升麻素苷在制备髓源性抑制细胞抑制药物中的应用的制作方法

本发明涉及药物化学领域，具体而言，涉及升麻素苷作为髓源性抑制细胞(myeloid-derivedsuppressorcells，mdscs)抑制剂的用途，即升麻素苷在制备髓源性抑制细胞抑制药物中的应用。

背景技术

升麻药材取自升麻，大三叶升麻与兴安升麻的根状茎。性凉；味甘辛微苦；归肺、脾、胃经。主要功效：发表透疹，清热解毒，升阳举陷。关于升麻素苷目前研究主要集中在它对心血管系统的作用、镇静、抗惊厥作用、解热降温作用、对平滑肌的作用。研究表明升麻素苷可以剂量依赖性的抑制mapk，nf-κb，jak2/stat3信号通路的激活进而抑制inos，cox-2和前列腺素e2(pge2)的表达和tnfα，il-1β和il-6的产生。

mdscs是骨髓来源的一群异质性细胞，是树突状细胞(dendriticcells,dcs)、巨噬细胞和(或)粒细胞的前体，具有显著抑制免疫细胞应答的能力。在小鼠体内，mdsc被定义为共同表达髓系抗原gr-1和cd11b的细胞(gr-1⁺cd11b⁺),根据ly-6c和ly-6g的表达，gr-1⁺cd11b⁺细胞可进一步分为粒细胞样gmdscs(cd11b⁺ly-6g⁺ly-6c^low)和单核细胞样mmdsc(cd11b⁺ly-6g^-ly-6c^high)两种亚型。在荷瘤小鼠的血液、脾脏和肿瘤组织及肿瘤患者的外周血和肿瘤组织存在大量mdscs的扩增，但大多数模型中，粒细胞样mdscs的扩增明显高于单核细胞样mdscs。mdscs可以通过多种途径抑制机体的获得性和天然抗肿瘤免疫，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视和攻击，促进肿瘤发展。mdscs参与肿瘤免疫逃逸的方式可概括为两个方面，一方面mdscs可以通过表达高水平的argl、inos和ros抑制t细胞介导的特异性抗肿瘤免疫及nk和巨噬细胞介导天然抗肿瘤免疫，另一方面mdscs可以表达多种促血管形成因子，如vegf、bfgf(basicfibroblastgrowthfactor)和mmps，这些因子能够直接促进肿瘤血管的形成。现在越来越多的证据表明，肿瘤里浸润的免疫抑制性细胞如调节性t细胞(tregs)和髓源性抑制细胞(mdscs)是肿瘤免疫耐受的非常重要的原因，并且目前临床上的pd-1抑制剂的存在的一些问题如反应率低，副作用强，肿瘤复发频繁也是由于这些免疫抑制性细胞介导的。目前，临床上靶向mdscs的抑制剂是治疗肿瘤的一个非常重要的策略。

此外，研究显示mdsc在自身免疫性疾病、感染性疾病，炎性介导的组织损伤等病理状态同样起到促进疾病发展的重要作用。在自身免疫脑脊髓炎小鼠模型中，吉西他滨(gemcitabine，药物名)可降低mdsc数量，从而抑制cd4⁺t向th17分化，减少th17依赖性炎性反应，改善疾病状况。在获得性免疫缺陷研究中，hiv血清反应阳性的患者检测出单核样mdsc升高，并且对于抑制t细胞免疫有促进作用，该发现为抗hiv治疗提供了新的方向。

到目前为止，升麻素苷作为髓源性抑制性细胞(myeloid-derivedsuppressorcells,mdscs)的抑制剂还没有报道。因此，本发明对此进行了研究。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明创造旨在提出升麻素苷在制备髓源性抑制细胞抑制药物中的应用，以解决现有技术存在的问题。

