水溶性富勒烯纳米颗粒在制备抑制肿瘤生长药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种水溶性富勒烯纳米颗粒在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。

背景技术

癌症，即恶性肿瘤作为21世纪影响人类生命健康的重大疾病已经得到人们普遍关注。国际癌症研究机构在2013年出版的《世界癌症报告》中指出，根据目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。在目前肿瘤治疗的过程中，化疗是最常用的手段之一，但是化疗药物缺乏靶向性，在杀死肿瘤细胞的同时也会引起正常细胞的死亡，因此常常会引起严重的副作用。随着抗肿瘤研究的不断发展，也出现了一批抗癌新疗法，例如靶向治疗、免疫疗法、热疗、光动力疗法等。

富勒烯，由不同数目碳原子组成的笼状碳原子簇，因为其独特的分子结构决定了它独特的物理化学性质。近年来，随着富勒烯水溶化方法的不断拓展，水溶性富勒烯纳米颗粒的种类也不断被丰富和壮大，并在生物领域中发挥着重要的作用。如shinohara(shinoharahetal.japanesepatent,1996,no143478)和cagle(cagled.wetal.j.fullerenes1997(4):361-388.)等人首先提出内嵌金属富勒稀可以用于mri诊断中对比试剂，内嵌金属富勒烯还可以用作放射性示踪剂和放射性药物(duboisdetal.j.am.chem.soc,1991(113):7773)。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种水溶性富勒烯纳米颗粒在制备不依赖射线地抑制肿瘤生长的药物中的应用。本发明的另一目的是提供一种使用上述水溶性富勒烯纳米颗粒的、不依赖射线地抑制肿瘤生长的药物组合物及方法。

为了实现目的，本发明提供了以下技术方案：

一种水溶性富勒烯纳米颗粒在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用，所述水溶性富勒烯纳米颗粒包括：水溶性空心富勒烯纳米颗粒、水溶性空心富勒烯纳米颗粒的可药用的盐、水溶性空心富勒烯纳米颗粒的可药用的酯、水溶性金属富勒烯纳米颗粒、水溶性金属富勒烯纳米颗粒的可药用的盐和水溶性金属富勒烯纳米颗粒的可药用的酯中的至少一种，其中：

所述水溶性空心富勒烯纳米颗粒的通式为c2n(oh)x(aminoacid)y，aminoacid代表水溶性氨基酸；30≤n≤60，可选的n为30或35；0<x<50，可选的20<x<30，还可选的x＝24；0≤y<20；

所述水溶性金属富勒烯纳米颗粒的通式为m@c2a(oh)b(aminoacid)c，aminoacid代表水溶性氨基酸；m选自稀土金属，可选的稀土金属为gd、la等；30≤a≤60，可选的a为41或30或35；0≤b<50；0<c<20。

本发明还提供了一种抑制肿瘤生长的方法，包括向需要抑制肿瘤生长的受试者施用有效量的水溶性富勒烯纳米颗粒，所述水溶性富勒烯纳米颗粒包括：水溶性空心富勒烯纳米颗粒、水溶性空心富勒烯纳米颗粒的可药用的盐、水溶性空心富勒烯纳米颗粒的可药用的酯、水溶性金属富勒烯纳米颗粒、水溶性金属富勒烯纳米颗粒的可药用的盐和水溶性金属富勒烯纳米颗粒的可药用的酯中的至少一种，其中：

所述水溶性空心富勒烯纳米颗粒的通式为c2n(oh)x(aminoacid)y，aminoacid代表水溶性氨基酸；30≤n≤60，可选的n为30或35；0<x<50，可选的20<x<30，还可选的x＝24；0≤y<20；

所述水溶性金属富勒烯纳米颗粒的通式为m@c2a(oh)b(aminoacid)c，aminoacid代表水溶性氨基酸；m选自稀土金属，可选的稀土金属为gd、la等；30≤a≤60，可选的a为41或30或35；0≤b<50；0<c<20。

