一种miR-100抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种miR-100抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用，所述miR-100抑制剂为miR-100反义核酸链，序列为5’-TTCGGATCTACGGGTT-3’；本发明miR-100抑制剂能够诱导肿瘤细胞的凋亡，有效诱导肿瘤移植小鼠中肿瘤的生长，增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，提高化疗效果；miR-100是潜在的乳腺癌治疗药物的新靶点，是药物治疗的新途径。
【专利说明】一种miR-100抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及用于治疗乳腺癌的抑制剂，特别涉及一种miR-100抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
(二)【背景技术】
[0002]肿瘤实质上是细胞的恶性增殖，伴随着高的转移能力。导致肿瘤发生的外源性因素包括化学、物理、致瘤性病毒和真菌素等，内源性因素包括机体的免疫状态、遗传因素、激素水平、DNA损伤、原癌基因的激活和抑癌基因的失活等等。这个过程中，细胞凋亡的抑制发挥了关键的作用，细胞凋亡是一种细胞的程序性死亡，细胞受到了外界或者本身的刺激，伤害，并无法修复时，发生细胞凋亡，避免损伤细胞的积累导致疾病的发生，癌症实质上是一种基因疾病，基因突变的细胞没有及时的被清除，并且经过若干年的积累后导致了癌症的发生，所以，重新激活癌症中的凋亡程序，对于癌症的治疗来说，是一种全新的思路。
[0003]乳腺癌死亡率高，肿瘤细胞生长迅速，且转移能力强，人体主要器官例如肺，肝，甚至骨头等癌细胞都能迁移过去，恶性程度非常高，世界上每年大概新增100万新的病例，已经发展成为了在女性癌症发病率最高的一种。目前来说，治疗乳腺癌主要的手段有放疗，化疗和外科手术切除，而放疗和化疗都会对身体造成极大的损伤，对患者的后续生存是个极大的隐患，外科手术对于早期乳腺癌患者的治疗比较有效，中期和晚期癌细胞都已扩散，不能手术切除，并且，许多临床案例表明，癌症的手术切除都有比较高的复发风险，研究出不同于传统方法的全新治疗手段迫在眉睫，对于乳腺癌乃至全部癌症的治疗，都有着至关重要的价值和意义。
[0004]MicroRNAs (miRNAs)是一类最近被发现的非编码小RNA，首先由RNA聚合酶家族转录成pr1-miRNA, pr1-miRNA由dorsha和DGCR8形成的复合物剪切加工，形成precursormiRNA，最后通过Exportin5将其运入细胞质，加工成为成熟体miRNA，常由19-25个核苷酸构成，通过与靶基因mRNA的3’UTR碱基配对结合，以翻译抑制或直接降解的方式，降低靶基因的表达，从而达到了转录后调控的作用。
[0005]研究发现，许多癌症的发生都与miRNA的异常调控有关，miRNA的表达谱会出现明显的变化，其中的机理值得我们深入研究，实验表明，降低被过表达的miRNA或升高被抑制表达的miRNA有时能够导致癌细胞的凋亡，从而抑制肿瘤的生长，是一种潜在而有效地肿瘤治疗手段。
(三)
【发明内容】
[0006]本发明目的是提供一种miR-100抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。 [0007]本发明采用的技术方案是:
[0008]本发明提供一种miR-100抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
[0009]进一步，所述miR-100抑制剂(命名为AM0_miR-100)为miR-100反义核酸链，序列为5’ -TTCGGATCTACGGGTT-3’。所述miR-100抑制剂用于制备治疗乳腺癌的药物。[0010]进一步，所述乳腺癌为乳腺癌细胞SK-BR-3。
