中国被毛孢发酵液精制液作为蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及动物病害防治领域，特别涉及中国被毛孢发酵精制液作为蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂的应用、拟青霉菌抑菌剂及其制备方法。本发明提供的抑菌剂对于体外和/或体内培养的拟青霉菌有很好的抑制作用，且对蝙蝠蛾幼虫无任何不良影响。对于侵染后的幼虫，虽然持续用药，但是虫体内的中国被毛孢仍能够存活，直至虫体变僵。而且僵虫能够形成子实体原基。
【专利说明】中国被毛孢发酵液精制液作为蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂的应用
[0001]本申请要求于2012年12月19日提交中国专利局、申请号为201210554669.6、发明名称为“中国被毛孢发酵液精制液作为蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂的应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
【技术领域】
[0002]本发明涉及动物病害防治领域，特别涉及中国被毛孢发酵液精制液作为蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂的应用。
【背景技术】
[0003]冬虫夏草是中国的一种名贵中药材，与人参、鹿茸一起列为中国三大补药。早在一七五七年《本草从新》中就有“冬虫夏草甘平保肺，益肾，补精髓，止血化痰，已劳咳，治膈症皆良”的记载。中医认为，虫草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。
[0004]冬虫夏草是一种特殊的虫和真菌共生的生物体，是冬虫夏草真菌(中国被毛孢)的菌丝体通过各种方式感染蝙蝠蛾(鳞翅目蝙蝠蛾科蝙蝠蛾属昆虫)的幼虫，以其体内的有机物质作为营养能量来源进行寄生生活，经过不断生长发育和分化后，最终菌丝体扭结并形成子座伸出寄主外壳，从而形成的一种特殊的虫菌共生的生物体。
[0005]冬虫夏草主产于我国西藏、青海、云南、四川和甘肃等省区海拔3500~5200m局部高寒山区草甸地带，天然资源十分有限，近年来采挖过渡造成生态环境的恶化，天然资源日趋枯竭。因此，人工栽培冬虫夏草势在必行。
[0006]人工栽培冬虫夏草，通过冬虫夏草菌(中国被毛孢)侵染寄主昆虫(蝙蝠蛾幼虫)，进入到寄主的体腔内，并在体腔中繁殖生长，最后产生子座，形成冬虫夏草药材。
[0007]蝙幅蛾(Hepialidae),鱗翅目(Lepidoptera)蝙fe蛾科(Hepialidae)近3OO 种昆虫的统称，全球分布。包括几种最大的蛾类，翅展超过22.5公分(9吋)，飞行很快，但无一定方向。幼虫钻入茎内，或生活在地下吃草根。一般认为，凡是由虫草属的真菌寄生并能产生子实体的菌物结合体都称为冬虫夏草，但中国传统的中医药学所指的冬虫夏草是特指仅分布于我国青藏高原及边缘地区高原草甸中的中华虫草菌。
[0008]在冬虫夏草的人工培育领域，冬虫夏草寄主昆虫即蝙蝠蛾幼虫，常遭受拟青霉菌侵染危害，拟青霉病是造成其死亡的重要原因。如果该病发生蔓延，将会使人工培养冬虫夏草造成严重损失，因此对其采取有效的措施进行防治势在必行。目前对于蝙蝠蛾幼虫的拟青霉病的防治只是单纯的体外预防，在离体培养的条件下采用药剂进行抑制，并不是对活虫体进行实验，并且药剂对于侵染后幼虫体内的中国被毛孢菌种的生长以及幼虫僵化是否会产生影响还不确定。而针对蝙蝠蛾幼虫体内拟青霉侵染的防治，还没有有效的防治方法。若采用化学防治方法，药剂 在蝙蝠蛾幼虫体内是否会有残留，尚未有人测定。因此采用生物防治方法具有一定的优势。
[0009]中国被毛孢是冬虫夏草的无性型，目前有研究称其发酵产物具有一定的抑菌作用，对大肠埃希菌与金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用，而对于真菌的抑制作用尚未见报道。虽然蛹虫草、冬虫夏草以及绿色木霉菌和竹黄等多种发酵液均做过抗菌活性的初步研究，但均只是简单测定发酵液对某几种细菌和真菌的抑制作用，未明确指明其作用机理以及发酵液的具体用途，与真正使用在工业用途上还有较远差距。
【发明内容】
[0010]有鉴于此，本发明提供一种中国被毛孢发酵液的精制液作为蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂的应用、拟青霉菌抑菌剂及其制备方法。本发明提供的抑菌剂对于体外和/或体内培养的拟青霉菌有很好的抑制作用，且对蝙蝠蛾幼虫无任何不良影响。对于侵染后的幼虫，虽然持续用药，但是虫体内的中国被毛孢仍能够存活，直至虫体变僵。而且僵虫能够形成子实体原基。
[0011]本发明中所述的中国被毛孢发酵液精制液，是指中国被毛孢在液体培养基中发酵后，离心或过滤得到上清液，上清液再经蒸发或旋转蒸发等手段，得到10-30倍的发酵精制液。