为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：

升麻素苷在制备髓源性抑制细胞抑制药物中的应用，所述升麻素苷的分子结构式为：

。

进一步的，所述升麻素苷在制备抗肿瘤药物中与pd-1/pd-l1抑制剂协同作用，增强pd-1/pd-l1抑制剂的抗肿瘤效果。

进一步的，所述升麻素苷是通过抑制机体的髓源性抑制细胞的产生和募集活化，提高cd3⁺cd8⁺t细胞的含量，进而提高机体的免疫调节能力。

进一步的，所述髓源性抑制细胞抑制药物包括抗肿瘤药物、自身免疫性疾病治疗药物、炎性介导的组织损伤治疗药物、感染性疾病治疗药物。

进一步的，所述髓源性抑制细胞抑制药物包括升麻素苷以及升麻素苷在药学上可接受的盐、酯、水合物或它们的组合以及辅料

相对于现有技术，本发明通过建立b16-f10皮下肿瘤模型验证了升麻素苷对黑色素瘤的抑制作用及其对免疫抑制微环境的调节作用，研究结果显示升麻素苷可以抑制机体mdscs的产生和募集活化，并且提高cd3⁺cd8⁺t细胞的含量，改善荷瘤小鼠体内的免疫抑制微环境，从而提高机体的免疫调节能力，其不仅适用于制备抗肿瘤药物，而且适用于自身免疫性疾病，感染性疾病，炎性介导的组织损伤等药物的制备。

除此以外，升麻素苷能够与pd-1(程序性细胞死亡蛋白-1，programmeddeath-1)及其配体(pd-l1)抑制剂协同作用，进而增强pd-1及其配体(pd-l1)抑制剂的抗肿瘤效果。

附图说明

图1是表明升麻素苷剂量依赖的抑制b16-f10皮下肿瘤模型的生长效果图；

图2是荷瘤小鼠在升麻素苷治疗后骨髓、脾脏和肿瘤中mdscs比例变化图像；

图3是荷瘤小鼠在升麻素苷治疗后脾脏和肿瘤中cd3⁺cd8⁺t细胞比例变化图像；

图4是荷瘤小鼠在升麻素苷治疗后骨髓和肿瘤中mdscs的免疫抑制能力变化图像；

图5是体外升麻素苷对mdscs免疫抑制能力的影响效果图；

图6升麻素苷能够增强pd-1的抗肿瘤效果数据图；

图7是升麻素苷跟pd-1抑制剂联合使用延长鼠的生存期的效果数据图；

图8是升麻素苷能够增强pd-l1的抗肿瘤效果数据图；

图9是升麻素苷跟pd-l1抑制剂联合使用延长鼠的生存期的效果数据图。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明使用的试验材料及其来源包括：

1主要实验设备

37℃培养箱(新苗)；超净台(苏洁净化)；离心机(cence湘仪)；高温灭菌锅(snayo)

2主要实验药物与试剂

升麻素苷(成都普思生物科技有限公司)；mdscs相关流式抗体(ebioscience)；t细胞相关流式抗体(ebioscience)；肿瘤解离试剂盒(miltenyibiotec-130-096-730)；cfse细胞增殖检测试剂盒(sigma)；dcfda(invitrogen)；pd-1抗体(clonermp1-14，bioxcell)；pd-l1抗体(clone10f.9g2,bioxcell)；羟丙基β环糊精(tci)；dmso(solarbio)

3细胞及实验动物

黑素瘤细胞系b16-f10：凯基生物；乳腺癌细胞系4t1：凯基生物；6周龄c57bl6(雌性)小鼠：由中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心和北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

实施例1升麻素苷可以降低荷瘤小鼠体内的mdscs的含量，改善免疫抑制微环境

实验方法及步骤：

1、体内实验检测升麻素苷对b16-f10皮下移植瘤模型的抑制作用及其对mdscs的影响

1.1b16-f10皮下移植瘤模型的建立

将4*10⁵个b16-f10细胞皮下注射到c57bl/6小鼠的前腋部皮下建立b16-f10肿瘤皮下移植瘤模型。当肿瘤达到100-200mm³，把小鼠平均分成三组，每组6只。

1.2给药

对照组仅给缓冲液(20％羟丙基β环糊精缓冲液中的5％dmso)；升麻素苷低剂量和高剂量组分别以100mg/kg/day、200mg/kg/day剂量腹腔注射升麻素苷，给药周期14天。记录瘤体积(长*宽*宽/2)。

