水相的制备：取75～96体积份，优选94体积份的灭活抗原，无菌条件下添加1～22体积份，优选2体积份佐剂液，再加入3～6体积份灭菌的吐温80(tween80)，优选加入4体积份灭菌的吐温80(tween80)，振荡或搅拌至tween80完全溶解后得到抗原水相；
(3)疫苗的制备：灭菌油相中含有6％(体积百分比)司本80(span80)和1％(体积百分比)硬脂酸铝，抗原水相与灭菌油相的体积比为1:1.5～1:3，优选抗原水相与灭菌油相的体积比为1:2，将抗原水相缓慢加入到灭菌油相，进行乳化，制备得到禽用油乳剂灭活疫苗。
佐剂在抗原水相中的最终浓度为0.2～2mg/ml，优选0.5mg/ml。
所述乳化，是在抗原水相加入过程中保持4000～6000rpm/min，优选5000rpm/min低速搅拌，待抗原水相完全加入到灭菌油相后，调节转速为12000～20000rpm/min，优选16000rpm/min，进行高速剪切乳化2～5min，优选为3min。
本发明的类白喉棒状杆菌活性成分作为佐剂与现有佐剂产品相比具有如下优点和效果：
(1)本发明提供的类白喉棒状杆菌活性佐剂具有高度耐氧性、不需要厌氧发酵、发酵工艺简单且生产周期短、产量高等特点，并且具有高免疫刺激活性，可非特异性刺激t、b淋巴细胞免疫功能，促进多种细胞因子分泌，其添加到禽用油乳剂灭活疫苗中可以明显促进疫苗诱导动物抗体的产生，并且实验证明诱导抗体水平在球虫阳性场无明显下降。
(2)本发明提供的类白喉棒状杆菌活性佐剂具备高度安全性，其活性成分相比常规的卡介苗佐剂(灭活的结核分枝杆菌)具备非常明显的安全性，无任何明显不良反应，动物应用后，疫苗注射局部无明显残留，而常规的卡介苗佐剂局部肉芽肿反应强烈。
(3)本发明提供的类白喉棒状杆菌活性佐剂研究和生产具有高度安全性，产物和副产物均不会污染环境。
(4)经试验证明，本发明制备的禽用油乳剂灭活疫苗用于免疫动物后诱导的抗体水平显著高于无佐剂添加的对照组疫苗，因此本发明提供的类白喉棒状杆菌可以作为有效佐剂用于禽用油乳剂灭活疫苗。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1：新城疫+h9亚型禽流感二联油乳剂灭活疫苗(简称新流二联疫苗)的制备
(1)佐剂样本灭菌处理及定量
取类白喉棒状杆菌佐剂制品粉末样本1g，溶于40ml生理盐水后制备成25mg/ml浓度佐剂液，将佐剂液进行常规除菌处理后4℃保存备用。
(2)抗原水相的制备：
①无佐剂对照组抗原水相：取94ml灭活的新城疫+h9混合抗原(新城疫抗原(简称nd抗原)：h9亚型禽流感抗原＝1:1比例混合，新城疫抗原和h9亚型禽流感抗原均为鸡胚制备抗原原液)，无菌条件下添加2ml灭菌生理盐水，再加入4ml灭菌的tween80，振荡或搅拌至tween80完全溶解后，即为无佐剂对照组抗原水相(总量为100ml)。
②佐剂组抗原水相(佐剂终浓度为0.5mg/ml)：取94ml灭活的新城疫+h9混合抗原(新城疫抗原：h9亚型禽流感抗原＝1:1比例混合，新城疫抗原和h9亚型禽流感抗原均为鸡胚制备抗原原液)，无菌条件下添加2ml佐剂，再加入4ml灭菌的tween80，振荡或搅拌至tween80完全溶解后，即为佐剂组抗原水相(总量为100ml)。
(3)疫苗制备：
①无佐剂对照组疫苗制备：取上述制备的无佐剂对照组抗原水相100ml，缓慢加入200ml灭菌油相(含6％span80和1％硬脂酸铝)，使用ikat25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化3min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。
②佐剂组疫苗制备：取上述制备的佐剂组抗原水相100ml，缓慢加入200ml灭菌油相(含6％span80和1％硬脂酸铝)，使用ikat25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化3min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。
