一种判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒及其使用方法
【专利摘要】本发明涉及一种判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于由三个独立包装或组合包装的试剂盒组成：RNA提取试剂盒、RT-PCR反应试剂盒和实时定量PCR反应试剂盒，依次使用三个试剂盒能检测出胃癌组织中miR-129的表达水平，miR-129低表达说明预后好。
【专利说明】一种判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒及其使用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒及其使用方法。
【背景技术】
[0002]研究表明一些microRNA (miRNA)在胃癌组织中表达水平异常，如let_7g、miR-433、miR-21、miR-106、miR-143 等在胃癌组织中低表达，miR-214、miR-203、miR-574_3p 等高表达。现由报道中miR-129在胃癌组织中的表达相比正常组织是低水平表达的，如Growth inhibitory effects of three miR-129family members on gastric cancer(Gene.2013Decl0: 532 (I):87-93)指出与正常细胞相比，miR-129在胃癌细胞中的表达下调，miR-129对胃癌细胞增殖有抑制作用；Gastric juice miR_129as a potentialbiomarker for screening gastric cancer (Med Oncol.2013Mar;30 (I):365) 指出与胃良性疾病患者相比，胃癌患者胃液中mir-129-l-3p和mir-129-2_3p表达水平显着降低° Epigenetic regulation of miR_34b and miR_129expression in gastriccancer.(Int T Cancer.2011Decl:129(11):2600-10.)、Epigenetic repression ofmicroRNA-129-2leads to overexpression of S0X4in gastric cancerCBiochem BiophysRes Commun.201OApr16; 394 (4): 1047-52)也都表明miR-129在胃癌组织中的表达是下调的。
[0003]综上所述，miR-129在胃癌组织中的表达是下调的，当治疗后miR-129上调时,表
明患者预后良好。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是重新探讨microRNA-129(miRNA-129，miR-129)在胃癌组织中的表达及临床意义，并评估其在两种含钼化疗方案治疗晚期胃癌的预后判断中的价值。
[0005]发明人收集52例福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的胃癌患者肿瘤组织样本及正常对照组织，提取总RNA，应用实时定量PCR(RT-PCR)方法检测候选miR-129的表达水平，并结合临床病理资料分析其在晚期胃癌预后判断中的意义。
[0006]试验结果显示miR-129在胃癌组织中表达水平显著高于正常胃组织(Ρ〈0.001)；miR-129的表达水平与既往治疗史比较差异有统计学意义(P=0.014);与年龄、性别、肿瘤TNM分期、肿瘤大小、组织分化类型的差异均无统计学意义。二疗程后疗效与晚期胃癌患者总生存时间明显相关，疗效为PR、SD、PD的患者中位生存时间分别为8.41 (5.29-11.52)、10.16(7.19-13.14)和5.10(3.11-7.08)个月。miR-129高表达水平患者与低表达水平患者中位生存时间分别为6.27(5.17-7.37),8.74(6.71-10.77)个月，差异有统计学意义(P=0.026)。Cox模型分析显示miR-129高表达胃癌患者死亡风险HR为miR-129低表达胃癌患者的2.77倍(95%CI:1.12-6.87，Ρ=0.028) ;SD、PD患者的死亡风险HR分别为PR患者的 0.95 (95%CI:0.351-2.562，P=0.85)和 6.02 倍(95%C1:1.683-21.57，P=0.009)。[0007]根据上述试验结果，发明人设计了一种判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒，其由三个独立包装或组合包装的试剂盒组成:RNA提取试剂盒、RT-PCR反应试剂盒和实时定量PCR反应试剂盒，依次使用三个试剂盒能检测出胃癌组织中miR-129的含量，miR-129含量相比治疗前下调，说明预后好。