本发明还提供了一种抑制肿瘤生长的药物组合物，包括水溶性富勒烯纳米颗粒，还包括可药用的载体、可药用的稀释剂和可药用的赋形剂中的至少一种，所述水溶性富勒烯纳米颗粒包括：水溶性空心富勒烯纳米颗粒、水溶性空心富勒烯纳米颗粒的可药用的盐、水溶性空心富勒烯纳米颗粒的可药用的酯、水溶性金属富勒烯纳米颗粒、水溶性金属富勒烯纳米颗粒的可药用的盐和水溶性金属富勒烯纳米颗粒的可药用的酯中的至少一种，其中：

所述水溶性空心富勒烯纳米颗粒的通式为c2n(oh)x(aminoacid)y，aminoacid代表水溶性氨基酸；30≤n≤60，可选的n为30或35；0<x<50，可选的20<x<30，还可选的x＝24；0≤y<20；

所述水溶性金属富勒烯纳米颗粒的通式为m@c2a(oh)b(aminoacid)c，aminoacid代表水溶性氨基酸；m选自稀土金属，可选的稀土金属为gd、la等；30≤a≤60，可选的a为41或30或35；0≤b<50；0<c<20。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，通式c2n(oh)x(aminoacid)y中，当y＝0即没有氨基酸时，为富勒醇；当y≠0即制备方法中有氨基酸参与反应时，由于不同氨基酸在反应中对碳笼的亲和性不同，使用不同氨基酸作为原料时，碳笼表面修饰的氨基酸和羟基数目也可能不同，但本领域技术人员根据本申请公开的内容和现有技术，可以获得经过不同氨基酸和羟基修饰的碳笼并检测到碳笼表面修饰的氨基酸和羟基的数目。通式c2n(oh)x(aminoacid)y中和通式m@c2a(oh)b(aminoacid)c中x，y，b，c均不一定是整数，x，y，b，c都是通过检测计算得出的统计平均值，可以是非整数。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述抑制肿瘤生长为不依赖射线地抑制肿瘤生长。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述抑制肿瘤生长包括：抑制肿瘤体积增大、抑制肿瘤质量增大、减慢肿瘤体积增大的速度、减慢肿瘤质量增大的速度。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸和天门氨酸中的至少一种。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性富勒烯纳米颗粒的平均水合粒径在1-1000nm。水溶性富勒烯纳米颗粒的尺寸可通过以下方式来控制：在溶剂环境中通过改变溶剂种类、调节溶剂浓度等方法来控制分子间相互作用形成的团聚的纳米颗粒物的尺寸。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性空心富勒烯纳米颗粒的制备方法包括以下的一种：(1)当含氨基酸基团的个数不为0(即y≠0)时，可参照文献carbon,2006(44):496–500(shu,cetal.synthesisandcharacterizationofanewwater-solubleendohedralmetallofullereneformricontrastagents)合成；(2)当含氨基酸基团的个数为0(即y＝0，富勒醇)时，可通过相转移催化剂参与的液液反应(xinggetal,j.phys.chem.b.,2004(108):11473-11479)或富勒烯本体粉末直接与碱溶液反应得到。可选的，水溶性空心富勒烯纳米颗粒的制备方法包括：(a)将质量百分含量为1-30％的过氧化氢水溶液和质量百分含量为10-80％的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液按照体积比为1-10:1混合，在10-200ml混合液中加入20-500mg空心的富勒烯本体固体，在温度50-80℃下搅拌4-24h，过滤，保留滤液。可选的搅拌的转速为1000r/min。(b)将所述滤液加入过量的浓度为85％-100％的乙醇，经过离心后收集沉淀，将所述沉淀溶于水，得到溶液。可选的，离心转速为10000r/min，离心时间为1-10min。(c)将(b)步骤得到的溶液进行透析处理。可选的，透析至所述溶液在室温的电导率小于1μs/cm。(d)将经过所述透析后的所述溶液冷冻干燥，以便获得羟基化空心富勒烯固体。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，富勒烯本体的通式为c2n，30≤n≤60，可选的n为30或35。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述水溶性金属富勒烯纳米颗粒的制备方法如下：(1)使用质量比为1:1-10氨基酸和naoh配置质量分数为1-30％的氨基酸碱溶液；(2)按照氨基酸与金属富勒烯本体摩尔比为1-100:1，将氨基酸碱溶液与金属富勒烯本体的固体进行混合；(3)将上述混合物40-80℃搅拌1-7小时，过滤除去未反应的少量固体粉末；(4)滤液使用透析袋透析除去小分子杂质，微孔滤膜过滤后，得到的棕黑色溶液即为本发明的氨基酸修饰的水溶性金属富勒烯纳米颗粒。可选的，透析袋的截留分子量mw＝3500，微孔滤膜的孔径200-220nm。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，金属富勒烯本体的通式为m@c2a，m选自稀土金属，可选的稀土金属为gd、la等；30≤a≤60，可选的a为41或30或35。