注意，疫苗制备顺序为先制备无佐剂对照组疫苗，然后再制备佐剂组疫苗，以期最大可能的降低试验误差。
(4)油乳剂灭活疫苗物理性状检测
取上述制备并分装的疫苗，回温到室温后，分别检测以下物理性状：
a.每组疫苗各取10ml样本用旋转粘度计检测疫苗粘度；
b.分别将每组疫苗缓慢滴加到静置水面上，观察疫苗扩散情况，除第一滴外，后续滴加到水面的疫苗不分散为合格；
c.每组各取30ml疫苗，分别分装入3支10ml锥底离心管，3000rpm/min离心20min，观察有无分层破乳现象；如有破乳分层，说明疫苗不合格需重新制备；
d.上述经过离心的疫苗，标记后分别置于37℃，室温，4℃保存1个月，观察是否破乳，管底出现水相小于0.5ml为合格。
物理性状测试结果为：
a.试验组疫苗粘度36.4cp，对照组疫苗41.6cp。
b.试验组疫苗与对照组疫苗均合格。
c.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格。
d.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格。
(5)油乳剂灭活疫苗安全性试验：采用上述制备的2种疫苗分别免疫21日龄spf鸡，1ml/只，每组疫苗免疫10只，每日观察鸡的健康状态，连续观察14天。
检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。
(6)油乳剂灭活疫苗效力性试验：采用上述制备的疫苗免疫21日龄spf鸡，0.3ml/只，每组疫苗免疫10只，每只鸡标记脚号，疫苗注射后1周起，每周采血分离血清进行nd和h9亚型禽流感的hi检测，连续检测3周，比较对照组疫苗与佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。检测结果如表1、表2所示。
表1.新流二联疫苗的h9抗体测定结果
表2.新流二联疫苗的nd抗体测定结果
结论：新流二联油乳剂灭活疫苗试验中，免疫后15天，佐剂组疫苗比无佐剂对照组疫苗表现出更高抗体水平的趋势，至免疫后21天，佐剂组比对照组具有更高抗体水平并且二者间抗体水平差异增大。本实验可以看出，佐剂能显著增强新流二联疫苗抗体水平。
实施例2：h5亚型禽流感(d7株)油乳剂灭活疫苗的制备
(1)佐剂样本灭菌处理及定量
取类白喉棒状杆菌佐剂制品粉末样本1g，溶于40ml生理盐水后制备成25mg/ml浓度的佐剂液，将佐剂液进行常规除菌处理后4℃保存备用。
(2)抗原水相的制备：
①无佐剂对照组抗原水相：取94mlh5亚型禽流感d7株灭活抗原，无菌条件下添加2ml灭菌生理盐水，再加入4ml灭菌的tween80，振荡或搅拌至tween80完全溶解后，即为无佐剂对照组抗原水相(总量为100ml)。
②佐剂组抗原水相(佐剂终浓度为0.5mg/ml)：取94mlh5亚型禽流感d7株灭活抗原，无菌条件下添加2ml佐剂，再加入4ml灭菌的tween80，振荡或搅拌至tween80完全溶解后，即为佐剂组抗原水相(总量为100ml)。
(3)疫苗制备：
①无佐剂对照组疫苗制备：取上述制备的无佐剂对照组抗原水相100ml，缓慢加入200ml灭菌油相(含6％span80和1％硬脂酸铝)，使用ikat25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化3min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。
②佐剂组疫苗制备：取上述制备的佐剂组抗原水相100ml，缓慢加入200ml灭菌油相(含6％span80和1％硬脂酸铝)，使用ikat25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化3min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。
