本发明属于医药领域，涉及一种流感疫苗，具体涉及一种适用于老年人群的高剂量四价流感疫苗组合物。
背景技术：
：中国是流感高发地区，自1957年以来中国大陆和香港发生了几次流感大流行，其病毒株也源于两地。而流感和并发性肺炎在成人(≥40岁)死亡的主要原因中排名第四，特别是流感在老年人群中可引起高致病率和高死亡率，随着年龄增长，尤其70岁以上，除了由急性流感和继发性细菌性肺炎造成的死亡外，流感还可增加缺血性心脏病，脑血管疾病，糖尿病人群的住院率和死亡率。由于老年人免疫力低下，现有的流感疫苗对老年人的保护不力，疫苗效力低于青壮年(分别为68.6％和74％)。疫苗免疫效力可能只有健康成人的60％并且效力随着年龄增加及免疫力衰退的加剧而下降。目前中国拥有世界上最大的老年人口(>8000万)，今后随老年人口继续增加，流感流行将造成更大的健康危害和社会经济负担。专利cn102245203a公开了一种针对季节性毒株或大流行毒株的疫苗，包含来自两种甲型流感毒株h1n1和h3n2和一种乙型流感毒株的抗原。专利cn106668854a公开了一种四价亚单位流感疫苗，由h1n1型、h3n2型、by型和bv型的病毒单价原液制备而成，但每株的血凝素含量均为26.4μg-39.6μg/ml。专利cn103285391a公开了一种人用季节性流感与大流行流感联合疫苗，各疫苗血凝素浓度分别为：h1n1型人流感疫苗10-60μg/ml，h3n2型人流感疫苗10-60μg/ml，b型人流感疫苗10-60μg/ml，h5n1型人禽流感疫苗10-60μg/ml。赛诺菲公司在2009年上市有三价高剂量流感疫苗fluzone，研究表明高剂量fluzone在65岁以上老年群体中预防流感时比标准剂量fluzone更有效，产生的血清抗体滴度显著高于标准剂量fluzone并且是安全的。高剂量的三价fluzone疫苗每针剂中每株血凝素含量为60μg，总血凝素含量为180μg；标准剂量的三价fluzone疫苗每针剂中每株血凝素含量为15μg，总血凝素含量为45μg。gsk公司在2012年上市有四价流感疫苗fluarix，但是其仍为标准剂量的四价流感疫苗，其效力无法达到令人满意的效果。由此可见，高剂量四价流感疫苗仍然没有被报道，其原因是：若按高剂量三价流感疫苗的配方，每剂四价高剂量的流感疫苗，每株病毒血凝素含量为60μg，其总血凝素含量高达240μg。随着血凝素含量的增加可以推测其注射后副反应相应增加。技术实现要素：为克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种高剂量四价流感疫苗组合物，具有比标准剂量免疫效果好的优势，同时本发明组合物可分两次注射的方式减轻了每针接种剂量，减少注射后副反应，并且还可以根据当年型流感病毒流行情况选择或改变组合物中疫苗的施用程序，特别适合于老年流感的预防。因此，本发明的第一方面提供了一种四价流感疫苗组合物，包括第一疫苗以及第二疫苗，所述的第一疫苗由任意两种甲型流感病毒亚型原液制备而成，所述的第二疫苗由乙型victoria系和yamagata系病毒原液制备而成，每株流感病毒的血凝素含量为15-60μg/ml。优选的，所述的任意两种甲型流感病毒亚型选自hana型流感病毒中的两种，所述ha选自h1～h16，所述na选自n1～n10，所述hana是由h1～h16与n1～n10排列组合成的，例如h1n1，h1n5，h2n2，h3n2，h5n1，h7n9，h9n2等。优选的，所述的任意两种甲型流感病毒为h1n1型和h3n2型。优选的，所述的四价流感疫苗组合物中每株流感病毒的血凝素含量为40-60μg/ml，更优选的，所述的四价流感疫苗组合物中每株流感病毒的血凝素含量为60μg/ml。本发明所述的四价流感疫苗组合物中每株流感病毒的血凝素含量为60μg/ml时，通常认为是高剂量的流感疫苗，其中高血凝素含量可增加疫苗免疫原性，诱生更高水平的抗血凝素抗体。而考虑到高剂量所带来的安全性问题，本发明的组合物中采用两种疫苗组合的形式，令人惊奇的是，两次免疫接种效果显著优于单次免疫。