上述应用、方法或药物组合物在另一种实施方式中，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、胆管癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤和肉瘤中的至少一种。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液或无菌包装粉针剂的制剂。本发明中将有效成分制备成药物或药物组合物的方法可采用本领域普通技术人员公知的方法来制备，使其在施用于受试者后速释、缓释或延迟释放有效成分，例如：有效成分可以与载体混合，用载体稀释或者包封在载体中。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，适宜作为载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、树脂、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆(watersyrup)、甲基纤维素、尼泊金甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和液状石蜡。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，适宜作为载体的一些实例包括水、生理盐水、pbs缓冲液和tris-hcl溶液中的至少一种；可选的，所述生理盐水的浓度为0.85～0.90％；可选的，pbs缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/l，组成的组分具体为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl；可选的，tris-hcl溶液的浓度为0.05mol/l。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物还可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂等助剂。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，当药物或药物组合物为液体时，水溶性富勒烯纳米颗粒在其中的浓度为0.1～1000mg/ml，可选的如0.1～100mg/ml；当药物或药物组合物为固体时，水溶性富勒烯纳米颗粒在其中的浓度为0.1～1000mg/g，可选的如0.1～100mg/g。

上述方法在另一种实施方式中，所述受试者为人或动物，动物可以为哺乳动物，如小鼠、豚鼠、大鼠、狗、兔子、猪、猴子等。

上述方法在另一种实施方式中，所述水溶性富勒烯纳米颗粒施用的时间可选的为肿瘤生长初期、肿瘤血管尚未生成时、肿瘤生长中期和/或肿瘤生长晚期；所述水溶性富勒烯纳米颗粒施用的方式为静脉注射、腹腔注射、口服和局部给药中的至少一种；所述水溶性富勒烯纳米颗粒施用的剂量为1mg/kg/d～1000mg/kg/d，具体的受试者的总给药量按照其体重进行换算；所述水溶性富勒烯纳米颗粒施用的疗程根据肿瘤的生长周期而定，不同肿瘤的生长速度不同，可施用数天至数十天不等，如5-30天为1个疗程。

本发明所用的术语“有效量”指有效成分经单次或多次施用于患者而给所诊断或所治疗的患者提供预期效应的量或剂量。有效量可由所参与的诊断医师作为本领域技术人员通过已知技术以及在类似情形下所得的观察结果而确定。在确定所施用有效成分的有效量或剂量时，所参与的诊断医师应考虑多种因素，所述因素包括但不限于：哺乳动物的种属；体积、年龄及一般健康；所涉及的具体疾病；该疾病的涉入程度或严重程度；个体患者的响应；所施用的具体化合物；给药模式；所施用制剂的生物利用度性质；所选择的给药方案；伴随药物疗法的使用；以及其它相关的情形。

本发明所用的术语“富勒烯本体”是指没有经过水溶性改性的富勒烯，即富勒烯原料。

本发明所用的术语“金属富勒烯本体”是指没有经过水溶性改性的金属富勒烯，即金属富勒烯原料。

本发明中所有范围的公开应当视为对范围内所有子范围和所有点值的公开。例如：1-1000的公开应当视为也公开了1-200,200-300等范围，同时也公开了200、300、400、500、600、700、800、900和100等点值。

本领域为发展中的认知领域，本申请的权利要求的解读并不必然受本申请中任何特定的理论或机理或推断的限制。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

与目前临床普遍使用的环磷酰胺、紫杉醇等比较，本发明水溶性好，与生物体有很好的亲和性，毒性低，对肿瘤的抑制效率高；且本发明中的空心富勒烯纳米材料成本较为低廉，能普遍推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1中所得c70-oh制成的水溶液的外观照片，水溶液中c70-oh的浓度为1mg/ml。

