一种载药的叶酸修饰蒙脱石纳米制剂及其制备方法与流程

本发明属于医疗药物领域，具体涉及到一种载药的叶酸修饰蒙脱石纳米制剂及其制备方法。

背景技术：

靶向给药系统是药剂学研究领域中的热点之一。靶向给药能够选择性的将药物输送至靶标位置，增加疗效的同时减少药物对正常组织的毒副作用。研究表明，某些肿瘤细胞表面高度表达叶酸受体，叶酸与该位点结合呈可饱和性，高度特异性，而正常组织细胞表面相对低表达叶酸受体，与大分子抗体相比，叶酸属于小分子物质，具有易修饰、低免疫原性、化学及物理稳定性好，成本低等诸多优点，使其成为较理想的肿瘤靶向载体。近年来，纳米给药系统是靶向给药系统的研究重点之一。其中无机纳米材料由于具有化学及物理稳定性好、成本低、载药量高、生物相容性良好和表面易于修饰等优点，受到广泛的关注，被多方研究。蒙脱石是一种2：1型的层状硅铝酸盐，作为药用矿物已被多国药典收载，其特殊的带负电荷的层状结构使其具有较强的离子交换能力，高比表面积和强吸/脱附力的特性令其极有可能是一种性能优良的缓/控释制剂载体。在本发明中，通过本发明所阐述的方法步骤所制备的载药的叶酸修饰蒙脱石通过肿瘤部位的epr效应进入肿瘤间质，从而叶酸与肿瘤细胞表面的叶酸受体特异性结合，然后通过叶酸受体介导进入到肿瘤细胞内，实现肿瘤主动靶向给药。

本发明所制备的载药的叶酸修饰蒙脱石纳米制剂可以实现主动肿瘤靶向作用，降低药物的毒副作用，增强药物的治疗作用。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对，提供一种新的载药的叶酸修饰蒙脱石纳米制剂及其制备方法。该新型载药的叶酸修饰蒙脱石纳米制剂在实现负载药物缓释作用的同时，还可通过修饰的叶酸的肿瘤靶向性实现主动靶向作用，由此降低药物的毒副作用，增强药物的治疗作用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现，但本发明并不仅限于下述技术：

步骤1：称取处方量的叶酸，三乙胺，n,n-羟基琥珀酰亚胺和二环己基碳二亚胺溶于有机溶剂，室温避光搅拌24h，得到活化的叶酸活性酯。

步骤2：称取处方量的蒙脱石k-10，于70℃加硫酸(1gmmt：10mlh2so4)搅拌0.5h，离心后用水洗涤多次即得空白蒙脱石纳米粒。

步骤3：使用硅烷偶联剂修饰步骤2制得的空白蒙脱石纳米粒，得到氨基修饰的蒙脱土纳米粒。

步骤4：称取步骤1制得的叶酸活性酯和步骤3制得的氨基修饰的蒙脱石纳米粒，分散于无水二甲基亚砜中，搅拌反应24h，得到叶酸修饰的蒙脱石纳米粒。

步骤5：称取步骤4制得的叶酸修饰的蒙脱石纳米粒，分散于甲醇中，得到叶酸修饰的蒙脱石纳米混悬液，制备药物乙醇溶液，加入到上述制剂纳米混悬液中，搅拌吸附后旋转蒸发除去有机溶剂，得到载药的叶酸修饰蒙脱石纳米粒。

步骤6：建立人肝癌hepg-2细胞模型，采用四甲基偶氮唑盐(mtt)比色法研究载药的叶酸修饰蒙脱石纳米粒的细胞毒性。

本发明方法中，步骤1合成叶酸活性酯的试剂包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、二环己基碳二亚胺(dcc)、n,n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、4-二甲氨基吡啶(dmap)、n,n-二异丙基碳二亚胺(dic)、1-羟基苯并三唑(hobt)。所用有机溶剂包括但不限于二甲基甲酰胺(dmf)、四氢呋喃(thf)、二甲基亚砜(dmso)、二氯甲烷(dcm)、三氯甲烷(tcm)等。

附图说明

图1为本发明实施例1所制备的空白蒙脱石纳米粒(mmt)，氨基修饰的蒙脱石纳米粒(mmt-nh2)，叶酸修饰的蒙脱石纳米粒(mmt-fa)和载药的叶酸修饰蒙脱石纳米粒(mmt-fa-cur)的物理外观图

图2为本发明实施例1所制备的空白蒙脱石纳米粒，氨基修饰的蒙脱石纳米粒和叶酸修饰的蒙脱石纳米粒的粒径分布图和zeta电位分布图

图3为本发明实施例1所制备的空白蒙脱石纳米粒，氨基修饰的蒙脱石纳米粒和叶酸修饰的蒙脱石纳米粒的红外光谱图

图4为本发明实施例2中载姜黄素的叶酸修饰蒙脱石纳米粒的体外模拟释放图

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明进行详细描述，但本发明并不仅限于下述实施例。

实施例1

1.叶酸活性酯的制备

分别取0.50g叶酸，0.25gn,n-羟基琥珀酰亚胺，0.44g二环己基碳二亚胺，0.25ml三乙胺溶于无水二甲基亚砜，室温避光搅拌24h。反应结束后过滤除去副产物，乙醚洗涤，干燥，即得叶酸活性酯，密封后避光低温保存备用。

