一种miR-340调控IL-17A表达的用途的制作方法

本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种mir-340调控il-17a表达的用途。

背景技术

银屑病是影响最为广泛的3大自身免疫病之一，其全球发病率约为3％，其中三分之一的患者达到中度至重度的程度。银屑病病征表现为皮肤增厚和广泛性损害，可引起瘙痒、鳞屑和疼痛，并严重影响患者的生活质量、心理健康以及社会关系。此外，病症较重者易患合并症，如关节炎、心脏病和糖尿病，具有死亡风险。

目前，科学家已经证实自身免疫性银屑病主要由il-23/il-17a炎症轴介导，其病理过程主要为：致病因素(如遗传、环境、感染以及物理损伤等)导致先天性免疫细胞(如角质细胞、自然杀伤细胞等)分泌tnf-α、il-1β和il-6等促炎性因子，激活树突状细胞等先天免疫细胞。活化的树突状细胞迁移到皮肤淋巴结等免疫器官中，提呈抗原并分泌il-23等促炎性因子，促使naivecd4+t细胞向th17分化。分化的自身反应性th17从皮肤的毛细血管中迁移出，浸润到皮肤中的炎症部位。在获得自身抗原的再刺激后，持续增殖并分泌il-17a等多种炎性因子。il-17a等因子可激活角质细胞，刺激其增殖，形成银屑症状。另一方面，活化的角质细胞又可分泌抗菌肽(如ll-37抗菌肽和β-防御素)、促炎性因子(tnf-α、il-1β和il-6)、趋化因子(cxcl8-11、ccl20)以及s100蛋白等，这些因子又可激活先天性免疫细胞，导致炎症恶性循环，从而维持并加重银屑病发展。可见，il-17a在银屑病先天免疫和适应性免疫的炎症回路中扮演着重要的桥联作用。

现在，对银屑病的治疗主要按照疾病的严重程度予以分类治疗。对于轻中度银屑病常局部予以外用药物来治疗，如糖皮质激素、维生素d3类似物、维a酸、蒽林、焦油类等。外用药物无效或者重度银屑病，尤其是红皮病型银屑病、泛发性脓疱型银屑病及关节病型银屑病等，常采用系统给药疗法，如肌肉或静脉滴注甲氨蝶呤、环孢素等小分子免疫抑制剂。近几年，一些生物制剂也被fda批准用于治疗重度银屑病，如以t细胞cd2或cd11a、tnf-α、il-12和il-23为靶点的单抗。这些生物制剂疗效惊人，但安全性不明确，有待临床的长期考证。此外，各大医药公司还正积极开发以il-23、il-17或il-17受体等为靶点的单抗药物，其中诺华公司研发的secukinumab在2015年年初获欧盟批准，系全球首个il-17单抗。遗憾的是，出于安全性考虑，中轻度患者在短期内不能享用这些单抗药物。

微小rna(mirna)是一类广泛存在于真核细胞、长度为18-22个核苷酸的非编码单链小分子rna，其表达失衡被认为是恶性肿瘤发病的主要机制之一。随着对mirna研究的深入，其在皮肤病，尤其是由免疫应答参与或主导的皮肤病中发挥重要作用，机制包括调节皮肤炎症反应、免疫细胞相互作用及细胞增殖等。银屑病是一种慢性炎症性皮肤疾病，与遗传、感染、环境等多种因素相关，在发病过程中由mirna主导的免疫调节可能起重要作用。

mirna可在免疫系统各环节执行精细但较柔和的调节，如免疫细胞分化、细胞信号转导等，这些免疫调节是银屑病发病的重要机制。淋巴细胞在健康人群皮肤内较少，其量几可忽略，但是在银屑病皮损处及外周血含量显著增加，尤其集中于皮损真皮的乳头层。mirna-340在肿瘤的发病机制中起到非常重要的作用，并在不同类型的肿瘤研究中，发挥致癌或抑癌的调节作用，通过抑制相关致癌基因包括p-akt、ezh2、表皮生长因子受体等，或通过靶向相关基因抑制肝癌、肺癌、结肠癌、胃癌，乳腺癌等发挥抑癌症作用。同时，mirna-340也可能调节免疫细胞的分化与功能。