[0012]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0013]本发明提供了中国被毛孢发酵精制液作为蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂的应用。
[0014]现有抑制拟青霉菌的方法，常采用光照`处理。拟青霉对光照的耐性不强，但在黑暗条件下对拟青霉产孢有影响，故可以通过适度遮光饲养来控制拟青霉产孢。但是光照处理对拟青霉的抑制效果不甚理想。为了尽量避免使用毒性的化学试剂，因此，本发明提供了中国被毛孢发酵精制液作为蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂的应用。
[0015]在本发明的一些实施例中，中国被毛孢发酵液精制液的制备方法包括以下步骤:
[0016]步骤1:取中国被毛孢菌种接种于培养基中发酵,获得中国被毛孢发酵液；
[0017]步骤2:取中国被毛孢发酵液经离心或过滤，收集滤液；
[0018]步骤3:取滤液浓缩10-30倍，即得；
[0019]培养基包含葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、无水硫酸镁、磷酸二氢钾和水，所述葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、无水硫酸镁、磷酸二氢钾和水的质量比为20~32: 6~12: 6~12: 0.4 ~0.6: 0.8 ~1.2: 800 ~1200。
[0020]在本发明的另一些实施例中，步骤I中发酵温度为15_20°C。
[0021]在本发明的另一些实施例中，步骤I中发酵时间为14-25d。
[0022]在本发明的一些实施例中，步骤3中浓缩的温度为40_50°C。
[0023]本发明还提供了一种蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂，其包含有中国被毛孢发酵液精制液。
[0024]在本发明的一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂中，中国被毛孢发酵液精制液的制备方法包括以下步骤:
[0025]步骤1:取中国被毛孢菌种接种于培养基中发酵,获得中国被毛孢发酵液；
[0026]步骤2:取中国被毛孢发酵液经离心或过滤，收集滤液；[0027]步骤3:取滤液浓缩10-30倍，即得；
[0028]培养基包含葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、无水硫酸镁、磷酸二氢钾和水，所述葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、无水硫酸镁、磷酸二氢钾和水的质量比为20~32: 6~12: 6~12: 0.4 ~0.6: 0.8 ~1.2: 800 ~1200。
[0029]在本发明的另一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂中，步骤I中发酵温度为15-20°C。
[0030]在本发明的另一些实施例中，本发明提供的一种蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂中，步骤I中发酵时间为14-25d。
[0031]在本发明的一些实施例中，步骤3中浓缩的温度为40_50°C。
[0032]加入乳化剂能使药物更好的与虫体接触，因此，作为优选，抑菌剂还包含乳化剂。
[0033]作为优选，抑菌剂中乳化剂的质量分数为0.1~1.2%。
[0034]优选地，抑菌剂中乳化剂的质量分数为0.4~1%。
[0035]作为优选，乳化剂为吐温80、聚乙二醇(PEG)、乳化剂0P-10 (烷基酚与环氧乙烷的缩合物)的一种或两者以上的混合物。
[0036]作为优选，乳化剂为吐温80。
[0037]作为优选，本发明提供的抑菌剂的使用方式为向蝙蝠蛾虫体直接喷洒。
[0038]作为优选，每100条虫子喷本发明提供的抑菌剂50_100mL。
[0039]本发明提供一种中国被毛孢发酵液精制液作为蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂的应用、拟青霉菌抑菌剂及其制备方法。蝙蝠蛾幼虫饲养过程中，若未发现感染拟青霉的幼虫，则不进行处理；若群体中出现感染拟青霉的幼虫时，则马上将感病幼虫取出隔离，并对其它幼虫采取防治措施。使用时，首先制备10-30倍的中国被毛孢发酵精制液，并且向溶液中加入乳化剂，混匀后，向蝙蝠蛾幼虫体表喷雾，然后加入适量饲料进行饲养。试验结果表明，本发明提供的抑菌剂对于体外和/或体内培养的拟青霉菌有很好的抑制作用，且对蝙蝠蛾幼虫无任何不良影响。对于侵染后的幼虫，虽然持续用药，但是虫体内的中国被毛孢仍能够存活，直至虫体变僵。而且僵虫能够形成子实体原基。
