一种用于抑制vhl基因表达的抑制剂及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于抑制VHL基因表达的抑制剂，所述抑制剂为包含有miR-331-3p基因片段的表达载体，所述表达载体由pTARGET质粒改造获得，具体的，是在pTARGET质粒的多克隆位点区域中插入一段包含miR-331-3p基因片段的插入序列。本发明还进一步公开了所述抑制剂的制备方法以及在抑制VHL基因表达中的应用。
【专利说明】-种用于抑制VHL基因表达的抑制剂及其制备
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种用于抑制VHL基因表达的抑制剂及其制 备。
【背景技术】
[0002] MiRNA的表达及调节异常常见于大量人类肿瘤中，包括肝细胞性肝癌（HCC)。在 HCC细胞系中，miRNA芯片分析数据表明miR-331-3p可能是其中的一个异常表达的miRNA。
[0003] MicroRNA是有21-22个核苷酸组成的单链非编码小RNA，广泛存在于真核生物 细胞中，通过与革EmRNA3' -非编码区域（3, -untranslated regions3' -UTR)的互补配对 在转录后水平对基因表达进行调控，导致mRNA的降解或翻译抑制（Bartel, 2004 ;Calin & Croce2006)。MiRNA与靶mRNA分子组成了一个复杂的调控网络，参与包括细胞增殖、细 胞凋亡、细胞分化、发育和逆境应答等多种复杂的调控网络（Gaal & 01ah，2012;Lin et al.，2013)。大量实验结果表明miRNA在人类癌症中普遍失调。MiRNA能够抑制涉及癌症 发生发展的下游靶基因表达，从而作为致癌或者抑癌因子发挥作用（Zhang et al.，2007)。 MiRNA表达失调可能是人类肿瘤发生的一个常见原因（Croce，2009)。
[0004] HCC是一种常见的癌症，主要致病因素是慢性HBV感染。有文献报道病毒感染能 够干扰细胞内miRNA的表达（Lin&Flemington et al.，2011)。大量的研究表明，HBV能够 通过涉及的miRNAs方式在HCC中发挥促癌作用（Xu et al.，2013;Wang et al.，2011 ;Zou et al. , 2014) 〇
[0005] 在之前的研究中报道过用基因芯片的方法研究miRNAs在H印G2和H印G2. 2. 15 细胞中的差异性表达（Zhang et al.，2011)，从中，我们发现相对于对照细胞Η印G2， miR-331-3p在Η印G2. 2. 15细胞中呈上升的趋势。同样有文献报道过miR-331-3p在其他 肿瘤中，例如：前列腺癌、胃癌、恶性胶质细胞瘤中发挥着重要的作用（Epis et al.，2014; Epis et al.，2012;Epis et al.，2011;Guo et al.，2010)，但是miR-331-3p 是否参与 HCC 发生发展以及miR-331-3p的作用有哪些还需要进一步的研究。
[0006] VHL (von Hippel-Lindau tumor suppressor)综合征是一种显性遗传的家族继承 性癌症综合征，能够诱发各种良性和恶性肿瘤。VHL基因的失活突变是造成VHL综合征家族 性遗传的基础（Maher & Kaelin，1997)。VHL基因编码的蛋白质是包括转录延生因子B、转 录延生因子C和cullin-2在内的蛋白复合物，并且具有泛素连接酶E3活性。此蛋白涉及缺 氧诱导因子（hypoxia-inducible factor HIF)的泛素化和降解（Cockman&Masson, 2000)。 VHL基因突变与许多肿瘤，例如嗜铬细胞瘤、肾透明细胞癌、中枢神经系统和视网膜的血 管瘤等的形成相关，表明VHL基因可能在这些癌症中起到一个肿瘤抑制作用（Latif et al. , 1993 ；Kim & Kaelin, 2004)〇
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种用于抑制VHL基因表达的抑制 剂及其制备。
[0008] 本发明的第一方面，首先公开了一种用于抑制VHL基因表达的抑制剂，为包含有 miR-331-3p基因片段的表达载体，所述表达载体能够正确地表达miR-331-3p基因。
[0009] 较佳的，所述表达载体由pTARGET质粒改造获得，具体的，是在pTARGET质粒的多 克隆位点区域中插入一段包含miR-331-3p基因片段的插入序列。
[0010] 较佳的，所述插入序列的插入位点为xho I酶切位点和Sal I酶切位点之间。
[0011] 较佳的，所述包含miR-331-3p基因片段的插入序列如SEQIDN0. 1所示。
[0012] 1 AACTTCATTT CTAAATCAAA GTATTTTCTG CACTTTTATT GCACCAATCT GTTACCTTCT
[0013] 61 GTTCATACCA TGACTTMAT MTGCTTACT CAGGCACAGT ACTATCAGCT GACAACGTAC
[0014] 121 AGAAGGCTCC AGAAATGTCA CTCCCATCCC TTAAAGGTTG GTATATGGTC CTGGTACAGT
