本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种基于尿酸氧化酶和多糖材料的降低尿酸组合物。
背景技术：
哺乳动物体内会产生尿酸氧化酶，将嘌呤代谢产物尿酸转化为尿囊素。尿囊素水溶性极好，极易被排出体外。因此，绝大多数哺乳动物借助自身产生尿酸氧化酶实现了嘌呤代谢产物的快速排出。与此不同的是，人类的尿酸氧化酶基因在进化过程中发生突变被静默，人类无法合成尿酸氧化酶，而必须以尿酸作为嘌呤代谢的最终产物，但尿酸的水溶性极低，其代谢速度十分缓慢，远远低于尿囊素。
代谢能力下降的中老年人更容易在体内积蓄过量尿酸，从而导致痛风。随着人类社会饮食结构的精细化发展，人类摄入高嘌呤食物增多，尿酸代谢压力持续增长，痛风发病逐年有年轻化趋势。
此外，对癌症患者进行化疗会造成细胞短时间内大量死亡，生成并释放大量的尿酸，升高人体血尿酸水平，严重影响患者的安全。
尿酸氧化酶能够迅速将尿酸转化为尿囊素，极大地加快尿酸排出。20世纪70年代，猪源尿酸氧化酶首先被用来进行注射给药，以治疗癌症化疗患者的急性高尿酸血症。20世纪90年代，重组的尿酸氧化酶替代天然来源尿酸氧化酶，用于癌症治疗中。21世纪，聚乙二醇(peg)修饰的重组尿酸氧化酶，延长了重组尿酸氧化酶的半衰期并降低了免疫原性，首次被批准作为疑难性痛风治疗的注射用药。
近年的研究发现，聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶直接注射后仍会出现大量患者出现严重的注射反应和过敏反应。另一个问题是，注射用药后尿酸氧化酶直接作用于血液中的尿酸，迅速瓦解痛风石，出现大量尿酸结晶扩散，造成严重的炎症反应，反而会导致痛风频繁发作。聚乙二醇修饰的尿酸氧化酶直接用药的安全性至今仍存在争议。
中国专利cn1864744a公开了一种含有尿酸氧化酶的药用制剂，尤其涉及含有尿酸氧化酶的液体或冻干的组合物药用制剂。组合物包括活性成分尿酸氧化酶、蔗糖、甘氨酸、表面活性剂和缓冲剂；该组合物是无菌的，可以通过皮下、静脉或肌肉注射进入人体或动物体内发挥作用。
以上专利中，蔗糖是单糖小分子，起到的作用是为尿酸氧化酶提供稳定舒适的环境，作为一种添加剂。
中国专利cn102807973a公布了一种药物组合物，其包含：(a)一种分离的尿酸酶，和(b)药学上可接受的载体；其中，所述尿酸酶与聚合物缀合。并公开了聚合物选自聚(乙二醇)、葡聚糖、聚丙二醇、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。
以上专利中，包括葡聚糖、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素等聚合物与尿酸酶是通过复杂的化学反应实现缀合而得到缀合物，化学反应程序复杂且需要多步骤、苛刻的纯化工艺，而且化学反应和提纯的过程会对酶的药效等性质造成很大影响。
技术实现要素：
近年来，针对现有痛风药物和降尿酸治疗中存在的不足和缺陷，更多/更安全的降尿酸方式成为研究的热点。
本发明构建了基于尿酸氧化酶和多糖材料的降低尿酸组合物，多糖材料的复合可以为尿酸氧化酶提供多重保护，使其在多种生理环境中(包括但不限于血液、体液和消化液)均能保持较高的药物活性和稳定性。