注意，疫苗制备顺序为先制备无佐剂对照组疫苗，然后再制备佐剂组疫苗，以期最大可能的降低试验误差。
(4)油乳剂灭活疫苗物理性状检测：取上述制备并分装的疫苗，回温到室温后，分别检测以下物理性状：
a.每组疫苗各取10ml样本用旋转粘度计检测疫苗粘度。
b.分别将每组疫苗缓慢滴加到静置水面上，观察疫苗扩散情况，除第一滴外，后续滴加到水面的疫苗不分散为合格。
c.每组各取30ml疫苗，分别分装入3支10ml锥底离心管，3000rpm/min离心20min，观察有无分层破乳现象；如有破乳分层，说明疫苗不合格需重新制备。
d.上述经过离心的疫苗，标记后分别置于37℃，室温，4℃保存1个月，观察是否破乳，管底出现水相小于0.5ml为合格。
物理性状测试结果：
a.试验组疫苗粘度40.1cp，对照组疫苗38.7cp。
b.试验组疫苗与对照组疫苗均合格。
c.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格。
d.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格。
(5)油乳剂灭活疫苗安全性试验：采用上述制备的2种疫苗分别免疫21日龄spf鸡，1ml/只，每组疫苗免疫10只，每日观察鸡只健康状态，连续观察14天。
检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。
(6)油乳剂灭活疫苗效力性试验：采用上述制备的疫苗免疫21日龄spf鸡，0.3ml/只，每组疫苗免疫10只，每只鸡标记脚号，疫苗注射后1周起，每周采血分离血清进行d7株的hi检测，连续检测3周，比较对照组疫苗与佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。
表3.h5亚型禽流感(d7株)油乳剂灭活疫苗spf鸡效力性试验检测结果
结论：h5亚型禽流感(d7株)油乳剂灭活疫苗试验中，免疫后21天，佐剂组疫苗比对照组疫苗表现出更高抗体水平的趋势，至免疫后28天，佐剂组比对照组抗体水平差距加大，即佐剂组比对照组抗体高1log2。本实验可以看出，佐剂免疫增强显著。
(7)商品肉鸭免疫试验：采用市购的商品肉鸭，于8日龄左右进行疫苗免疫，0.3ml/只，每组疫苗免疫10只，每只鸭标记脚号，疫苗注射后1周起，每周采血分离血清进行d7株的hi检测，连续检测4周，比较对照组疫苗与佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。
表4.h5亚型禽流感(d7株)油乳剂灭活疫苗商品肉鸭免疫试验结果
结论：h5亚型禽流感(d7株)油乳剂灭活疫苗试验中，免疫后21、28、42天，佐剂组疫苗比对照组疫苗均表现出更高抗体水平，特别是至免疫后42天，对照组抗体呈明显下降趋势而佐剂组下降趋势不明显。本实验可以看出，对于免疫鸭而言，佐剂不但能显著增强疫苗抗体水平，而且能更加持久的维持高抗体水平。
实施例3：h5亚型禽流感(d7+rd8株)二价油乳剂灭活疫苗的制备
(1)佐剂样本灭菌处理及定量
取类白喉棒状杆菌佐剂制品粉末样本1g，溶于40ml生理盐水后制备成25mg/ml浓度佐剂液，将佐剂液进行常规除菌处理后4℃保存备用。
(2)抗原水相的制备：
①无佐剂对照组抗原水相：取94ml灭活的含h5亚型禽流感d7株和rd8株混合抗原，无菌条件下添加2ml灭菌生理盐水，再加入4ml灭菌的tween80，振荡或搅拌至tween80完全溶解后，即为无佐剂对照组抗原水相(总量为100ml)。
②佐剂组抗原水相(佐剂终浓度为0.5mg/ml)：取94ml灭活的含h5亚型禽流感d7株和rd8株混合抗原，无菌条件下添加2ml佐剂，再加入4ml灭菌的tween80，振荡或搅拌至tween80完全溶解后，即为佐剂组抗原水相(总量为100ml)。