[0015] 181 CGTGGAGGTC CATATGGGTG MAAGCCCAG AAGTCTACCT GAGCTGAAAG CACTCCCAAG
[0016] 241 GAGTTTGGTT TTGTTTGGGT TTGTTCTAGG TATGGTCCCA GGGATCCCAG ATCMACCAG
[0017] 301 GCCCCTGGGC CTATCCTAGA ACCAACCTAA GCTCGCGCAT CATTCCTGGA ACATCAAGAG
[0018] 361 TGTGAAGACT GAAGATMCC TGAGGCCTAC CAGACATCCT ATATTCACCA AGATTCACAT
[0019] 421 TTTTTGGTAT GTGTGCCTAC ATTTTAGCAA AAATTGGTTG GTTAATCCTT CTAMATTAG
[0020] 481 AGGGATGACA TTGGGTMCA MGTCTTCCC AGCCTTTGGC ATTATAGTAA TTTCTCGCM
[0021] 541 TAGAAATTCC ATACAGATAT TATTGCCAGT GAAGAGAGCT ATTCTTGTTT ATTATCAGTT
[0022] 601 CTATATTTTT AGCTGAAGCA ACTTAGCCCT AAAA
[0023] 较佳的，所述抑制剂的序列如SEQ N0. 4所示。
[0024] 本发明第二方面，还进一步公开了前述抑制剂的制备方法：通过PCR的方法在所 述包含miR-331-3p基因片段的插入序列两端添加酶切位点序列，采用酶切、连接的方法 将所述miR-331-3p基因片段插入pTARGET质粒载体，筛选、鉴定连接正确的连接产物为本 发明的抑制剂。
[0025] 较佳的，所述抑制剂适用于SMMC7721细胞等哺乳动物肝癌细胞系。
[0026] 本发明第三方面，提供了前述抑制剂用于抑制VHL基因表达的应用。
[0027] 本发明的抑制剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组 合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋 形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或 有机的载体包括（但不限于）乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化 合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。 保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根 据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产 生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式， 或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的抑制剂可以单独给药，或以各种组合 给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域 技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量 的本发明的抑制剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然， 具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0028] 本发明的第四方面，公开了一种抑制VHL基因表达的方法，所述方法为将有效作 用量的本发明的所述抑制剂施用于作用对象。
[0029] 所述方法为非疾病的诊断和治疗方法。
[0030] 本发明的有益效果为：
[0031] 本发明首次构建了能够抑制VHL基因表达的特殊设计的抑制剂，且通过大量的实 验证实，本发明的抑制剂能够显著抑制过表达miR-331-3p的SMMC7721细胞中VHL基因在 mRNA水平和蛋白水平的表达。为进一步研究VHL基因的功能提供了新的手段，加快了人们 对VHL基因功能和机制的研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0032] 图 1. pTARGET-miR-331-3p 抑制 VHL 的表达
[0033] (a)miR-331-3p 在转染 pTARGET 或者 pTARGET-miR-331-3p 的 SMMC7721 细胞中的 相对表达量，以U6为内参。
[0034] (b, c)转染 pTARGET 或 pTARGET-miR-331-3p 的 SMMC7721 细胞中 VHL 的 mRNA 或蛋 白表达水平。
[0035] 图2. pTARGET-miR-331-3p通过直接作用于3' -UTR抑制VHL表达
[0036] (a)pTARGET-miR-331-3p与VHL野生型或突变型3' -UTR结合位点原理图；
[0037] (b)在共转染各组不同质粒的SMMC7721细胞中检测其荧光素酶活 性· *Ρ〈0· 05, **Ρ〈0· 01.