目前常用的外用药物主要包括：皮质激素类、维生素a酸类、钙调磷酸酶抑制剂他克莫司、维生素d类似物卡泊三醇、由钙泊三醇和倍他米松组成的复方制剂。但主要用于轻度银屑病患者，对中重度患者疗效差，并且很难根治银屑病。从目前来看，治疗银屑病最有效的免疫抑制剂之一是甲氨蝶呤(mtx)，通过抑制角质形成细胞增殖达到治疗效果，但是副作用发生率高，长期使用会出现严重的肝功能损害及骨髓抑制。而以tnf-α、il-12、il-23等单一炎症因子为靶点的抗体药物大多数是大分子糖蛋白，分子量大，结构复杂，不利储存；抗体药物价格昂贵，给患者带来巨大经济负担。

因此，提供一种能有效治疗自身免疫性银屑病，同时几乎不影响免疫系统正常功能的发挥的包含mirna的药物组合物，具有重要的医学价值和广阔的市场前景。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种mir-340调控il-17a表达的用途，所述mirna-340通过结合3’utr负调控il-17a，从mrna和蛋白水平降低il-17a的表达，但不影响其他炎症因子如il-17f、il-21、il-22、ifn-γ、il-2、il-4的表达，可明显改善银屑样皮损症状，来达到缓解银屑病症状的治疗效果，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种mir-340调控il-17a表达的用途。

本发明中，发明人通过设计复杂且多角度的实验，抽丝剥茧，逐一排查，最终发现了mir-340调控il-17a表达的作用，并经体内外实验反复论证考查，确认了其特异性和有效性，这一发现并没被报道，具有独一无二的创造性。

在体外实验中，发明人首先检测小鼠银屑病模型的脾脏t细胞mirna-340明显降低，同时发现外周血、皮损部位高表达mirna-21，这可能是银屑病发病机制中il-17a表达升高的原因。

优选地，所述mir-340的核苷酸序列如seqidno.1所示。

小鼠mir-340成熟体核苷酸序列即seqidno.1如下：uuauaaagcaaugagacugauu。

优选地，所述mir-340能够在mrna水平和蛋白质水平抑制小鼠体内il-17a的表达。

优选地，所述mir-340不影响小鼠体内il-17f、il-21、il-22、ifn-γ、il-2和il-4的表达。

咪奎莫特(imq)诱导的银屑病模型与人类银屑病的病理变化有较多相似之处，是研究银屑病的理想模型。imq是toll样受体(tolllikereceptor，tlr)7/8的激动剂，将其涂抹于小鼠的皮肤上，可通过tlr途径激活树突状细胞和巨噬细胞以及tlr非依赖途径激活角质细胞，促进ifn-α、tnf-α等促炎性因子的分泌，募集炎性细胞到皮肤，产生银屑病样皮损及组织学改变。并且，已经证实il-23/il-17a炎症轴在imq诱导的银屑病模型中发挥着关键的作用。

具体地，在体内验证部分，imq诱导开始前1天、诱导开始后第2天及第4天对治疗组小鼠给予mirna-340agomir治疗，并通过表型变化评估银屑病病情严重程度，发现mirna-340agomir可明显改善治疗组小鼠的银屑样皮损症状，从mrna和蛋白水平降低小鼠体内il-17a的表达，但不影响其他炎症因子如il-17f、il-21、il-22、ifn-γ、il-2、il-4的表达。此外，两组小鼠皮肤切片h&e染色结果显示，治疗组小鼠皮肤表皮较对照组薄，且治疗组小鼠皮肤内浸润的炎性细胞明显减少。以上结果表明，mirna-340可能通过特异性抑制il-17a的表达，来达到缓解银屑病症状的治疗效果。

第二方面，本发明提供一种增加mir-340表达的化学模拟物和/或类似物用作调节il-17a的用途；

优选地，所述增加mir-340表达的化学模拟物为mir-340mimics。

优选地，所述增加mir-340表达的类似物为mirna-340agomir。

agomir是经过化学修饰的双链小rna，通过模拟内源性的mirna来调节靶基因的生物学功能。agomir是根据microrna成熟体序列设计，经过特殊标记与化学修饰的双链小rna分子,是用于模拟内源性成熟体mirna序列。agomir包括一条与目标mirna成熟体序列一致的序列，以及一条与mirna成熟体序列互补的序列。特异的micrornaagomir能够被导入到表达对应microrna的细胞内，模拟microrna的作用。

第三方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包含mir-340、增加mir-340表达的化学模拟物或增加mir-340表达的类似物中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的药物组合物、增加mir-340表达的化学模拟物或增加mir-340表达的类似物用作制备治疗il-17a介导的自身免疫性疾病的药物的用途。