本发明所构建的基于尿酸氧化酶和多糖材料的降低尿酸组合物通过静脉注射、肌肉注射、皮下注射和口服的方法进入人体或动物体内，可以降低人或动物体内的尿酸水平。值得一提的是，多糖材料普遍与生物体的免疫系统、血液、重要器官和消化道等存在特殊相互作用，因此可以帮助解决大分子蛋白药物的免疫原性和安全性等问题。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种基于尿酸氧化酶和多糖材料的降低尿酸组合物，包括尿酸氧化酶和多糖材料。其中的尿酸氧化酶具有高效的分解尿酸能力，可以在生理环境下快速将尿酸分解为尿囊素，并快速代谢出体外。多糖材料通过非共价键(包括但不限于静电相互作用、氢键相互作用和疏水相互作用)与尿酸氧化酶表面进行作用，实现对尿酸氧化酶的包裹，在结构上起到结构外壳的保护作用。此外，多糖是富含氢键的高分子，氢键环境为酶提供了舒适优化的水合环境，也有利于保护尿酸氧化酶的活性和稳定性。生物体内富含糖类物质和类糖结构的物质，因此多数多糖材料与生物体内的器官或组织有较好的相容性和亲和性，如葡聚糖对于血液、壳聚糖对细胞膜等等，因此多糖材料的使用可以促进尿酸氧化酶与生物体之间形成多种相互作用，利于药效的发挥，提高组合物分解尿酸的效率。
优选地，所述的尿酸氧化酶来源于微生物、动物或植物。
所述的微生物包括假丝酵母菌或黄曲霉，所述的动物包括除鸡、人和猿类以外的哺乳动物，所述的植物包括宝库奥都类植物的根或叶。
更优选地，所述尿酸氧化酶选自猪源尿酸氧化酶、假丝酵母菌来源尿酸氧化酶、黄曲霉来源尿酸氧化酶中的一种或几种。
优选地，所述的多糖材料选自多糖或多糖衍生物中的一种或几种的组合。
所述的多糖包括淀粉、唾液酸、葡聚糖、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸与纤维素。
所述的多糖衍生物为淀粉、唾液酸、葡聚糖、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸或纤维素的衍生物。
所述的纤维素包括羟丙基纤维素、乙基纤维素、细菌纤维素。
羟丙基纤维素衍生物包括但不限于羟丙基纤维素接枝聚丙烯酸、羟丙基纤维素接枝聚甲基丙烯酸；乙基纤维素衍生物包括但不限于乙基纤维素接枝聚丙烯酸、乙基纤维素接枝聚甲基丙烯酸。
羟丙基纤维素及其衍生物和乙基纤维素及其衍生物，均有较好的溶解性，结构中存在较大比例的疏水结构，可以与尿酸氧化酶形成有效作用；其分子链刚性较强，结构中同时存在较多的可形成氢键的结构，可以保护和维持尿酸氧化酶，使二者间的疏水作用不至于太过紧致，避免尿酸氧化酶的主体结构变形。因此，羟丙基纤维素及其衍生物和乙基纤维素及其衍生物与尿酸氧化酶的组合物有着更优的效果。
更优选地，所述葡聚糖为分子量范围1000-100000的alpha-葡聚糖和beta-葡聚糖。
更优选地，所述壳聚糖为分子量范围1000-1000000，脱乙酰度55％-100％的壳聚糖(脱乙酰甲壳素)。
更优选地，所述壳聚糖衍生物为分子量范围1000-1000000的壳聚糖接枝聚乙二醇。
聚乙二醇结构接枝到壳聚糖中，可以降低壳聚糖链间较强的相互作用，提高壳聚糖材料在水中的溶解度，可以帮助形成浓度更高、更均相的壳聚糖/尿酸氧化酶组合物。因此，壳聚糖接枝聚乙二醇与尿酸氧化酶的组合物有着更优的效果。