[0008]RNA提取试剂盒含有2ml的消毒离心管，1.5ml 二甲苯，1.5ml无水乙醇蛋白酶Κ50μ 1，Trizol试剂lml、氯仿200ul、异丙醇500ul、显色剂Iul,75%乙醇Iml和无核酸酶水 10-50ul。
[0009]RT-PCR 试剂盒含有 IOmM dNTPs0.15ul,50U/ul 逆转录酶 Iul，10 倍浓度 PH7.5 的逆转录缓冲液1.5ul,20U/ul RNA酶抑制剂0.19ul,购自Applied Biosystem的5倍浓度miR-129特异性逆转录引物3ul和无核酸酶水6.66ul。
[0010]实时定量PCR反应试剂盒含有TaqMan2倍浓度通用PCR总混合物10ul、无核酸酶水7.67ul和购自Applied Biosystem的20倍浓度miR-129特异性PCR引物lul。
[0011]试剂盒的使用方法:
[0012]a、使用RNA提取试剂盒
[0013]I)将10张5 μ m厚连续切片(切片机和刀片均经75%乙醇溶液消毒2次)的蜡膜放于2ml的消毒离心管里，加入1.5ml 二甲苯，盖紧并充分混匀去除石蜡，55°C孵育lOmin，室温下12000r/min离心2min,弃去上清液,重复I次；
[0014]2)加入1.5ml无水乙醇，充分混匀以去除二甲苯，室温放置lOmin，室温下12000r/min离心2min,弃去上清液,重复2次；
[0015]3)打开离心管盖子，室温或37°C晾干，约lOmin，直到乙醇完全挥发；
[0016]4)加细胞裂解液250μ 1，混匀，加蛋白酶Κ50μ 1，56°C消化lh，直到样品完全裂解；
[0017]5)90°C孵育 15min，4°C 8000r/min 离心，弃去沉淀；
[0018]6)加入lml TRIzol溶液，用1000 μ I移液器反复抽吸匀浆，室温放置5min，使样品充分裂解；
[0019]7)每Iml的TRIzoI溶液中加入200 μ I的氯仿，充分振荡混匀后室温放置3_5min使其自然分相；
[0020]8)4°C 12000r/min离心10-15min。混合溶液会分成三层:下层为黄色的有机相，中间层和上层无色的水相。RNA主要在水相中，把上层的水相(通常可吸取550 μ I左右)转移到新离心管中；注意不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA污染；
[0021]9)加入等体积冰冷的异丙醇和Iul显色剂，充分混匀以沉淀其中的RNA，室温放置10_20min。4°C 12, OOOrpm离心lOmin,弃上清，RNA沉淀于管底,可见蓝色沉淀；
[0022]10) 40C 12000r/min离心lOmin，弃去上清液，RNA沉淀于管底和管壁；
[0023]11) RNA沉淀中加入lml75%乙醇溶液，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
[0024]12)4°C 8000r/min离心l_2min,用移液器小心吸取并弃去上清液,注意不要吸弃沉淀；室温放置1-2分钟晾干沉淀。注意RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解；
[0025]13)沉淀中加入10-50 μ I DEPC水，轻弹管壁，以充分溶解RNA，放置于_80°C冰箱保存；
[0026]b、使用RT-PCR试剂盒:[0027]I)、将IOmM dNTPs0.15ul，逆转录酶Iul，10倍浓度PH7.5的逆转录缓冲液1.5ul，20U/ul RNA酶抑制剂0.19ul，购自Applied Biosystem的5倍浓度miR-129特异性逆转录引物3ul、无核酸酶水6.66ul、2.5ul RNA试剂盒提取的样品混匀瞬离，分装，加入对应的模板混匀,再加入无核酸酶水至总体系为15ul ；
[0028]2)、将步骤I的材料在普通PCR仪上进行逆转录，16 V保持30min，42 V保持30min,85°C保持 5min,4°C保存；
[0029]C、使用实时定量PCR试剂盒:
[0030]1)将IOul TaqMan2倍浓度通用PCR总混合物、7.67ul无核酸酶水、Iul购自Applied Biosystem的20倍浓度miR-129特异性PCR引物、RT-PCR试剂盒获得的miRNA逆转录产物1.33ul混匀；
[0031]2)在普通 PCR 仪上反应，a) 95°C保持 lOmin，b) 95°C持 15s，c) 60°C保持 60s，d)重复步骤b)、c)45次，g)4°C保存。
[0032]本发明的有益效果是，证实了胃癌组织中存在miR-129的表达上调，miR-129作为一种调控分子，其表达水平与晚期胃癌患者预后显著相关，可作为胃癌预后的独立影响因素，也可作为化疗法案的潜在性评价指标。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0034]图1胃癌组织及正常胃组织中miR-129的表达水平