图2为本发明实施例1中所得c70-oh的热重分析及微商热重分析曲线。

图3为本发明实施例1中所得c70-oh在纯水中的水合粒径分布曲线。

图4为本发明实施例5中c70-oh抑制小鼠肝癌肿瘤生长的实验流程图。

图5为本发明实施例5中不同组在不同时间点的小鼠肝癌肿瘤的生长情况图片，其中saline(ip)为腹腔注射生理盐水的对照组；c70-oh(ip)为腹腔注射c70-oh的药物组；c70-oh(iv)为静脉注射c70-oh的药物组。

图6为本发明实施例5中药物组及对照组在实验结束时每组的各4只平行小鼠的肝癌肿瘤的对比照片。

图7为本发明实施例5中药物组及对照组的肿瘤体积及质量数据。

图8为本发明实施例5中药物组及对照组在实验期间小鼠的体重增长曲线。

图9为本发明实施例5中药物组及对照组常规血液指标数据。

图10为本发明实施例5中药物组及对照组血生化指标数据，其中alt为谷丙转氨酶；ast为谷草转氨酶；alp为碱性磷酸酶；bun为尿素氮。

图11为本发明实施例6中药物组及对照组的肿瘤生长曲线。

图12为本发明实施例6中药物组及对照组在实验期间小鼠的体重增长曲线。

图13为本发明实施例6中药物组及对照组血生化指标数据，其中alt为谷丙转氨酶；ast为谷草转氨酶；alp为碱性磷酸酶；bun为尿素氮。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、c70-oh的合成

(a)将7ml质量百分含量为30％的过氧化氢(分析纯，购于国药试剂)水溶液和3ml质量百分含量为40％的氢氧化钠(分析纯，国药试剂)溶液加入100ml圆底烧瓶，加入200mg富勒烯c70固体(纯度：99％，厦门福纳新材料科技有限公司)，再加入磁力搅拌子(型号：b200)，使用磁力搅拌器搅拌24h(温度：50℃，转速：1000r/min)，使用溶剂过滤器(容积：1l，滤膜孔径：200nm，津腾公司)过滤得到棕黄色溶液。

(b)将(a)步骤得到的溶液加入50ml的离心管中，再加入过量的浓度为95％的乙醇(分析纯，国药试剂)。经过离心(转速：10000r/min，时间：4min)后去除上层无色溶液，将收集的沉淀溶于超纯水中，得到黄色澄清溶液。

(c)将(b)步骤得到的溶液装入透析袋(截止分子量为3500)放入超纯水中透析，室温透析至超纯水的电导率小于1μs/cm，得到黄色溶液。

(d)将(c)步骤透析后的溶液装入50ml塑料离心管中，使用液氮冷冻后放入冷冻干燥机中冷冻干燥(温度：-29℃，真空度：55pa，时间：48h)，将得到的黄色固体装入棕色样品瓶中备用。

实施例2、水溶性c70-oh纳米颗粒羟基数目的测定

对上述实施例1制备得到的c70-oh纳米颗粒进行元素分析(flashea1112)，并结合热重和微商热重结果分析其所接羟基数。从元素分析的结果(如下表)可以看出，所述c70-oh中，c含量为37.85％，h含量为1.51％，n含量<0.3％。

从热重分析(图2)可知，c70-oh固体粉末中含3.7％的水，约为5个水分子，结合元素分析中h含量与c含量的比值，可推算碳笼表面修饰了24个羟基。所以c70-oh的平均结构式为c70(oh)24·5h2o。

实施例3、水溶性c70-oh纳米颗粒水合粒径的测定

取少量本发明实施例1制备的c70-oh粉末溶于水配成稀溶液，由于分子间相互作用，c70-oh在水中团聚成纳米颗粒，形成平均水合粒径在1～200nm的颗粒。

采用动态光散射(dls，zetasizernanozsp)测定了在ph＝7.0的纯水中纳米颗粒的水合粒径，c70-oh的平均水合粒径为135.9nm，其粒径分布曲线参见图3。