[0011]miR-100基因位于细胞核11号染色体，在肿瘤中存在异常表达，研究报道，miR-100基因在卵巢癌、口腔癌、鼻咽癌中表达下调，而在肝癌、前列腺癌、子宫内膜癌和急性粒细胞性白血病中表达上调。
[0012]本研究发现miR-100基因在乳腺癌细胞SK-BR-3中表达量显著上调，通过使用miR-100 抑制剂(AMO(ant1-miRNA-oligonucleotide)-miR-100),可以有效的降低细胞中的miR-100水平，与此同时，细胞发生了明显的凋亡现象，将乳腺癌细胞SK-BR-3接种到裸鼠成瘤后，通过采用尾静脉注射AMO-miR-lOO，能有效的抑制肿瘤在裸鼠体内的生长速率。用miR-100抑制剂处理细胞后，癌细胞对化疗药物顺钼变得更加敏感，显著的增加了顺钼的效能。
[0013]本 申请人:通过研究miR-100基因的表达对乳腺癌细胞系SK-BR-3的影响，发现miR-100基因可能是乳腺癌治疗中的一个新的靶点，有选择地调节miR-100基因的表达，可以影响整个基因网络，从而影响复杂疾病的进程。此外，miR-100抑制剂能有效地增加乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性，增加药物效能，一定程度是减轻化疗对患者毒性。因此miR-100抑制剂有望成为乳腺癌治疗的新药物，广泛应用于乳腺癌的防治
[0014]本发明miR-100抑制剂技术要点如下:
[0015](I)诱导乳腺癌细胞SK-BR-3的凋亡:通过转染miR-100抑制剂进入细胞48h后，显微镜观察到癌细胞的细胞质皱缩，凋亡小体出现，表明细胞发生凋亡。
[0016](2)抑制移植乳腺癌瘤块的生长:首先将细胞种到裸鼠皮下，成瘤后，尾静脉注射miR-100抑制剂，与对照组相比，miR-100抑制剂处理组瘤块生长显著受到抑制。
[0017](3)增加乳腺癌细胞对化疗药物敏感度:首先将miR-100抑制剂转染进入细胞，后用不同浓度的化疗药物顺钼处理细胞，发现与对照组相比，miR-100抑制剂处理组顺钼的EC50显著的降低，显然乳腺癌细胞对化疗药物的敏感度增加。
[0018]本发明的有益效果主要体现在:(I)本发明miR-100抑制剂能够诱导肿瘤细胞凋亡；(2)本发明miR-100抑制剂能够有效抑制肿瘤移植小鼠中乳腺癌瘤块的生长速率；(3)本发明miR-100抑制剂能够显著的增加乳腺癌对化疗药物的敏感度；(4)本发明miR-100抑制剂可能成为一种新型乳腺癌治疗药物。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为miR-100抑制剂AMO-miR-lOO在乳腺癌细胞SK-BR-3中抑制miR-100表达
效率图。
[0020]图2为人乳腺癌细胞SK-BR-3在转染miR-100抑制剂48小时后，细胞形态图，A为转染 AMO-miR-lOO-scarmbled control 的对照组，B 为转染 AMO-miR-lOO 的实验组。
[0021]图3为乳腺癌细胞SK-BR-3在转染miR-100抑制剂48小时后，Annexin V检测的流式结果图，A为转染AM0-miR-100-scarmbled control的对照组，B为转染AMO-miR-lOO的实验组，其中BI为坏死的细胞，B2为晚期凋亡的细胞，B3为活细胞，B4为早期凋亡的细胞。
[0022]图4为不同浓度的miR-100抑制剂处理乳腺癌细胞SK-BR-3后，细胞活力曲线图。
[0023]图5为先用miR-100抑制剂处理乳腺癌细胞SK-BR-3后，再用不同浓度的化疗药物顺钼处理，肿瘤细胞活力图。
[0024]图6为将乳腺癌细胞SK-BR-3接种于裸鼠皮下成瘤后，尾静脉注射miR-100抑制剂I个月，肿瘤的生长速率图。