[0035]图2miR_129在胃癌组织中表达水平及患者生存期的关系
【具体实施方式】
[0036]研究方法
[0037]1.一般资料:经苏州大学伦理委员会的批准，受试对象知情同意，收集2007年6月至2010年8月52例参加苏州大学第三附属医院S-1胶囊治疗晚期胃癌多中心随机平行对照II期临床试验的胃癌患者胃镜或手术切除标本，其中男36例，女16例。该II期临床实验目的为评估与比较S-1胶囊联合奥沙利钼和去氧氟尿苷胶囊联合奥沙利钼一线治疗治疗转移性胃癌患者的客观缓解率和安全性。随访终止时间为2013年8月31日。
[0038]2.患者的入选标准:经病理学证实的不能手术的或手术后复发转移的胃癌患者；有可测量肿瘤病灶；KPS评分> 70，预计生存期> 3个月；年龄18~75岁；如果接受过大的外科手术，则间隔时间至少为3周；以往从未接受过化疗者，或以往接受过新辅助化疗或辅助化疗后复发转移的患者，距末次化疗6个月以上者；曾使用含奥沙利钼方案辅助化疗后复发转移患者，应距末次化疗12个月以上者，且均未口服氟脲嘧啶类化疗药物。
[0039]3.患者的剔除标准:试验期间同时合并使用其它化疗药物和抗癌中药、免疫治疗等者；试验期间，疗效观察部位同时放疗者或其它局部治疗者；未按研究方案所定的剂量和疗程给药者；死亡或危及生命的不良事件，及无法接受的不良反应；依从性差者。
[0040]4.疗效评估标准:应用规定给药方案后对患者进行疗效评估，治疗前2周内完成与肿瘤疗效评价有关的影像学检查，用药第2疗程的第4周进行肿瘤目标病灶疗效评估，疗效评价依据WHO “实体瘤疗效评价标准”评定:完全缓解(CR);部分缓解(PR);稳定(SD)；病变进展(PD)。评价疗效如为CR、PR、SD者需要在首次评价CR、PR、SD之后4周加以复核确认。
[0041]5.主要仪器及试剂:Trizol Reagent购自美国Invitrogen公司；TaqmanMicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqMan2XUniversal PCR Master Mix、逆转录特异性引物及 RT-PCR 引物、探针、Applied Biosystems7500Real-Time PCR System 均购自美国ABI公司。
[0042]6.RNA提取及逆转录-RT-PCR检测:选用S-1/奥沙利钼和去氧氟尿苷/奥沙利钼进行治疗的晚期胃癌患者化疗前的FFPE组织样本，Trizol法抽提总RNA，测定总RNA浓度。逆转录及RT-PCR均按照试剂盒说明书操作。正常对照样本取自11例胃癌手术中收集的远端非肿瘤胃组织及胃炎组织。
[0043](步骤5中涉及的试剂盒组成及使用方法见
【发明内容】
部分)[0044]7.miRNA表达量计算方法:候选miRNAs根据内参基因RNU44校正各候选miRNAs的表达里，以公式2( )表不，其中Δ Ct=Ct目的基因_ Δ Ct对照基因，ΔΔ Ct= Δ Ct目的基因_ Δ Ct
参照样本。
[0045]8.统计学方法:所有数据使用SPSS13.0与GraphPad Prism5.0软件进行统计分析。不同临床病理特征对应miR-129表达水平的差异采用秩和检验，生存资料分析采用Kaplan-Meier 法及 Log rank 检验，并拟 Cox 比例风险模型，用 HR (Hazard Risk)及 95%CI估计不同临床病理特征与生存期的联系强度，检验水准为α =0.05。
[0046]研究结果
[0047]1.miR-129在胃癌组织及胃正常组织中表达的差异性比较:结果显示miRNAs在52例胃癌FFPE组织中miR-129存在差异表达。与正常胃组织相比较miR-129在胃癌组织中高表达，差异有统计学意义(P〈0.001，图1)。提示miR-129在胃癌组织中表达可能影响胃癌患者的耐药性和/或细胞周期和/或细胞凋亡。
[0048]2.miR-129与胃癌患者临床病理特征的相关性:对52例胃癌FFPE组织标本中miR-129表达水平与患者临床/病理参数进行统计分析，结果显示:miR-129的表达水平与既往治疗史比较差异有统计学意义(P=0.014，表1);与不同年龄、性别、肿瘤?!分期、肿瘤大小、组织分化类型比较差异均无统计学意义。
[0049]表lmiR-129在不同胃癌患者临床/病理特征组中的表达水平
[0050]
【权利要求】
1.一种判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于由三个独立包装或组合包装的试剂盒组成=RNA提取试剂盒、RT-PCR反应试剂盒和实时定量PCR反应试剂盒，依次使用三个试剂盒能检测出胃癌组织中miR-129的表达水平，miR-129表达水平低说明预后好。