2.空白蒙脱石纳米粒的制备

称取3.0g蒙脱石k-10，加入30ml浓硫酸，于70℃水浴搅拌0.5h。离心收集后，洗涤数次即得空白蒙脱石纳米粒固体，外观如图1(a)所示。

3.氨基修饰的蒙脱石纳米粒的制备

称取0.2g空白蒙脱石纳米粒，加入13ml无水乙醇，超声分散后，加入0.75ml3-氨丙基三乙氧基硅烷，室温避光搅拌20h。反应结束后离心收集，洗涤数次即得氨基修饰的蒙脱石纳米粒固体，外观如图1(b)所示。

4.叶酸修饰的空白蒙脱石纳米粒的制备

称取100mg氨基修饰的蒙脱石纳米粒和20mg叶酸活性酯，分别分散和溶解于无水乙醇和无水二甲基亚砜中，然后混合均匀，室温避光搅拌24h。离心收集，洗涤数次，即得叶酸修饰的蒙脱石纳米粒固体，外观如图1(c)所示。

将制备成的叶酸修饰的蒙脱石纳米粒及前面制备的空白蒙脱石纳米粒、氨基修饰的蒙脱石纳米粒分别均匀分散于水中，采用马尔文激光粒度分析仪测量其粒径和zeta电位，结果如图2(a-f)所示；将制备成的叶酸修饰的蒙脱石纳米粒及前面制备的空白蒙脱石纳米粒、氨基修饰的蒙脱石纳米粒真空干燥，通过红外光谱扫描，得到三者的红外光谱图，如图3所示。

5.载药的叶酸修饰蒙脱石纳米粒的制备

称取20mg叶酸修饰的蒙脱石纳米粒，均匀分散于10ml甲醇中；称取6.5mg姜黄素，溶解于1.5ml乙醇中。将药物溶液加入到纳米粒混悬液中，搅拌吸附后，旋转蒸发除去有机溶剂，洗去多余药物，即得载姜黄素的叶酸修饰蒙脱石纳米粒，外观如图1(d)所示。经过洗涤离心后，用紫外分光光度法测得药物载药量为12.65％。

实施例2

1.红外光谱分析

分别取空白蒙脱石纳米粒，氨基修饰的蒙脱石纳米粒和叶酸修饰的蒙脱石纳米粒进行傅氏转换红外光谱分析，表征结果如图3所示。结果表明三个样品均出现了蒙脱石的特征吸收峰：600cm^-1附近为硅氧四面体(si-o)和铝氧四面体(al-o)的弯曲振动峰，1030cm^-1处为si-o的伸缩振动峰，3620～3650cm^-1处为-oh的伸缩振动峰。相比空白蒙脱石纳米粒(mmt)的红外光谱图，氨基修饰的蒙脱石纳米粒(mmt-nh2)光谱图在3000～2850cm^-1处出现了明显的c-h伸缩振动峰，证明氨基成功修饰在蒙脱石表面。再者，相比空白蒙脱石纳米粒和氨基修饰的蒙脱石纳米粒的红外光谱图，叶酸修饰的蒙脱石纳米粒(mmt-fa)出现了几个酰胺键的特征吸收峰：3500～3100cm^-1处的n-h伸缩振动峰，1680～1630cm^-1处的c＝o伸缩振动峰，1655～1590cm^-1处的n-h弯曲振动峰，1420～1400cm^-1处的c-n伸缩振动峰，从而证明了叶酸的成功修饰。

2.体外释放

采用透析袋法测定叶酸修饰的蒙脱石纳米粒的释药特性，结果如图4所示。结果表明：姜黄素原料药与叶酸修饰的蒙脱石纳米粒的释药曲线有明显差异。

3.细胞毒性研究

建立人肝癌hepg-2细胞模型，采用四甲基偶氮唑盐(mtt)比色法进行细胞毒性研究。对照组(a组)为空白蒙脱石纳米粒，实验组1(b组)为载姜黄素的空白蒙脱石纳米粒，实验组2(c组)为载姜黄素的叶酸修饰蒙脱石纳米粒。于24孔板中培养hepg-2细胞，待细胞生长贴壁后，按组给药，孵育24h后加入20μlmtt溶液，继续培养4h，弃去培养液，加入二甲基亚砜充分溶解甲瓒结晶物，在酶联免疫检测仪测量吸光值，进而求算各组细胞抑制率。实验结果表明：c组的细胞抑制率显著高于b组，说明叶酸修饰的蒙脱石纳米粒具有肿瘤靶向作用，能更好地被肿瘤细胞摄取。