优选地，所述尿酸氧化酶与所述多糖材料的质量比为1：99～99：1。更优选地，所述尿酸氧化酶与所述多糖材料的质量比为1：20～20：1，进一步优选为1:5～1:15，最优选为1：9。尿酸氧化酶与所述多糖材料采用特定的配比，使组合物保持较高的分解尿酸能力与稳定性，可以高效的分解人体或动物体内的尿酸。
本发明所述组合物能够通过直接分解尿酸、促进尿酸代谢等多个层面降低尿酸，降低高尿酸对人体或动物体的危害。基于尿酸氧化酶和多糖材料的降低尿酸组合物使用方法，包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射和口服。
本发明中所述的组合物由尿酸氧化酶和多糖材料通过用静电相互作用、氢键相互作用或亲疏水相互作用来实现药效的，也就是说本发明组合物中尿酸氧化酶和多糖材料是物理共混方式组合，而不是通过化学反应得到的缀合物。本发明可用于降低尿素的尿酸氧化酶和多糖材料的组合物，与现有技术相比，具有以下明显的优势和有益效果：
1)降低尿酸效果明显；
2)组合物稳定性高；
3)与现有降尿酸蛋白药物相比，安全性高。
附图说明
图1：多次服药后实验动物的消化系统主要部位(食道、胃、十二指肠、空肠、回肠和结肠)的h&e染色图片。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定发明。本技术领域的研究人员和技术人员，在本发明实质范围内，做出的变化、改形、添加和替换，都应属于本发明的保护范围。
实施例1
配置含5ml5mg/ml的尿酸氧化酶溶液，ph8.5硼酸缓冲溶液，放置于4℃下。将羟丙基纤维素配置成5ml5mg/ml磷酸缓冲溶液，并置于冰水浴中。将1ml尿酸氧化酶溶液缓慢滴加到羟丙基纤维素溶液中，滴加过程中缓慢搅拌以均匀分散，滴加完成后将反应液置于4℃下，得到组合物溶液。
分解尿酸能力评估方法：利用紫外可见分光光度计检测在尿酸氧化酶与多糖组合物作用下底物(尿酸)的浓度变化，以计算和评估其分解尿酸能力。将0.5ml0.01g/l尿酸氧化酶或其组合物溶液加入2ml1mg/l尿酸溶液中(ph4,ph7,ph8缓冲液)，检测290nm吸光度变化检测尿酸清除直线，利用该变化线的斜率计算其分解尿酸能力(单位：活性单位/mg)。
稳定性评估方法：将尿酸氧化酶或其组合物置于ph4,ph7,ph8缓冲液中，并将其置于40℃下培养1小时，培养完成后将样品迅速冷却至4℃。随后利用上述分解尿酸能力评估方法，检测并计算其在培养后的分解能力，与培养前的分解能力对比，得到稳定性数据。
本实施例对尿酸氧化酶或其组合物的尿酸分解能力以及其稳定性进行分析，结果如下表所示。
在生物体中分解尿酸能力的实验方法如下：
对本实施例中尿酸氧化酶/羟丙基纤维素不同重量比的实验组进行正规动物实验，采用口服的方式对小鼠进行试验，验证口服后降低小鼠尿酸水平的效果。
24只小鼠随机分成3组，分别是空白组，对照组和组合物组(组合物)，空白组指尿酸氧化酶与羟丙基纤维素重量比为0:1的实验组，对照组指尿酸氧化酶与羟丙基纤维素重量比为1:0的实验组，组合物组指尿酸氧化酶与羟丙基纤维素重量比分别为1:9、1:4、1:2的实验组。
空白组，对照组和组合物组分别通过口服喂服生理盐水、尿酸氧化酶溶液和尿酸氧化酶与羟丙基纤维素重量比为1:9、1:4、1:2的组合物溶液。其中保证尿酸氧化酶的喂服剂量统一为5活性单位组合物/kg。
实施例2