实施例4、含c70-oh的注射用溶液

将100mg实施例1所得c70-oh固体溶解于100ml生理盐水中，室温超声5分钟，封装在玻璃瓶中，制成注射用溶液。

实施例5、c70-oh对小鼠肝癌肿瘤的生长抑制作用

动物品系：balb/c雌鼠，5周，体重在16-20g之间。

肿瘤模型：小鼠肝癌h22瘤株。

给药方式：静脉注射(iv)，腹腔注射(ip)。

实验分组：1、药物a组：c70-oh(ip)；2、药物b组：c70-oh(iv)；3、对照组：生理盐水(saline(ip))。每组4只balb/c雌鼠。

实验方法：皮下接种100μl浓度为5×10⁷/ml的h22肝癌细胞，接种24h后开始给药，药物组和对照组分别按照图4进行给药。药物a组和药物b组使用实施例4中所得注射用溶液，连续给药6天后每隔一天给药一次，共给药10次。实验期间每隔一天称量小鼠体重并观察肿瘤生长情况，观察至接种后15天结束实验(如图5)。取小鼠肿瘤称重及测量体积，同时取脏器用4％的多聚甲醛固定液固定。给药剂量：1mg/ml，单次注射0.15ml，共注射10次。

实验结果：对比药物组及对照组，能发现药物组肿瘤明显小于对照组，表示c70-oh药物能抑制肿瘤生长，且静脉注射的给药方式效果优于腹腔注射。

从长期观察小鼠的肿瘤生长情况(如图5)可知，从接种h22瘤株第7天开始，对照组肿瘤逐渐开始成熟长大，而注射c70-oh的两个药物组均对肿瘤有一定的抑制作用，由于静脉注射药物吸收率更佳，抑制作用更为明显，这从肿瘤的体积及质量上也得以体现。图6和图7中静脉注射c70-oh组的肿瘤体积及质量都比腹腔注射的更小。

从图8可得知，通过对比不同组小鼠的体重变化，对照组小鼠在前期体重上升较快，但在接种11天后体重反而呈现下降的趋势，表面肿瘤过大已经影响了小鼠的正常生长；注射c70-oh药物的两组小鼠体重一直处于稳定上升的趋势，虽然前期上升幅度没有对照组大，但是后期涨幅较快，说明c70-oh可以有效地抑制小鼠肿瘤的生长，并无明显的毒副作用。从图9和图10可知，c70-oh药物组与对照组在常规血液指标及血生化指标上无明显差异，这也表明了c70-oh药物的安全性。

实施例6

动物品系：balb/c雌性裸鼠，5周，体重在16-20g之间。

肿瘤模型：人源乳腺癌mda-mb-231。

给药方式：腹腔注射。

实验分组：1、生理盐水对照组；2、阳性药物(紫杉醇，paclitaxel)对照组；3、试验组(c70-oh，实施例4中所得注射用溶液)。

实验方法：皮下接种100μl浓度为5×10⁷/ml的人源乳腺癌mda-mb-231细胞，接种24h后开始给药。各个组的给药剂量如下：生理盐水组每天给200μl生理盐水；阳性药物对照组每隔3天给药1次，每次给药的剂量为10mg/kg；试验组每天给药，每天给药的剂量为5mg/kg；到第21天结束试验。实验期间每隔一天称量小鼠体重并观察肿瘤生长情况，观察至接种后21天结束实验，取小鼠肿瘤称重及测量体积，同时取脏器用4％的多聚甲醛固定液固定。

实验结果：如图11所示，阳性药物对照组及试验组的肿瘤体积明显小于生理盐水对照组，从实验结束时肿瘤重量看(如下表)，阳性药物对照组及试验组的肿瘤重量也明显小于生理盐水对照组，表示c70-oh药物能抑制肿瘤的生长。

对比不同组小鼠的体重变化，从图12可得知，阳性对照药物组的小鼠体重先有所增加，在用药中期快速下降，当用药时间持续加长时，体重下降明显，体现了阳性对照药的副作用。试验组小鼠在前期体重上升较快，整个用药期间其体重都高于生理盐水对照组小鼠的体重，说明c70-oh对小鼠并无明显的毒副作用。从图13可知，c70-oh药物组与对照组在常规血液指标及血生化指标上无明显差异，这也表明了c70-oh药物的安全性。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。