2.权利要求1所述的判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RNA提取试剂盒含有2ml的消毒离心管，1.5ml 二甲苯，1.5ml无水乙醇蛋白酶K50 μ I,Trizol试剂1ml、氯仿200ul、异丙醇500ul、显色剂lul、75%乙醇Iml和无核酸酶水10_50ul。
3.权利要求1所述的判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于RT-PCR试剂盒含有IOmM dNTPs0.15ul，50U/ul逆转录酶Iul，10倍浓度PH7.5的逆转录缓冲液1.5ul，20U/ul RNA酶抑制剂0.19ul,购自Applied Biosystem的5倍浓度miR-129特异性逆转录引物3ul和无核酸酶水6.66ul。
4.权利要求1所述的判断晚期胃癌治疗疗效的试剂盒，其特征在于实时定量PCR反应试剂盒含有TaqMan2倍浓度通用PCR总混合物10ul、无核酸酶水7.67ul和购自AppliedBiosystem的20倍浓度miR-129特异性PCR引物Iul。
5.权利要求1至4任一项试剂盒的使用方法: a、使用RNA提取试剂盒 1)将10张5μ m厚连续切片(切片机和刀片均经75%乙醇溶液消毒2次)的蜡膜放于2ml的消毒离心管里，加入1.5ml 二甲苯，盖紧并充分混匀去除石蜡，55°C孵育lOmin，室温下12000r/min离心2min,弃去上清液,重复I次； 2)加入1.5m l无水乙醇，充分混匀以去除二甲苯，室温放置lOmin，室温下12000r/min离心2min，弃去上清液，重复2次； 3)打开离心管盖子，室温或37°C晾干，约lOmin，直到乙醇完全挥发； 4)加细胞裂解液250μ1，混匀，加蛋白酶Κ50μ 1，56°C消化lh，直到样品完全裂解； 5)90°C孵育15min,4°C 8000r/min 离心，弃去沉淀； 6)加入ImlTRIzol溶液，用1000 μ I移液器反复抽吸匀浆，室温放置5min，使样品充分裂解； 7)每Iml的TRIzol溶液中加入200μ I的氯仿，充分振荡混匀后室温放置3_5min使其自然分相； 8)40C 12000r/min离心10_15min。混合溶液会分成三层:下层为黄色的有机相，中间层和上层无色的水相。RNA主要在水相中，把上层的水相(通常可吸取550 μ I左右)转移到新离心管中；注意不要吸取中间界面，否则将导致RNA样品中有DNA污染； 9)加入等体积冰冷的异丙醇和Iul显色剂，充分混匀以沉淀其中的RNA，室温放置10_20min。4°C 12, OOOrpm离心lOmin,弃上清，RNA沉淀于管底,可见蓝色沉淀； 10)4°C12000r/min离心lOmin，弃去上清液，RNA沉淀于管底和管壁； 11)RNA沉淀中加入lml75%乙醇溶液，温和振荡离心管，悬浮沉淀； 12)4°C8000r/min离心l_2min,用移液器小心吸取并弃去上清液,注意不要吸弃沉淀；室温放置1-2分钟晾干沉淀。注意RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解； 13)沉淀中加入10-50μ I DEPC /K，轻弹管壁，以充分溶解RNA，放置于_80°C冰箱保存； b、使用RT-PCR试剂盒:. 1)、将IOmMdNTPs0.15ul，逆转录酶Iul，10倍浓度PH7.5的逆转录缓冲液1.5ul，20U/ul RNA酶抑制剂0.19ul,购自Applied Biosystem的5倍浓度miR-129特异性逆转录引物.3ul、无核酸酶水6.66ul、2.5ul RNA试剂盒提取的样品混匀瞬离，分装，加入对应的模板混匀，再加入无核酸酶水至总体系为15ul ；. 2)、将步骤I的材料在普通PCR仪上进行逆转录，16°C保持30min，42°C保持30min，.85°〇保持511^11，41:保存； C、使用实时定量PCR试剂盒: . 1)将IOulTaqMan2倍浓度通用PCR总混合物、7.67ul无核酸酶水、Iul购自AppliedBiosystem的20倍浓度miR-129特异性PCR引物、RT-PCR试剂盒获得的miRNA逆转录产物.1.33ul 混匀； . 2)在普通PCR仪上反应，a)95°C保持lOmin，b) 95°C保持15s，c) 60°C保持60s，d)重复步骤b)、c)45次，g)4°C保存。
【文档编号】C12Q1/68GK103614468SQ201310581683
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月18日 优先权日:2013年11月18日
【发明者】蒋敬庭, 吴昌平, 鞠景芳, 郑晓, 刘娟 申请人:常州市第一人民医院