1.3流式检测mdscs及cd3+cd8+t的含量

1.3.1制备骨髓细胞单细胞悬液

给药14天后将三组荷瘤小鼠脱颈处死，将处死的c57小鼠放置于超净台中的酒精进行灭菌处理10分钟。取出，取小鼠后肢并将皮毛和骨髓节点两端减去，用注射器吸取pbs(磷酸缓冲盐溶液)将其骨髓吹出，置于放置有pbs的6cm培养皿中。用移液枪将吹出的骨髓混悬液过滤至1.5ml的离心管中。离心，用1ml红细胞裂解液重悬吹匀裂解10分钟，1200r/min离心7min，用pbs重悬洗涤，离心后培养于1640完全培养基中。

1.3.2制备脾脏细胞单细胞悬液

将处死的c57小鼠放置于超净台中的酒精中进行灭菌处理10分钟。取出后，沿其腹部中轴线剪开，取出脾脏，放置于预先加入1mlpbs的培养皿中。在培养皿中用操作剪将其剪碎，再用移液枪将pbs与破碎组织的混合液通过滤网过滤至1.5ml的离心管中，裂解操作同上。

1.3.3制备肿瘤组织单细胞悬液

利用肿瘤解离试剂盒(miltenyibiotec-130-096-730)将肿瘤组织加工成单细胞悬液，裂解操作同上。

1.3.4流式检测

将上述骨髓、脾脏和肿瘤单细胞悬液离心，用100μlpbs重悬，分别设置阴性对照组、mdscs表面抗原ly-6c、ly6g和cd3⁺cd8⁺t细胞表面抗原cd3、cd8单阳组，样品组，避光条件下4℃孵育1h。将孵育后的细胞离心，1200r/min，7min。弃去上清，用300μlpbs重悬，吹匀，经过滤后放入流式管中，注意避光，分别流式检测骨髓、脾脏和肿瘤单细胞细胞中的mdscs和t细胞含量。

1.4流式分选以及共培养

按上述方法制备小鼠的骨髓和肿瘤的单细胞悬液，分别与mdscs抗体孵育，而后用流式分选仪分选。从正常小鼠脾脏中分选出来的cd3⁺cd8⁺t细胞，用pbs调整密度为1*10⁶，加入cfse染料，置37℃，5％co2培养箱培养30分钟，1200r/s离心5min，弃上清，然后取pbs洗细胞两次。将3组骨髓和肿瘤的mdscs与t细胞按1:1共培养2天，流式细胞仪检测t细胞的增殖。将共培养后的细胞进行离心，1200r/min，7min。弃去上层清液，用300μlpbs重悬，吹匀，经过滤后放入流式管中，注意避光，流式检测cfse强度。

2、体外检测升麻素苷对mdscs免疫抑制功能的影响

2.1流式分选mdscs

按上述方法从小鼠中取出的骨髓和脾脏单细胞细胞，然后分别与mdscs和t细胞抗体孵育用流式分选仪分选。将分选出的mdscs，用mdscs培养基调整密度为1*10⁶，分成control、升麻素苷低剂量(50μm)、升麻素苷高剂量(100μm)三组，将3组细胞铺于48孔板中，每组3个重复，加药处理两天。

2.2ros检测

加药两天后，mdscs用dcfda(invitrogen)检测ros的含量，然后流式检测。

2.3mdscs与cd3⁺cd8⁺t共培养

将分选出来的cd3⁺cd8⁺t细胞，用pbs调整密度为1*10⁶，加入cfse染料，置37℃，5％co2培养箱培养30分钟，1200r/s离心5min，弃上清，然后取pbs洗细胞两次。将3组mdscs与t细胞按1:1共培养2天，将共培养完的细胞进行离心，1200r/min，7min。弃去上层清液，用300μlpbs重悬，吹匀，经过滤后放入流式管中，注意避光，流式检测cfse强度。