在本发明一个特别优选的实施方式中，所述的四价流感疫苗组合物，包括第一疫苗以及第二疫苗，所述的第一疫苗由h1n1型和h3n2型流感病毒亚型原液制备而成，所述的第二疫苗由乙型victoria系和yamagata系病毒原液制备而成，每株流感病毒的血凝素含量为60μg/ml。优选的，本发明所述的第一疫苗和第二疫苗均为裂解疫苗。本发明所述的裂解疫苗可以通过用表面活性剂处理包膜病毒以使包膜中的蛋白溶解而产生的病毒裂解疫苗。在流感病毒的情况下，ha和na变得溶解。在一个实施方式中，可以使用非离子型表面活性剂生产裂解疫苗。非离子型表面活性剂的实例包括但不限于壬酰基-n-甲基葡萄糖胺、脱氧胆酸钠、tritonx-100、辛基葡萄糖苷、洋地黄皂苷、辛乙烯二醇单正十二烷基酯、十二醛二甲缩醛、tween(例如tween20、80或120)等。在本发明的一个实施方式中，所述的高剂量四价流感疫苗组合物可以采用如下方法制备：(1)取任意两种甲型流感病毒亚型分别接种9-12日龄鸡胚尿囊，培养36-60小时后，分别收集尿囊液，灭活病毒，采用表面活性剂裂解病毒颗粒，再分别分离和纯化，得到第一疫苗的原液；(2)取乙型victoria系和yamagata系病毒分别接种9-12日龄鸡胚尿囊，培养36-60小时后，分别收集尿囊液，灭活病毒，采用表面活性剂裂解病毒颗粒，再分别分离和纯化，得到第二疫苗的原液；(3)将得到的第一疫苗原液与第二疫苗原液分别制备成第一疫苗和第二疫苗。优选的，所述的步骤(1)中任意两种甲型流感病毒亚型分别为a1流感病毒(a/california/7/2009，h1n1)和a3流感病毒(a/hongkong/4801/2014)，所述的步骤(2)中乙型victoria系和yamagata系病毒分别为b1流感病毒(b/brisbane/60/2008，b/victoria)和b2流感病毒(b/phuket/3073/2013，b/yamagata)。优选的，所述的第一疫苗和第二疫苗中还含有药学上可接受的辅料，例如赋形剂/载体、佐剂、ph调节剂、冻干保护剂、防腐剂等。在本发明的一个具体实施方式中，所述的第一疫苗和第二疫苗中包含佐剂，佐剂的作用是增强在接受组合物的患者中引起的免疫应答(体液免疫和/或细胞免疫)。所述的佐剂包括但不限于：钙盐和铝盐：钙盐包括磷酸钙；铝盐包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等，所述盐可采取任何合适形式(如凝胶、晶体、无定形态等)；皂苷：来自皂树、人参、丽花菝葜、满天星和肥皂草等皂苷；免疫刺激复合物(iscom)；细菌adp-核糖基化毒素：包括大肠杆菌不耐热肠毒素lt、霍乱毒素ct、或百日咳毒素pt以及它们的解毒衍生物，如称为lt-k63和lt-r72的突变体毒素；聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯：包括与辛苯聚醇组合的聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂，以及与至少一种其它非离子型表面活性剂(例如辛苯聚醇)组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚；胞壁酰肽：例如n-乙酰基-胞壁酰-l-苏氨酰基-d-异谷氨酰胺(thr-mdp)、n-乙酰基-去甲胞壁酰-l-丙氨酰基-d-异谷氨酰胺(nor-mdp)、dtp-dpp(theramidetm)、mtp-pe；甲基肌苷5′-单磷酸酯(mimp)；多羟基化吡咯双烷(pyrrolizidine)化合物或其药学上可接受的盐或衍生物；菊粉或其衍生物：包括藻类菊粉(algammulin)；cd1d配体：包括α-半乳糖苷神经酰胺；聚氧鎓离子(polyoxidonium)聚合物或其它n-氧化的聚乙烯-哌嗪衍生物。本发明所述的第一疫苗和第二疫苗还可以是水包油乳液。所述的乳液中至少包含一种油以及至少一种表面活性剂。