【具体实施方式】
[0040]本发明公开了一种中国被毛孢发酵液精制液作为蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂的应用、拟青霉菌抑菌剂及其制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0041]本发明提供的中国被毛孢发酵液精制液作为蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂的应用、拟青霉菌抑菌剂及其制备方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0042]下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0043]实施例1[0044]制备发酵液:
[0045]中国被毛孢菌种接种于发酵培养基中，培养基成分为葡萄糖500g,蛋白胨150g,酵母粉300g，无水硫酸镁10g，磷酸二氢钾20g，水25L，于15°C IOOrpm培养25d，获得发酵液。将发酵液离心后取上清，40°C旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10，即获得10倍精制液。
[0046]虫体实验:
[0047]挑选感染中国被毛孢菌的蝙蝠蛾幼虫60条，其中30条使用中国被毛孢15倍发酵精制液向幼虫体表进行喷雾，使用量为每100条虫子喷雾50mL。另外30条作为对照，使用无菌水处理。每隔15d处理一次，处理4个月后处理组中30条幼虫仍然健康存活，经取样镜检发现幼虫体内的中国被毛孢菌体数量仍然很多，并未受到药剂的影响。而且幼虫仍然能够僵化并且长出子实体原基。而对照组中30条幼虫10条感染拟青霉，20条存活。
[0048]对于侵染后的幼虫，持续用药，虫体内的中国被毛孢仍能够存活,直至虫体变僵。而且僵虫能够形成子实体原基。
[0049]实施例2
[0050]制备发酵液:
[0051]中国被毛孢菌种接种于发酵培养基中，培养基成分为葡萄糖800g,蛋白胨300g,酵母粉150g，无水硫酸镁15g，磷酸二氢钾30g，水25L，于20°C IOOrpm培养14d，获得发酵液。将发酵液离心后取上清，50°C旋转蒸发，浓缩至原体积的1/15，即获得15倍精制液，称重然后向其中加入吐温8020g即吐温80质量分数为1.2%。
[0052]虫体实验:
[0053]挑选感染中国被毛孢菌的蝙蝠蛾幼虫60条，其中30条使用中国被毛孢30倍发酵精制液向幼虫体表进行喷雾，使用量为每100条虫子喷雾100mL。另外30条作为对照，使用无菌水处理。每隔15d处理一次，处理4个月后处理组中30条幼虫仍然健康存活，经取样镜检发现幼虫体内的中国被毛孢菌体数量仍然很多，并未受到药剂的影响。而且幼虫仍然能够僵化并且长出子实体原基。而对照组中30条幼虫11条感染拟青霉，19条存活。
[0054]对于侵染后的幼虫，持续用药，虫体内的中国被毛孢仍能够存活，直至虫体变僵。而且僵虫能够形成子实体原基。
[0055]实施例3
[0056]制备发酵液:
[0057]中国被毛孢菌种接种于发酵培养基中，培养基成分为葡萄糖750g,蛋白胨250g,酵母粉250g，无水硫酸镁12.5g，磷酸二氢钾25g，水25L，于18°C IOOrpm培养20d，获得发酵液。将发酵液离心后取上清，45°C旋转蒸发，浓缩至原体积的1/10，即获得10倍精制液，称重然后向其中加入PEG20g即PEG质量分数为0.8%。
[0058]虫体实验:
[0059]挑选感染中国被毛孢菌的蝙蝠蛾幼虫60条，其中30条使用中国被毛孢20倍发酵精制液向幼虫体表进行喷雾，使用量为每100条虫子喷雾75mL。另外30条作为对照，使用无菌水处理。每隔15d处理一次，处理4个月后处理组中30条幼虫仍然健康存活，经取样镜检发现幼虫体内的中国被毛孢菌体数量仍然很多，并未受到药剂的影响。而且幼虫仍然能够僵化并且长出子实体原基。而对照组中30条幼虫9条感染拟青霉，21条存活。
[0060]对于侵染后的幼虫，持续用药，虫体内的中国被毛孢仍能够存活,直至虫体变僵。而且僵虫能够形成子实体原基。
[0061]实施例4[0062]制备发酵液:
[0063]中国被毛孢菌种接种于发酵培养基中，培养基成分为葡萄糖800g,蛋白胨200g,酵母粉200g，无水硫酸镁10g，磷酸二氢钾22.5g，水20L，于16°C IOOrpm培养18d，获得发酵液。将发酵液离心后取上清，42°C旋转蒸发，浓缩至原体积的1/30，即获得30倍精制液。称重然后向其中加入乳化剂0P-108.0g,即0P-10质量分数为1.2%。
[0064]虫体实验:
[0065]挑选感染中国被毛孢菌的蝙蝠蛾幼虫60条，其中30条使用中国被毛孢20倍发酵精制液向幼虫体表进行喷雾，使用量为每100条虫子喷雾60mL。另外30条作为对照，使用无菌水处理。每隔15d处理一次，处理4个月后处理组中30条幼虫仍然健康存活，经取样镜检发现幼虫体内的中国被毛孢菌体数量仍然很多，并未受到药剂的影响。而且幼虫仍然能够僵化并且长出子实体原基。而对照组中30条幼虫13条感染拟青霉，17条存活。