实验结果及评价

1)如附图1所示，体内实验证明升麻素苷可以剂量依赖的抑制b16-f10皮下肿瘤模型的生长。

2)如附图2所示，通过流式检测实验证明，与对照组相比，升麻素苷治疗组小鼠的骨髓、脾脏和肿瘤中的mdscs细胞比例剂量依赖性的减少了。

3)如附图3所示，通过流式检测实验证明，与对照组相比，升麻素苷治疗组小鼠的脾脏和肿瘤中的cd3+cd8+t细胞比例呈现剂量依赖性的增加。

4)如附图4所示，通过流式检测实验证明，与对照组相比，升麻素苷治疗组小鼠的骨髓和肿瘤中mdscs抑制t细胞增殖的能力被显著抑制，并且呈现剂量依赖性。

5)如附图5所示，通过流式检测证明在体外升麻素苷能剂量依赖性抑制细胞中活性氧(ros)的产生，并且可以改善mdscs对cd3+cd8+t细胞的免疫抑制能力。

以上实验结果表明，升麻素苷可以抑制荷瘤小鼠体内mdscs的产生和募集活化，并且提高cd3+cd8+t细胞的含量，从而改善荷瘤小鼠体内的免疫抑制微环境，提高机体的免疫调节能力。

实施例2.升麻素苷增强pd-1抑制剂的抗肿瘤效果

实验方法及步骤：

1.建立b16-f10黑色素和4t1肿瘤模型

将4*10⁵个b16-f10细胞皮下注射到c57bl/6小鼠的右侧腹侧建立b16肿瘤皮下模型。将4*10⁵个4t1细胞注射到balb/c小鼠的小鼠第二对乳房脂肪垫中建立4t1原位肿瘤模型。

2.给药

药效观察实验：对照仅给药缓冲液(20％羟丙基β环糊精缓冲液中的5％dmso)；pd-1抑制剂组(pd-1ab)在第11,14,18和21天腹腔注射pd-1抗体(clonermp1-14，bioxcell，200μg/注射)；升麻素苷组(pog)在第11天开始以200mg/kg/day剂量腹腔注射升麻素苷，连续给药14天；升麻素苷和pd-1抑制剂连用组(pd-1ab+pog)在给予升麻素苷200mg/kg/day的基础上，在第11,14,18和21天腹腔注射pd-1抗体(clonermp1-14，bioxcell，200μg/注射)。

生存期观察实验：在上述分组给药的基础上连续给药并观察至60天。

3.记录瘤体积(长*宽*宽/2)和小鼠的生存期。

实验结果及评价

1)如附图6所示，通过建立小鼠黑色素瘤皮下模型和4t1的原位模型，证明升麻素苷能够增强pd-1抑制剂的抗肿瘤效果。

2)如附图7所示，通过建立小鼠黑色素瘤皮下模型和4t1的原位模型，证明升麻素苷跟pd-1抑制剂联合使用可以明显延长荷瘤小鼠的生存期。

实施例3.升麻素苷增强pd-l1抑制剂的抗肿瘤效果

实验方法及步骤：

1.建立b16-f10黑色素和4t1肿瘤模型

该部分方法同实施例2。

2.给药

药效观察实验：对照仅给药缓冲液(20％羟丙基β环糊精缓冲液中的5％dmso)；pd-l1抑制剂组(pd-l1ab)在第11,14,18和21天腹腔注射pd-l1抗体(clone10f.9g2,bioxcell，200μg/注射)；升麻素苷组(pog)在第11天开始以200mg/kg/day剂量腹腔注射升麻素苷，连续给药14天；升麻素苷和pd-l1抑制剂连用组(pd-l1ab+pog)在给予升麻素苷200mg/kg/day的基础上，在第11,14,18和21天腹腔注射pd-l1抗体(clone10f.9g2,bioxcell，200μg/注射)。

生存期观察实验：在上述分组给药的基础上连续给药并观察至60天。

3.记录瘤体积(长*宽*宽/2)和小鼠的生存期。

实验结果及评价

1)如附图8所示，通过建立小鼠黑色素瘤皮下模型和4t1的原位模型，证明升麻素苷能够增强pd-l1抑制剂的抗肿瘤效果。

2)如附图9所示，通过建立小鼠黑色素瘤皮下模型和4t1的原位模型，证明升麻素苷跟pd-l1抑制剂联合使用可以明显延长荷瘤小鼠的生存期。

以上实验结果表明：升麻素苷可以逆转及抑制机体的mdscs的聚集和免疫抑制能，在体内具有抗肿瘤效果并且能够与pd-1和pd-l1抑制剂协同作用，进而增强pd-1和pd-l1抑制剂的抗肿瘤效果。

以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。