所述的油选自动物来源或植物来源的油。植物来源的油包括花生油、大豆油、椰油、橄榄油、霍霍巴油、红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、玉米油等；动物来源的油包括鲸蜡、角鲨烯等。所述的的表面活性剂包括但不限于：聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性剂(吐温)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；环氧乙烷(eo)、环氧丙烷(po)和/或环氧丁烷(bo)的共聚物，以dowfax为商品名出售，例如线形eo/po嵌段共聚物；重复的乙氧基(氧-1，2-乙二基)基团数目可能不同的辛苯聚醇，其中特别是辛苯聚醇-9(曲通x-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(igepalca-630/np-40)；磷脂，例如磷脂酰聚胆碱(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，例如tergitolnp系列；衍生自月桂醇、鲸蜡醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(brij表面活性剂)，例如三乙烯乙二醇单月桂基醚(triethyleneglycolmonolaurylether)(苄泽30)；和失水山梨糖醇酯(司盘)，例如失水山梨糖醇三油酸酯(司盘85)和失水山梨糖醇单月桂酸酯。优选非离子型表面活性剂。乳液中所含的优选表面活性剂是吐温80(聚氧乙烯失水山梨糖醇单油酸酯)、司盘85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通x-100。本发明所述的疫苗组合物可用于预防儿童和成年人流行性感冒。流感疫苗目前推荐用于儿科和成年人免疫接种，年龄自6个月起。因此，患者可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁、或至少55岁。优选的，接受疫苗的患者为老年人(例如，≥50岁，≥60岁，优选≥65岁)，年轻人(例如，≤5岁)，住院患者，卫生保健人员、军队和军事人员，怀孕的妇女，慢性病、免疫缺陷患者，在接受疫苗前7天中服用抗病毒化合物的患者，和出国的人。然而，这些疫苗不仅适用于这些群体，还可应用于更广泛的人群中。对于流行毒株，优选给予所有的年龄组。本发明所述的疫苗组合物与其它疫苗上同时给予患者，例如与以下疫苗同时给予：麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、风疹疫苗、mmr疫苗、水痘疫苗、mmrv疫苗、白喉疫苗、破伤风疫苗、百日咳疫苗、dtp疫苗、偶联的乙型流感嗜血杆菌疫苗、灭活的脊髓灰质炎病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、脑膜炎球菌偶联物疫苗(例如，四价a-c-w135-y疫苗)、呼吸道合胞体病毒疫苗、肺炎球菌偶联物疫苗等。与肺炎球菌疫苗和/或脑膜炎球菌疫苗同时给予在老年患者中特别有用。本发明所述的疫苗组合物与抗病毒药物，特别是有效抵御流感感毒的抗病毒药物(例如，奥塞米韦和/或扎那米韦)上同时给予患者。所述的抗病病毒药物包括神经氨酸酶抑制剂，例如(3r，4r，5s)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亚氨基甲基)-氨基]-2，6-脱水-3，4，5-三脱氧-d-丙三基-d-半乳糖壬(galactonon)-2-烯酸(enonicacid)，包括它们的酯(例如乙酯)和它们的盐(例如磷酸盐)。优选的抗病毒化合物是(3r，4r，5s)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-羧酸乙酯磷酸盐(1:1)，也称为磷酸奥塞米韦(达菲)。