[0066]实施例5
[0067]制备发酵液:
[0068]中国被毛孢菌种接种于发酵培养基中，培养基成分为葡萄糖800g,蛋白胨300g,酵母粉300g，无水硫酸镁15g，磷酸二氢钾30g，水30L，于20°C IOOrpm培养20d，获得发酵液。将发酵液离心后取上清，50°C旋转蒸发，浓缩至原体积的1/30，即获得30倍精制液，称重然后向其中加入吐温801g即吐温80质量分数为0.1%。
[0069]虫体实验:
[0070]挑选感染中国被毛孢菌的蝙蝠蛾幼虫60条，其中30条使用中国被毛孢30倍发酵精制液向幼虫体表进行喷雾，使用量为每100条虫子喷雾80mL。另外30条作为对照，使用无菌水处理。每隔15d处理一次，处理4个月后处理组中30条幼虫仍然健康存活，经取样镜检发现幼虫体内的中国被毛孢菌体数量仍然很多，并未受到药剂的影响。而且幼虫仍然能够僵化并且长出子实体原基。而对照组中30条幼虫11条感染拟青霉，19条存活。
[0071]对于侵染后的幼虫，持续用药，虫体内的中国被毛孢仍能够存活，直至虫体变僵。而且僵虫能够形成子实体原基。
[0072]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.中国被毛孢发酵液精制液作为蝙蝠蛾幼虫体内感染拟青霉菌的抑菌剂的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述中国被毛孢发酵液精制液的制备方法包括以下步骤: 步骤1:取中国被毛孢菌种接种于培养基中发酵，获得中国被毛孢发酵液； 步骤2:取所述中国被毛孢发酵液经离心或过滤，收集滤液； 步骤3:取所述滤液浓缩10-30倍，即得； 所述培养基包含葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、无水硫酸镁、磷酸二氢钾和水，所述葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、无水硫酸镁、磷酸二氢钾和水的质量比为20~32: 6~12: 6~12: 0.4 ~0.6: 0.8 ~1.2: 800 ~1200。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤I中所述发酵温度为15-20°C。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤I中所述发酵时间为14-25d。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤3中所述浓缩的温度为40-50°C。
6.一种蝙蝠蛾幼虫感染拟青霉菌的抑菌剂，其特征在于，其包含有中国被毛孢发酵液精制液。
7.根据权利要求6所述的抑菌剂，其特征在于，所述中国被毛孢发酵液精制液的制备方法包括以下步骤: 步骤1:取中国被毛孢菌种接种于培养基中发酵，获得中国被毛孢发酵液；` 步骤2:取所述中国被毛孢发酵液经离心或过滤，收集滤液； 步骤3:取所述滤液浓缩10-30倍，即得； 所述培养基包含葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、无水硫酸镁、磷酸二氢钾和水，所述葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、无水硫酸镁、磷酸二氢钾和水的质量比为20~32: 6~12: 6~12: 0.4 ~0.6: 0.8 ~1.2: 800 ~1200。
8.根据权利要求7所述的抑菌剂，其特征在于，步骤I中所述发酵温度为15-20°C。
9.根据权利要求7所述的抑菌剂，其特征在于，步骤I中所述发酵时间为14-25d。
10.根据权利要求7所述的抑菌剂，其特征在于，步骤3中所述浓缩的温度为40-50°C。
11.根据权利要求6所述的抑菌剂，其特征在于，其还包含乳化剂。
12.根据权利要求6所述的抑菌剂，其特征在于，所述抑菌剂中所述乳化剂的质量分数为 0.1 ~1.2%ο
13.根据权利要求6所述的抑菌剂，其特征在于，所述乳化剂为吐温80、聚乙二醇、乳化剂OP-1O中的一种或两者以上的混合物。
14.根据权利要求6所述的抑菌剂，其特征在于，其使用方式为向蝙蝠蛾虫体直接喷洒或添加在蝙蝠蛾幼虫的饲养基质中。
【文档编号】A61K36/068GK103877127SQ201310697573
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月18日 优先权日:2012年12月19日
【发明者】梁蕾, 李光荣, 梁关海, 朱志钢, 李文佳, 谢俊杰 申请人:宜昌山城水都冬虫夏草有限公司, 乳源南岭好山好水冬虫夏草有限公司