【具体实施方式】
[0038] 下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非 限制本发明的范围。
[0039] 实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如
[美]Sambrook. J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002 中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。除非另外说明，否则百分比和份数按重 量计算。
[0040] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所 述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0041] 实施例lpTARGET-miR-331-3p质粒的构建及表达验证
[0042] 首先，我们构建了 miR-331-3p的表达质粒，命名为pTARGET-miR-331-3p，并验证 其过表达效率。
[0043] 1.试剂
[0044] 限制性内切酶Xho I、Sal I购自TaKaRa公司，T4DNA连接酶购自Promega公司。
[0045] 2.细胞株和载体
[0046] Η印G2 和！fepG2. 2. 15 细胞于含 10 % 胎牛血清（FBS) (Gibco, USA)、lOOunits/ ml 青霉素和 100 μ g/ 链霉素（Hyclone, china)和 1· 2 % 丙酮酸钠（Hyclone, china)的 MEM(Hyclone, china)培养基中培养。SMMC7721 细胞于含 10%胎牛血清（FBS) (Gibco, USA)、 100units/ml 青霉素和 100yg/链霉素（Hyclone,china)的 RPMI1640(Hyclone,china) 培养基中培养。Η印G2、Η印G2. 2. 15和SMMC7721均于含5% C02的37°C恒温孵箱中培养。 Η印G2和！fepG2. 2. 15以60%的密度接种于六孔板，SMMC7721为45%，根据使用说明书，使 用 LipofectamineTM2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA)将目的质粒转染进细胞中。
[0047] 3.实验方法
[0048] 3. lpTARGET-miR-331-3p 质粒的构建
[0049] 采用酶切连接的方法构建pTARGET-miR-331-3p质粒，在pTARGET的多克隆位点区 域的Xho I酶切位点和Sal I酶切位点之间插入如SEQIDN0. 1所示的包含miR-331-3p的 基因片段的插入序列。具体的，
[0050] (1)采用下表1中的引物，以Η印G2. 2. 15细胞基因组为模板，PCR扩增出694bp的 含miR-331-3p的基因片段。
[0051 ] 表1实验所用到的引物
[0052]
【权利要求】
1. 一种用于抑制VHL基因表达的抑制剂，所述抑制剂为包含有miR-331-3p基因片段的 表达载体。
2. 根据权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，所述表达载体由pTARGET质粒改造获 得，即在pTARGET质粒的多克隆位点区域中插入一段包含miR-331-3p基因片段的插入序 列。
3. 根据权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，所述插入序列的插入位点为Xho I酶切 位点和Sal I酶切位点之间。
4. 根据权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，所述包含miR-331-3p基因片段的插入 序列如SEQIDN0. 1所示。
5. 根据权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的序列如SEQIDN0. 4所示。
6. 根据权利要求1所述的抑制剂的制备方法，其特征在于，通过PCR的方法在所述包 含miR-331-3p基因片段的插入序列两端添加酶切位点序列，采用酶切、连接的方法将所述 miR-331-3p基因片段插入pTARGET质粒载体，筛选、鉴定连接正确的连接产物为本发明的 抑制剂。
7. 根据权利要求1-6任一权利要求所述的抑制剂的用途，是用于抑制VHL基因的表达。
8. -种抑制VHL基因表达的方法，所述方法为将有效作用量的所述抑制剂施用于作用 对象。
【文档编号】A61K48/00GK104120146SQ201410311675
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2014年7月2日 优先权日:2014年7月2日
【发明者】汤华, 曹漪伊 申请人:重庆贝羿生物科技有限公司