本发明的第二方面提供了一种第一疫苗和第二疫苗联用在制备预防流感药物中的应用，所述的第一疫苗由任意两种甲型流感病毒亚型原液制备而成，所述的第二疫苗由victoria型和yamagata型病毒原液制备而成，每株流感病毒的血凝素含量为15-60μg/ml。优选的，所述的任意两种甲型流感病毒亚型选自hana型流感病毒中的两种，所述ha是指h1～h16，所述na是指n1～n10，所述hana是由h1～h16与n1～n10排列组合成的，例如h1n1，h1n5，h2n2，h3n2，h5n1，h7n9，h9n2等。优选的，所述的任意两种甲型流感病毒为h1n1型和h3n2型。优选的，所述的联用为先施用第一疫苗后施用第二疫苗，或者，先施用第二疫苗后施用第一疫苗。更优选的，所述的第一疫苗与第二疫苗的施用间隔为3-10天，最优选的，所述的第一疫苗与第二疫苗的施用间隔为7-10天。本发明的第三方面提供了一种预防流感的方法，所述的方法包括先后施用第一疫苗和第二疫苗，所述的第一疫苗由任意两种甲型流感病毒亚型原液制备而成，所述的第二疫苗由乙型victoria系和yamagata系病毒原液制备而成，每株流感病毒的血凝素含量为15-60μg/ml。在本发明的一个实施方式中，所述的方法包括先施用第一疫苗，之后施用第二疫苗；在本发明的另一个实施方式中，所述的方法包括先施用第二疫苗，之后施用第一疫苗。更优选的，所述的第一疫苗与第二疫苗的施用间隔为3-10天，最优选的，所述的第一疫苗与第二疫苗的施用间隔为7-10天。本发明所述的四价流感疫苗组合物通过两次免疫接种，其免疫效果显著优于单次免疫，高剂量的组合物中高血凝素含量可增加疫苗免疫原性，诱生更高水平的抗血凝素抗体，而且多样化的施用方式可根据流感病毒流行病学监测，选择或改变使用第一疫苗和第二疫苗的免疫顺序，增加疫苗的保护效果。因此，本发明的高剂量四价流感疫苗组合物，为免疫力低下、对高剂量疫苗的副反应耐受性差的高位老年人群提供一种安全有效、新型老年流感疫苗和免疫模式。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1高剂量四价流感疫苗组合物的制备收获液制备：采用世界卫生组织(who)推荐的并经国务院药品监督管理部门批准的a1(a/california/7/2009，h1n1)、a3(a/hongkong/4801/2014，h3n2)、b1(b/brisbane/60/2008，b/victoria)和b2(b/phuket/3073/2013，b/yamagata)四种流感病毒株，分别接种9-11日龄健康鸡胚，经33～35℃、48～72小时培养，2～8℃冷胚后收获病毒液。病毒灭活：单价病毒合并液中加入终浓度200μg/ml的甲醛进行病毒灭活。超滤浓缩：灭活后的收获液进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液。浓缩后两步纯化：先采用蔗糖密度梯度离心法35000rpm离心纯化，超滤除糖后，再采用柱层析法纯化，280nm紫外检测收集病毒峰。病毒裂解：病毒纯化液加入裂解剂tritonx-100进行病毒裂解，得到病毒裂解液。裂解后纯化：病毒裂解液再次经过蔗糖密度梯度离心纯化，然后用超滤法去除蔗糖，纯化后的病毒裂解液经除菌过滤，即为单价原液。采用上述方法制备得到的单价原液分别配制成高剂量疫苗：其中，a1流感病毒的血凝素含量为60μg/ml；a3流感病毒的血凝素含量为60μg/ml；b1流感病毒的血凝素含量为60μg/ml；b2流感病毒的血凝素含量为60μg/ml。实施例2标准剂量四价流感疫苗组合物的制备收获液制备：采用世界卫生组织(who)推荐的并经国务院药品监督管理部门批准的a1(a/california/7/2009，h1n1)、a3(a/hongkong/4801/2014，h3n2)、b1(b/brisbane/60/2008，b/victoria)和b2(b/phuket/3073/2013，b/yamagata)四种流感病毒株，分别接种9-11日龄健康鸡胚，经33～35℃、48～72小时培养，2～8℃冷胚后收获病毒液。