配置含5ml5mg/ml的尿酸氧化酶溶液，ph8.5硼酸缓冲溶液，放置于4℃下。将壳聚糖配置成5ml5mg/ml磷酸缓冲溶液，并置于冰水浴中。将1ml尿酸氧化酶溶液缓慢滴加到壳聚糖溶液中，滴加过程中缓慢搅拌以均匀分散，滴加完成后将反应液置于4℃下，得到组合物溶液。
采用与实施例1相同的测试方法，将本实施例中尿酸氧化酶或其组合物的尿酸分解能力以及其稳定性进行分析，结果如下表所示。
与实施例1相比，由于不同的多糖材料具有不同的结构，与尿酸氧化酶的相互作用不同，因此，本实施例中壳聚糖对尿酸氧化酶的包裹和保护效果不同于羟丙基纤维素。
对本实施例所述的降低尿酸的组合物进行正规动物实验，下列实验显示了实施例2所述组合物(尿酸氧化酶/壳聚糖重量比1：9)在口服后降低小鼠尿酸水平的效果。
24只小鼠随机分成3组，分别是空白组(组合物0：1)，对照组(组合物1：0)和组合物组(组合物1：9)，分别通过口服喂服生理盐水、尿酸氧化酶溶液和组合物溶液。其中保证组合物的喂服剂量统一为5活性单位/kg(其中空白组无活性，保证喂服物的质量与其他组相当。服用后六小时内，空白组血尿酸水平稳定维持在～85μmol/l；对照组只在服用一小时后尿酸水平由轻微下降；组合物组在服用三小时和四小时后，血尿酸水平降到～40μmol/l。这是由于本组选用的壳聚糖材料与消化道内膜之间存在较强粘附性，可以延长尿酸氧化酶在消化道内的停留和作用时间。
因多数蛋白药物具有较高的免疫原性，在注射给药之后，会引发用药者体内产生药物抗体，产生耐药性，表现为二次或多次给药失效；而且，注射蛋白药物极易发生过敏反应和输液反应，有较高的安全隐患。普遍认为口服给药无论在患者依从性还是用药安全性上，都优于注射给药，但能够通过口服发挥药效的蛋白药物案例极少。本发明中的组合物通过口服即可发挥药效，实验进行了连续五天，每天口服一次的灌服，即可实现对生物体血尿酸的降低，没有药物失效的现象出现，实验动物均没有出现过敏反应。因药物通过口服，故多次口服之后对小鼠的主要消化器官内膜组织切片进行he染色病理检查，结果如图1所示，检查结果表明连续灌服没有对消化内膜造成明显损伤。
实施例3
配置含5ml5mg/ml的尿酸氧化酶溶液，ph8.5硼酸缓冲溶液，放置于4℃下。将壳聚糖接枝聚乙二醇配置成5ml5mg/ml磷酸缓冲溶液，并置于冰水浴中。将1ml尿酸氧化酶溶液缓慢滴加到壳聚糖接枝聚乙二醇溶液中，滴加过程中缓慢搅拌以均匀分散，滴加完成后将反应液置于4℃下，得到组合物溶液。
采用与实施例1相同的测试方法，将本实施例中尿酸氧化酶或其组合物的尿酸分解能力以及其稳定性进行分析，结果如下表所示。
实施例4
配置含5ml5mg/ml的尿酸氧化酶溶液，ph8.5硼酸缓冲溶液，放置于4℃下。将壳聚糖接枝聚乙二醇配置成5ml5mg/ml磷酸缓冲溶液，并置于冰水浴中。将1ml尿酸氧化酶溶液缓慢滴加到壳聚糖接枝聚乙二醇溶液中，滴加过程中缓慢搅拌以均匀分散，滴加完成后将反应液置于4℃下，得到组合物溶液。
采用与实施例1相同的测试方法，将本实施例中尿酸氧化酶或其组合物的尿酸分解能力以及其稳定性进行分析，结果如下表所示。
通过以上实施例可以看出，本发明可用于降低尿素的尿酸氧化酶和多糖材料的组合物降低尿酸效果明显，组合物稳定性高，与现有降尿酸蛋白药物相比，安全性高。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。