(3)乳化制备疫苗：
①无佐剂对照组疫苗制备：取上述制备的无佐剂对照组抗原水相100ml，缓慢加入200ml灭菌油相(含6％span80和1％硬脂酸铝)，使用ikat25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化3min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。
②佐剂组疫苗制备：取上述制备的佐剂组抗原水相100ml，缓慢加入200ml灭菌油相(含6％span80和1％硬脂酸铝)，使用ikat25乳化机乳化，要求乳化机在抗原加入过程中保持5000rpm/min低速搅拌，待抗原完全加入到油相后，调节乳化机转速为16000rpm/min高速剪切乳化3min。乳化后制备的疫苗分装后，置于4℃保持备用。
注意，疫苗制备顺序为先制备无佐剂对照组疫苗，然后再制备佐剂组疫苗，以期最大可能的降低试验误差。
(4)油乳剂灭活疫苗物理性状检测
取上述制备并分装的疫苗，回温到室温后，分别检测以下物理性状：
a.每组疫苗各取10ml样本用旋转粘度计检测疫苗粘度。
b.分别将每组疫苗缓慢滴加到静置水面上，观察疫苗扩散情况，除第一滴外，后续滴加到水面的疫苗不分散为合格。
c.每组各取30ml疫苗，分别分装入3支10ml锥底离心管，3000rpm/min离心20min，观察有无分层破乳现象；如有破乳分层，说明疫苗不合格需重新制备。
d.上述经过离心的疫苗，标记后分别置于37℃，室温，4℃保存1个月，观察是否破乳，管底出现水相小于0.5ml为合格。
物理性状检测结果：
a.试验组疫苗粘度38.2cp，对照组疫苗40.0cp。
b.试验组疫苗与对照组疫苗均合格。
c.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格。
d.试验组疫苗与对照组疫苗均无破乳，二者均合格。
(5)油乳剂灭活疫苗安全性试验：采用上述制备的2种疫苗分别免疫21日龄spf鸡，1ml/只，每组疫苗免疫10只，每日观察鸡只健康状态，连续观察14天。
检测结果：动物无死亡，健康状况良好，合格。
(6)油乳剂灭活疫苗效力性试验：采用上述制备的疫苗免疫21日龄spf鸡，0.3ml/只，每组疫苗免疫10只，每只鸡标记脚号，疫苗注射后1周起，每周采血分离血清进行d7和rd8的hi检测，连续检测3周，比较对照组疫苗与佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。
表5.h5亚型禽流感(d7+rd8株)二价油乳剂对比试验rd8抗体测定结果
表6.h5亚型禽流感(d7+rd8株)二价油乳剂对比试验d7抗体测定结果
结论：h5亚型禽流感(d7+rd8株)二价油乳剂灭活疫苗试验中，免疫后21、28、35、42天，佐剂组疫苗比对照组疫苗均表现出更高抗体水平。本实验可以看出，佐剂能显著增强二价疫苗抗体水平。
(7)商品肉鸡免疫试验
采用市购的商品麻黄肉鸡，于10日龄左右进行疫苗免疫，0.3ml/只，每组疫苗免疫10只，每只鸡标记脚号，疫苗注射后1周起，每周采血分离血清进行d7和rd8的hi检测，连续检测5周，比较对照组疫苗与佐剂添加的实验组疫苗免疫效果差异。
表7.h5亚型禽流感(d7+rd8株)二价油乳剂市场肉鸡灭活疫苗效力对比试验d7抗体测定结果
表8.h5亚型禽流感(d7+rd8株)二价油乳剂市场肉鸡灭活疫苗效力对比试验rd8抗体水平比较
结论：h5亚型禽流感(d7+rd8株)二价油乳剂灭活疫苗免疫麻黄肉鸡试验中，免疫后21、28、35天，佐剂组疫苗比对照组疫苗均表现出更高抗体水平。本实验可以看出，佐剂能显著增强二价疫苗抗体水平。
经过动物实验证明，添加佐剂的油乳剂灭活疫苗免疫效力与未添加的有显著的差异；并且添加佐剂的油乳剂疫苗具备高度安全性，疫苗注射局部无明显残留。