病毒灭活：单价病毒合并液中加入终浓度200μg/ml的甲醛进行病毒灭活。超滤浓缩：灭活后的收获液进行超滤浓缩，得到病毒浓缩液。浓缩后两步纯化：先采用蔗糖密度梯度离心法35000rpm离心纯化，超滤除糖后，再采用柱层析法纯化，280nm紫外检测收集病毒峰。病毒裂解：病毒纯化液加入裂解剂tritonx-100进行病毒裂解，得到病毒裂解液。裂解后纯化：病毒裂解液再次经过蔗糖密度梯度离心纯化，然后用超滤法去除蔗糖，纯化后的病毒裂解液经除菌过滤，即为单价原液。采用上述方法制备得到的单价原液分别配制成标准剂量疫苗：其中，a1流感病毒的血凝素含量为15μg/ml；a3流感病毒的血凝素含量为15μg/ml；b1流感病毒的血凝素含量为15μg/ml；b2流感病毒的血凝素含量为15μg/ml。实施例3高剂量四价流感疫苗组合物效力实验1.材料与方法1.1材料1.1.1流感疫苗采用实施例1或2中的方法制备得到流感病毒疫苗单价原液分别配制成标准剂量和高剂量试验动物用疫苗(具体免疫剂量的计算参见2.2)，其中第一疫苗标记为a苗，第二疫苗标记为b苗。第一、二批试验所用四型单价原液批号分别为：ya120161001(ha含量190μg/ml)、ya320161001(ha含量286μg/ml)、yb120161001(ha含量129μg/ml)和yb220161001(ha含量112μg/ml)；第三批试验所用四型单价原液批号分别为：ya120161003(ha含量231μg/ml)、ya320161003(ha含量445μg/ml)、yb120161003(ha含量251μg/ml)和yb220161003(ha含量286μg/ml)；标准剂量两针试验所用四型单价原液批号分别为：ya120170601(ha含量199μg/ml)、ya320170601(ha含量273μg/ml)、yb120170601(ha含量106μg/ml)、yb220170601(ha含量277μg/ml)。1.1.2主要试剂及仪器a1(h1n1)、a3(h3n2)、b1(b/victoria)和b2(b/yamagata)流感病毒标准抗原参考品、标准抗体参考品均来源于nibsc；霍乱滤液购自美国sigma公司；氯化钠等常规试剂均为国产或进口分析纯产品；三用电热恒温水箱购自天津市泰斯特仪器有限公司，型号为shhw21-420；纯水仪milli-q低热原型购自法国millipore公司，型号为a10；漩涡震荡仪购自ika公司，型号为v2s025；台式低速离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号为l500；数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司，型号为kq5200de。2免疫原性试验2.1实验动物spf级km小鼠，18-22g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。随机分组，每笼5-6只。2.2免疫剂量免疫剂量的计算：对于实验动物给药剂量的计算，近年来新药药效研究中多以以下公式计算：其中d为药物剂量，k为常数，w为动物体重(kg)，人及不同种类动物的k值不同，如人10.6、小鼠9.1。根据以上所得给药公式及现在市场上常规注射流感疫苗的血凝素含量15μg/株/剂。计算小鼠标准剂量肌肉注射流感疫苗血凝素含量应为4.5μg/株/剂。