技术简介：
本发明发现miR-17在胃癌细胞中异常高表达，其抑制可有效遏制胃癌增殖。通过开发磺酰胺衍生物A/C作为miR-17特异性抑制剂，实验证实其能显著下调miR-17表达并抑制胃癌细胞存活，IC50值分别为5.6和4.9μM。同时发现羧基麦芽糖铁可抑制该抑制剂光降解，提升药物稳定性。
关键词：miR-17抑制剂,胃癌治疗,磺酰胺衍生物
本发明涉及基因药物领域，尤其涉及一种mir-17基因抑制剂及用于治疗胃癌的用途。
背景技术：
：已知mir-17在多种肿瘤细胞中表达异常，如在胃癌细胞株中表达明显上调，mir-17抑制剂可以有效抑制胃癌细胞的增殖，并促进其凋亡(参考文献：特异性微小rna抑制剂对胃癌细胞增殖的影响，中国病理生理杂志，2009)。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种mir-17基因抑制剂及用于治疗胃癌的用途。为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：一种磺酰胺衍生物用于制备mir-17抑制剂的用途，其化学结构如下：其中，r为(ch2)n，n为1或3。一种mir-17抑制剂组合物，包含上述的磺酰胺衍生物，还包含药学上可以接受的载体，制成药学上可以接受的剂型。优选地，所述药学上可以接受的载体包括一种或多种固体、半固体或液体辅料等。优选地，所述药学上可以接受的剂型包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂等。上述的磺酰胺衍生物在制备抑制胃癌增殖的药物中的应用。上述的组合物在制备抑制胃癌增殖的药物中的应用。本发明的优点：本发明证实，磺酰胺衍生物a、c能有效抑制mir-17表达，可以制备成mir-17表达抑制剂；该衍生物通过抑制mir-17表达可以有效抑制胃癌细胞增殖，可以开发成抑制胃癌生长的药物。现有技术未见该磺酰胺衍生物在抑制mir-17表达和抑制胃癌生长方面的报道。附图说明图1是磺酰胺衍生物a-c对sgc-7901细胞中mir-17表达水平(mir-17/u6)的影响。图2是磺酰胺衍生物a、c对sgc-7901细胞的半数抑制浓度ic50值(μm)。具体实施方式实施例1：一、实验材料磺酰胺衍生物a、b、c参照文献方法自制，化学结构如下表：人胃癌sgc-7901细胞株由本公司长期冻存，使用前进行复苏。rpmi-1640培养基、胎牛血清均购于美国gibco公司。二、实验方法1、细胞培养和分组人胃癌细胞株sgc-7901培养于含10％小牛血清的rpmi1640培养液中，置于37℃、co2体积分数为5％的培养箱中培养。1-2d换液，每3-4d传代1次，实验时选用对数生长期细胞。取对数生长期的sgc-7901细胞，调整细胞密度为1×106个/ml，随机分组如下：磺酰胺衍生物a组：使用含0.5、2、5、25、50μm磺酰胺衍生物a的培养基孵育24h；磺酰胺衍生物b组：使用含0.5、2、5、25、50μm磺酰胺衍生物b的培养基孵育24h；磺酰胺衍生物c组：使用含0.5、2、5、25、50μm磺酰胺衍生物c的培养基孵育24h；对照组：使用不添加药物的空白培养基孵育24h。2、rt-pcr法测定mir-17表达水平提取总rna：收集各组培养24h的sgc-7901细胞，按德国qiagen有限公司产品mirneasyminikit试剂盒说明书进行样本总rna提取。用超微量核酸蛋白测定仪(thermo美国)测定提取样本的总rna浓度及纯度，待用于后续实验。逆转录合成cdna：按照qiagenmiscriptⅱrtkit反转录试剂盒说明书进行，反应体系20μl：5×hiflexbuffer4μl，10×nucleicsmix2μl，rtenzymemix2μl，totalrna(浓度约20ng/μl)+rnase-freeh2o2共12μl。反应条件：37℃60min，95℃5min。反应在美国bio-radc1000touchpcr仪上进行。