[0025]图7为将乳腺癌细胞SK-BR-3接种于裸鼠皮下成瘤后，尾静脉注射miR-100抑制齐Li I个月后肿瘤的外观图，1、2、3、4、5为阴性对照组(注射miR-100-scrambled control组)裸鼠的瘤块外观图，6、7、8、9、10为实验组(注射miR-100抑制剂组)裸鼠的瘤块外观图。
[0026]图8为将乳腺癌细胞SK-BR-3接种于裸鼠皮下成瘤后，尾静脉注射miR-100抑制剂I个月后，肿瘤的重量图。
[0027]图9为将乳腺癌细胞SK-BR-3接种于裸鼠皮下成瘤后，尾静脉注射miR-100抑制剂I个月后，瘤块中miR-100的抑制效率图。
(五)【具体实施方式】
[0028]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0029]实施例1:合成miR-100反义核酸链和阴性对照
[0030]将miR-100反义核酸链命名为miR-100抑制剂(即AMO-miR-lOO)，其序列为:5’ -TTCGGATCTAC GGGTT-3’，其碱基修饰方式为:(I):粗体字母的碱基(第3位、第6位、第9位)LNA修饰、(2)斜体字母的碱基2’ OME修饰(第12位、第15位)、(3)全部碱基硫代修饰。(参考专利 CN102311956A)。
[0031]阴性对照(Scrambled control, NC)为碱基序列随机打乱的序列，碱基的GC含量与碱基的修饰方式与miR-100抑制剂均一致，序列为5’ -GTCGGTTCTGATGTCA-3’。
[0032]上述序列均由丹麦Exiqon公司合成。
[0033]实施例2:
[0034](I)取人乳腺癌细胞SK-BR-3 (中科院上海细胞库)，用含10%FBS的1640培养基
培养至细胞密度40%左右。
[0035](2)按照说明书使用Lipofectamine? RNAiMAX转染试剂，转染miR-100抑制剂以及阴性对照，终浓度50nM。
[0036](3)转染48小时后镜检细胞，观察细胞形态的变化，随后收集转染后的细胞，用qPCR检测miR-100抑制剂的抑制效率，及用Annexin V试剂盒(购自美国BD(Becton, Dickinson and Company)公司)检测转染后细胞的凋亡情况，以未转染的人乳腺癌细胞SK-BR-3作为空白对照。
[0037]结果见图1、图2及图3。结果显示miR-100抑制剂(AMO-miR-lOO)能有效的抑制乳腺癌细胞SK-BR-3中miR-100的表达，而且当乳腺癌细胞SK-BR-3中miR-100被抑制之后，细胞形态出现了明显的凋亡现象，Annexin V检测结果也表明用miR-100抑制剂转染的细胞中凋亡细胞所占的比例显著的增加了，表明miR-100抑制剂能够有效地诱导乳腺癌细胞发生凋亡。
[0038]实施例3
[0039](I)取人乳腺癌细胞SK-BR-3，用含10%FBS的1640培养基培养至细胞密度40%左右。[0040](2)按照说明书使用Lipofectamine'? RNAiMAX转染试剂，转染不同浓度miR-100抑制剂(AMO-miR-lOO)以及阴性对照。
[0041](3)转染 48 小时后，收集转染后的细胞，用 MTS[3-(4，5-dimethylthiazol-2_yl)-5- (3-carboxymethoxyphenyl)~2~(4-sulfophenyl) -2H~te trazolium, inner salt]assay试剂盒(购自美国promega公司)检测细胞的活力及增殖活性。
[0042]结果见图4。结果表明miR-100抑制剂能有效的抑制乳腺癌细胞的活力及增殖活性，且随着抑制剂浓度的加大，细胞活力及增殖活性的抑制就越明显，表明miR-100抑制剂能抑制乳腺癌细胞的活力及增殖活性，结果表明了 miR-100抑制剂作为一种乳腺癌治疗药物的可行性。
[0043] 实施例4
[0044](1)取人乳腺癌细胞SK-BR-3，用含10%FBS的1640培养基培养至细胞密度40%左右。
[0045](2 )按照说明书使用Lipofectamine? RNAiMAX转染试剂，转染miR-100抑制剂以及阴性对照，终浓度50nM。