根据andrewj.dunning(correlatesofprotectionagainstinfluenzaintheelderly:resultsfromaninfluenzavaccineefficacytrial.clinicalandvaccineimmunology,2016,23(3):228-235.doi:10.1128/cvi.00604-15)的报道，本试验使用的高剂量流感疫苗每株血凝素的浓度为18μg/株/剂，是标准剂量疫苗每株血凝素的浓度4.5μg/株/剂的4倍，将单价原液分别配制为老年高剂量、标准剂量四价流感病毒裂解疫苗和高剂量、标准剂量a+b套苗，其中a苗含a1和a3型血凝素高剂量为各18μg/株/剂，标准剂量为各4.5μg/株/剂，b苗含b1和b2型血凝素高剂量为各18μg/株/剂，标准剂量为各4.5μg/株/剂，并分两次接种小鼠，下文中均根据a+b套苗接种先后顺序称为先a苗后b苗或先b苗后a苗。2.3试验设计2.3.1免疫剂量及次数试验试验动物：将小鼠随机分为7组，免疫剂量及次数试验每组12只以上，分为：高剂量单次免疫组、高剂量先a苗后b苗组、高剂量先b苗组后a苗组、标准剂量单次免疫组、标准剂量先a苗后b苗组、标准剂量先b苗后a苗组及pbs对照组。每只小鼠经后腿肌肉注射，注射量控制在0.25ml以内。单次免疫和第二次免疫后21d，由小鼠眼眶采血，并分离血清，置-20℃保存待测，重复3次。其中两次免疫的小鼠，免疫间隔均为7d。2.3.2高剂量二针间隔时间选择试验将小鼠随机分为9组，分别为：先a苗后b苗间隔3d组、7d组和10d组；先b苗后a苗间隔3d组、7d组和10d组。其中试验组每组15只，对照组每组5只。分别在第二次免疫后21d，由小鼠眼眶采血，并分离血清，置-20℃保存。2.4血凝抑制试验每份血清经霍乱滤液处理，进行血凝抑制试验，测定其抗体滴度。血凝抑制试验使用来自nibsc的标准抗原及标准血清以确定和配制血凝抑制试验中所使用的四个血凝单位的抗原浓度。采用微量半加敏法测定每份小鼠血清的血抑抗体滴度。2.5免疫原性的判定抗体滴度为采用血凝抑制法(hi)测定血清中对所有的原型病毒株的抗血凝素抗体，以达到完全抑制凝集最高稀释度的倒数表示。同时设有阳性和阴性血清的参考标准。血抑效价≥40，判为阳性血清；效价＜40，为阴性血清。结果分析和统计：统计各组小鼠血清阳转率及血凝抑制抗体几何平均滴度(higmt)。血凝抑制试验实验结果以<平均几何滴度±标准差>表示。为便于计算，任何hi＜10表示为5。运用spss16.0统计软件对各组试验数据进行mannwhitneytest检验对抗体水平进行显著性检验分析，以p<0.05为显著性差异。“*”表示p<0.05，“**”表示p<0.01，“***”表示p<0.001。结果0.05≥p>0.01被认为是具有统计学意义，而0.01≥p≥0.001被认为具有高度统计学意义。3结果本实验测定动物免疫后血清中抗血凝素抗体滴度，并计算血清阳转率和抗血凝素抗体几何平均滴度。3.1比较动物接种不同剂量次数与阳转率为了了解不同免疫剂量与免疫次数对流感四价裂解疫苗产生抗体的影响，测定7组共261份小鼠血清的抗血凝素抗体滴度，计算各组阳转率(见表1)。表1免疫剂量及次数试验阳转率各组小鼠免疫后血清阳转率统计结果显示，高剂量单次免疫组和高剂量a+b套苗组免疫动物血清中抗各种血凝素抗体均呈现高的阳转率。高剂量单次免疫组血清中抗各种血凝素抗体的阳转率远高于标准剂量的单次免疫组，a3型除外。高剂量a+b套苗组血清中抗各种血凝素抗体的阳转率与标准剂量a+b套苗组阳转率相近似，高剂量a+b套苗组血清中抗b1型血凝素抗体阳转率远高于标准剂量a+b套苗组。无论是高剂量还是标准剂量，两次免疫组阳转率均高于单次免疫组。整体上表明，高剂量组血清阳转率优于标准剂量组，两次免疫组优于单次免疫组。高剂量和标准剂量单次免疫动物后，血清中抗血凝素抗体反应见表2。表2单次免疫高剂量组与标准剂量组免疫后抗血凝素抗体滴度比较型别高剂量组标准剂量组a1120.40±149.72(39)1***51.38±58.16(36)a364.63±78.23(39)47.57±27.88(36)b148.64±65.34(39)1***9.81±10.31(36)b2191.12±296.71(39)1***78.47±143.76(36)注：1：与标准剂量相应组别比较对单次免疫时高剂量与标准剂量组血抑抗体滴度比较显示(表2)，高剂量单次免疫组抗各种血凝素抗体滴度均高于标准剂量单次免疫组，特别是a1、b1和b2(p＜0.001)，pbs组无血抑抗体产生。