实时荧光定量pcr反应：采用qiagenmiscriptsybrgreenpcrkit试剂盒，反应体系20μl：2×quantitectsybrgreenpcrmastermix10μl，10×miscriptprimerassay2μl，10×miscriptuniversalprimer2μl，rnase-freeh2o25μl，模板cdna1μl。mir-17特异性引物及u6内参引物均购自德国qiagen有限公司产品。反应在荧光定量pcr仪(rotorgene-q德国)上进行，反应条件：95℃15min，1个循环；94℃15s，55℃30s，70℃30s，40个循环。每个样本做3个复孔，在相同反应条件下同时检测mir-17和u6的扩增情况，程序运行结束后利用rotor-geneqseriessoftware软件进行数据分析，计算mir-17相对u6表达量。3、mtt法检测胃癌细胞增殖率将sgc-7901细胞密度调整为1.0×106个/ml，接种于96孔培养板中，每孔200μl。置于37℃、co2体积分数为5％及饱和湿度的培养箱内培养。待细胞贴壁后按照上述分组方法于给药组加入磺酰胺衍生物a或b或c，使其终浓度分别为0.5、2、5、25、50μm。培养24h后，每孔加入mtt(50mg/ml)20μl，继续培养4h后，吸去培养液，每孔加入二甲基亚砜150μl，在酶标仪波长570nm处测定吸光度(a)值。每组实验重复3次，取均值。计算细胞抑制率，细胞抑制率＝(1-a给药组/a对照组)×100％。使用改良寇氏法计算药物半数抑制浓度ic50值。二、实验结果1、药物孵育处理对mir-17表达水平的影响如表1和图1所示，与对照组相比，磺酰胺衍生物a、c各剂量组均可见mir-17表达水平显著下调(p＜0.05)，磺酰胺衍生物b各剂量组mir-17表达量均未见明显下调(p＞0.05)。表1磺酰胺衍生物a-c对sgc-7901细胞中mir-17表达水平(mir-17/u6)的影响该结果表明，磺酰胺衍生物a、c均可以下调sgc-7901细胞中mir-17表达水平，磺酰胺衍生物b在测试浓度范围内不能下调sgc-7901细胞中mir-17表达水平，磺酰胺衍生物a、c为sgc-7901细胞中mir-17表达水平的有效抑制剂。2、药物孵育处理对sgc-7901细胞增殖的影响细胞增殖抑制试验结果显示，磺酰胺衍生物a、c以剂量依赖方式抑制sgc-7901胃癌细胞的增殖，各剂量组sgc-7901细胞的存活率与对照组存在显著性差异(p＜0.05)；磺酰胺衍生物b各剂量组对sgc-7901细胞的增殖抑制作用不明显，sgc-7901细胞的存活率与对照组的差异不显著(p＞0.05)。磺酰胺衍生物a、c的ic50值如表2和图2。表2磺酰胺衍生物a、c对sgc-7901细胞的半数抑制浓度ic50值(μm)磺酰胺衍生物a磺酰胺衍生物cic50值(μm)5.64.9上述实施例证明，磺酰胺衍生物a、c能有效抑制mir-17表达，可以制备成mir-17表达抑制剂；该衍生物通过抑制mir-17表达可以有效抑制胃癌细胞增殖，可以开发成抑制胃癌生长的药物。现有技术未见该磺酰胺衍生物在抑制mir-17表达和抑制胃癌生长方面的报道。实施例2：发明人研究发现，磺酰胺衍生物a、c在光照条件下会发生下述降解反应：其中，r为(ch2)n，n为1或3。发明人发现，羧基麦芽糖铁可以抑制磺酰胺衍生物a、c光降解。no.1注射液：取磺酰胺衍生物a用灭菌水配制成磺酰胺衍生物a浓度为20mg/ml的注射液，盐酸调节ph至4.6；no.2注射液：取磺酰胺衍生物a、羧基麦芽糖铁用灭菌水配制成磺酰胺衍生物a浓度为20mg/ml、羧基麦芽糖铁浓度为5mg/ml的注射液，盐酸调节ph至4.6；no.3注射液：取磺酰胺衍生物b用灭菌水配制成磺酰胺衍生物b浓度为20mg/ml的注射液，盐酸调节ph至4.6；no.4注射液：取磺酰胺衍生物b、羧基麦芽糖铁用灭菌水配制成磺酰胺衍生物b浓度为20mg/ml、羧基麦芽糖铁浓度为5mg/ml的注射液，盐酸调节ph至4.6。将上述注射液分别置于光照箱中于4500±500lx光照强度下光照10天(温度为25±2℃)，分别测定光照前后磺酰胺衍生物a、c降解百分比，结果如表3：表3光照对磺酰胺衍生物a或c降解的影响本领域技术人员应当知道，上述具体实施方式仅用于解释本发明，本发明的保护范围并不局限于上述具体实施方式。当前第1页12