[0046](3)转染6小时后，用生理盐水配制不同浓度的化疗药物顺钼溶液((Cisplatin,⑶DP)购自上海生工)，分别加入转染后的培养基中，使顺钼终浓度分别达到0、6.25、12.5、18.75,25,50,100 μ Mo
[0047](4)不同浓度的顺钼加入细胞培养基，37°C培养42小时后，用MTS试剂盒检测处理的细胞的活力及增殖活性。以不添加miR-100抑制剂作为空白对照(即AMO-Free)。
[0048]结果见图5。结果表明，用miR-100抑制剂处理乳腺癌细胞后，相比与对照，细胞对于化疗药物的敏感度显著提升，EC5tl显著的降低，增加了化疗药物顺钼的效能。结果表明miR-100抑制剂能显著的提升化疗药物对乳腺癌细胞的效能。显示了 miR-100抑制剂在乳腺癌治疗中的潜在功能。
[0049]实施例5
[0050](I)选取周龄4-5周，体重20g左右的裸鼠20只，每笼五只，饲养在无菌的动物房。
[0051](2)培养乳腺癌细胞SK-BR-3，胰酶消化后用生理盐水重悬细胞，将密度调整为5X IO6 个/ml。
[0052](3)将收集好的细胞皮下注射裸鼠，100 μ I/只，实验组(miR-100抑制剂)和阴性对照组(Scrambled control)每组分别注射10只。
[0053](4)以公知的培养条件在无菌培养室培养至注射的乳腺癌细胞成瘤后，往每组裸鼠分别尾静脉注射80mg/Kg体重的miR-100抑制剂、Scrambled control,每三天注射一次，连续注射一个月后，处死裸鼠，拍照称重。
[0054]结果见图7。结果表明注射miR-100抑制剂后，小鼠的乳腺癌瘤块的重量和大小要明显小于阴性对照组。表明miR-100抑制剂能够有效地抑制小鼠体内乳腺癌的生长。
[0055]实施例6
[0056](I)选取周龄4-5周，体重20g左右的裸鼠20只，每笼五只，饲养在无菌的动物房。
[0057](2)培养乳腺癌细胞SK-BR-3，胰酶消化后用生理盐水重悬细胞，将密度调整为5X IO6 个/ml。[0058](3)将收集好的细胞皮下注射裸鼠，100 μl/只，实验组(miR-100抑制剂)和阴性对照组(Scrambled control)每组分别注射10只。
[0059](4)等注射的乳腺癌细胞成瘤后，往每组裸鼠分别尾静脉注射80mg/Kg体重的miR-100抑制剂、Scrambled control,每三天注射一次,连续注射一个月后,期间测量并记录肿瘤大小，统计瘤块的生长速率。
[0060](5)断颈处死裸鼠后，取出瘤块，通过qPCR检测瘤块里面miR-100抑制情况。
[0061]结果见图8和图9。qPCR结果表明尾静脉注射miR-100抑制剂能有效的抑制小鼠瘤块中miR-100的含量，并且miR-100抑制剂处理的小鼠体内的乳腺癌瘤块生长速率明显小于阴性对照组，表明miR-100抑制剂能够有效地敲低小鼠瘤块中miR-100的含量并抑制乳腺癌瘤块的生长。
【权利要求】
1.一种miR-100抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用。
2.如权利要求1所述miR-100抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用，所述miR-100抑制剂为miR-100反义核酸链，序列为5’ -TTCGGATCTACGGGTT-3’。
3.如权利要求1所述miR-100抑制剂在制备治疗乳腺癌药物中的应用，其特征在于所述乳腺癌为乳腺癌细胞SK-BR-3。
【文档编号】A61K48/00GK103893780SQ201310697679
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2013年12月17日 优先权日:2013年12月17日
【发明者】章晓波, 龚燚, 杨璐 申请人:浙江大学, 中国大洋矿产资源研究开发协会