为研制高剂量a+b套苗，此套苗分a苗和b苗，分别为先a苗后b苗组或先b苗a苗组，进行两次免疫，间隔7d。首先比较标准剂量a+b套苗免疫后动物抗体反应。表3标准剂量a+b套苗两次免疫组抗血凝素抗体滴度比较型别先a苗后b苗组先b苗后a苗组a191.54±118.64(36)3***221.96±268.41(36)2***3***a372.66±74.68(36)3*213.57±200.80(36)2***3***b141.57±54.54(36)2***3***17.48±28.04(36)3**b2461.35±559.78(36)2***3***117.58±495.81(36)注：2：免疫总剂量相同时，先a苗后b苗与先b苗后a苗的比较，3：免疫总剂量相同时，两次免疫组与单次免疫组间的比较。从表3可见，标准剂量a+b套苗无论是先a苗后b苗组，还是先b苗后a苗组，各中抗血凝素抗体滴度均高于表2中标准剂量单次免疫组。进一步比较高剂量a+b套苗免疫动物后抗体反应，见表4。表4高剂量a+b套苗两次免疫组抗血凝素抗体滴度比较注：1：与常规剂量相应组别比较，2：免疫总剂量相同时，先a苗后b苗与先b苗后a苗的比较，3：免疫总剂量相同时，两次免疫组与单次免疫组间的比较。无论是高剂量组中(表2和表4)还是在标准剂量组中(表2和表3)，在免疫总剂量相同时，a+b套苗两次免疫的效果优于单次免疫。从表3和表4中有更令人注意的一致性结果：除抗a3型血凝素抗体滴度与标准剂量相应组别无差异外，高剂量a+b套苗和标准剂量a+b套苗如采取先a苗后b苗的免疫方式，其抗b1和b2的血凝素抗体滴度高于先b苗后a苗组中的抗b1和b2的血凝素抗体滴度；反之，如采取先b苗后a苗的免疫方式，其抗a1和a3型血凝素抗体滴度高于先a苗后b苗组的抗a1和a3型血凝素抗体滴度。除高剂量先a苗后b苗组抗b1型血凝素抗体滴度与先b苗后a苗组抗b1型血凝素抗体滴度无显著差异外，其余各组相应型别的抗血凝素抗体滴度差异均达到显著水平(p＜0.001)。3.2高剂量a+b套苗免疫两次的时间选择为了进一步探究a+b套苗两次免疫的间隔时间对抗体产生的影响，设先a苗后b苗组、先b苗a苗组和pbs对照组，测其间隔3d、7d和10d免疫的小鼠血清中的抗血凝素抗体滴度和阳转率。表5高剂量a+b套苗两次免疫间隔时间和阳转率注：本次试验均采用高剂量进行免疫。从表5可见，当先接种b苗，隔7d再接种a苗时，除对a3和b1型抗原的血清阳转率为93.33％外，其他各组对四型抗原的血清阳转率均为100％。该结果表明，两次免疫的间隔时间及免疫先后顺序对a+b套苗血清阳转率的影响没有显著差异。测定一次高剂量和两次高剂量a+b套苗分别间隔3、7、10d的血抑抗体滴度，见表6。表6.高剂量a+b套苗免疫间隔时间对动物产生抗血凝素抗体滴度的比较注：4：间隔3d与7d对比差异显著性分析，5：间隔3d与10d对比差异显著性分析，6：各间隔组与单次免疫组间差异显著性分析。从表6可见，高剂量a+b套苗组和高剂量的单次免疫组所使用的血凝素总剂量相同，在高剂量a+b套苗组，两次免疫间隔3、7、10d的动物血清抗血凝素抗体滴度高于高剂量单次免疫。高剂量a+b套苗7d和10d组的各项血凝素抗体滴度均高于3d组。同时再次证实，与表2和表3中的结果一致。先a苗后b苗组中，抗b型血凝素抗体滴度增加显著；先b苗后a苗组中，抗a型血凝素抗体滴度明显增加，p＜0.001。本说明书上文中结合具体实施例对本发明进行了阐释，但应理解，这些描述和阐释只是为了更好地理解本发明，而不构成对本发明的任何限定。本领域技术人员在阅读了本申请说明书之后可对本发明的具体实施方式进行必要的改动而不脱离本发明的精神和范围。本发明的保护范围由所附的权利要求书限定，并且涵盖了权利要求的等同变换。当前第1页12