其中，所述疾病包括银屑病、风湿性关节炎、脑脊髓炎中的任意一种或至少两种的组合，优选为银屑病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的mir-340调控il-17a的用途，所述il-17a主要由th17细胞表达，该细胞是介导自身免疫性疾病的最主要免疫细胞，与系统性使用免疫抑制剂相比，副作用小；mir-340分子量较小，结构简单，给药方式较大分子单抗类药物方便；通过化学修饰的mir-340具有较高稳定性，可以在体内稳定发挥治疗作用，为制备治疗il-17a的药物提供更好的选择。

附图说明

图1为本发明mirna-340模拟物负调控il-17a的结果图；

图2为本发明mirna-340处理改善银屑病皮损症状的结果图，其中，23(a)为银屑病诱导剂治疗过程图，图2(b)为皮损打分结果图，图2(c)为第5天时对照组合治疗组小鼠的表型图，图2(d)为对照组和治疗组小鼠皮损区皮肤染色图；

图3为本发明小鼠银屑病模型mirna表达异常的结果图，其中，图3(a)为mir-340表达结果图，图3(b)为mir-21表达结果图；

图4为本发明mirna-340处理组小鼠il-17a表达减少的结果图，其中图4(a)为rt-qpcr检测mir-340和nc组小鼠腹股沟淋巴结il-17amrna水平表达图，图4(b)为rt-qpcr检测两组小鼠脾脏il-17amrna水平表达图，图4(c)为elisa检测两组小鼠腹股沟淋巴结il-17a蛋白水平表达图，图4(d)为elisa检测两组小鼠脾脏il-17a蛋白水平表达图；

图5为本发明mirna-340处理不影响il-17a以外的炎性因子表达的结果图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

实施例1

将错义寡核苷酸(negativecontrol)、mirna-340模拟物(mimics，购自吉玛基因)分别利用电转染的方式转入初始cd4+t细胞，电转后完全培养基孵育4小时，加入含有cd3单克隆抗体、cd28单克隆抗体、tgf-β、il-6、il-1β、tnf-α等成分，定向诱导th17细胞分化，elisa检测细胞上清中il-17a表达量，结果见图1所示；

由图1可知，mirna-340模拟物显著抑制细胞上清中il-17a的表达。

实施例2

建立小鼠银屑病模型，诱导及治疗过程见图2(a)，6-8周龄小鼠连续4天每日于背部涂抹咪喹莫特乳膏(80mg/day)，第0、2、4天时尾静脉注射agomir(购自吉玛基因)或nc，第5天处死小鼠并取材；治疗过程中，每日对各组小鼠进行皮损打分(0-12)，结果见图2(b)所示，第5天时对照组合治疗组小鼠的表型见图2(c)，将对照组与治疗组小鼠皮损区皮肤进行h&e染色，数值显示为均值±标准差(n＝8；10)，student-t检验，*:p<0.05；***:p<0.001，结果如图2(d)所示；

由图2(d)结果显示，治疗组小鼠皮肤表皮较对照组薄，且治疗组小鼠皮肤内浸润的炎性细胞明显减少。

于治疗过程的第5天取小鼠的脾细胞，采用rt-qpcr方法检测小鼠银屑病模型的脾脏t细胞mirna-340、mirna-21表达，结果如图3(a)-图3(b)所示；

由图3(a)-图3(b)可知，银屑病模型中mirna-340表达降低，而mirna-21表达上升。

实施例3

建立小鼠银屑病模型同实施例2，将治疗过程的第5天取小鼠的脾细胞、引流淋巴结细胞，培养于完全培养基中，使用或不使用抗cd3单抗或抗cd28单抗刺激6小时，提取细胞rna，rt-qpcr检测il-17a的mrna水平；刺激48h，收集上清，elisa检测il17a的蛋白水平，数值显示为均值±标准差，student-t检验，*:p&lt;0.05，结果见图4(a)-图4(d)；

由图4(a)-图4(d)可知，无论是否使用或不使用抗cd3单抗或抗cd28单抗刺激，mir-340均能降低il-17a的mrna和蛋白质的表达水平。

实施例4

建立小鼠银屑病模型同实施例2，将治疗过程的第5天取小鼠的脾细胞培养于完全培养基中，使用抗cd3单抗或抗cd28单抗刺激6小时，提取细胞rna，rt-qpcr检测il-17f、il-21、il-22、ifn-γ、il-2和il-4的表达。数值显示为均值±标准差，student-t检验，ns:p＞0.05，结果见图5所示；

由图5可知，mirna-340agomir不影响其他炎症因子如il-17f、il-21、il-22、ifn-γ、il-2、il-4的表达。

综上所述，本发明提供的mir-340调控il-17a的用途为制备治疗il-17a介导的自身免疫疾病的药物提供更多的选择和可能性，调控效果稳定高效，具有广阔的应用前景和市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

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