一种七叶一枝花提取物在制备用于治疗人前列腺癌的药物中的应用的制作方法

本发明是关于一种七叶一枝花提取物在医药领域的新用途，更具体地说，是关于重楼皂苷i在制备用于治疗人前列腺癌的药物中的用途。

背景技术

前列腺癌是男性中最常见的恶性肿瘤之一。2012年，全球约有1,111,700例新发病例，其死亡人数已达307,500人。中国前列腺癌的发病率近年来显著增加。虽然据报道局限性前列腺癌患者的生存率>5年，但大多数患有前列腺癌的患者最终会遭到去势抵抗，导致复发。因此，寻找能够抑制前列腺癌细胞的肿瘤发生、发展和转移的新药迫在眉睫。

细胞自噬(autophagy)又称ii型程序性细胞死亡，是指隔离膜包裹细胞质和/或细胞器形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体并在其中发生降解的过程。自噬是细胞基本的分解代谢方式之一。自噬性死亡是指当自噬水平持续上调时引起的细胞死亡现象，自噬对细胞的调节有一个度，在适当的范围对细胞是有利的但是一旦超出这个度，就会影响细胞的生存，甚至是导致死亡。而利用中药中的活性成分诱导癌细胞自噬，是筛选新型药物的新思路。七叶一枝花(parispolyphyllasmithvar.chinensis(franch.)hara)是百合科重楼属植物，为《中国药典》2015年版收载的2种重楼药材基原植物之一。甾体皂苷是七叶一枝花提取物的主要活性成分，一系列的体内外研究表明重楼皂苷i(polyphyllini,ppi)与重楼皂苷ii对多种肿瘤具有抑制作用。ppi对自噬的作用、作为组合药物对人前列腺癌的治疗效果，目前均没有报道。

技术实现要素：

本发明目的是旨在提供了一种七叶一枝花提取物重楼皂苷在医药领域的新用途，用于制备治疗人前列腺癌药物中的应用。

为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：

一种七叶一枝花提取物在制备用于治疗人前列腺癌的药物中的应用，从七叶一枝花中分离提取的重楼皂苷i制备用于治疗人前列腺癌的药物中的应用。

优选的，重楼皂苷i的结构式如下，

所述重楼皂苷i在制备对人源性前列腺癌du145和/或pc3细胞株具有抑制作用的抑制剂中的应用。

重楼皂苷i在制备诱导自噬体的增加的制剂中的应用。

重楼皂苷i在制备抑制du145细胞异种移植瘤生长的制剂中的应用。

用于治疗人前列腺癌的药物由重楼皂苷i和医学上可接受的辅料组成，可以为任何药物治疗学上可接受的剂型，可以是片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、注射液、缓蚀剂中的任一种。重楼皂苷i使用剂量可以为任何药物治疗学上可接受的剂量。

本发明可用于人前列腺癌细胞株du145和pc3。重楼皂苷i对人前列腺癌du145和pc3细胞株具有抑制作用，并随剂量和时间的递增而提高。并且，本发明的重楼皂苷i能够诱导自噬体的增加，促进人前列腺癌细胞lc3b-ii的表达增加，能够抑制du145细胞异种移植瘤生长。从而，本发明提供了重楼皂苷i的新应用。

附图说明

本发明可以通过附图给出的非限定性实施例进一步说明；

图1中a为实施例1中重楼皂苷i对人源性前列腺癌du145细胞株的抑制效果图，b为实施例1中重楼皂苷i对人源性前列腺癌pc3细胞株的抑制效果图，

图2中a为实施例2中重楼皂苷i诱导人源性前列腺癌du145细胞株自噬体的形成的荧光显微镜观察结果，b为实施例2中重楼皂苷i诱导人源性前列腺癌pc3细胞株自噬体的形成的荧光显微镜观察结果；

图3为实施例3中重楼皂苷i影响人前列腺癌细胞lc3bii表达水平的实验结果图；

图4中a-d显示实施例4中重楼皂苷i对du145细胞异种移植瘤裸鼠体重及肿瘤组织重量及体积的影响。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员可以更好地理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明技术方案进一步说明。

重楼皂苷i(ppi)：购自上海源叶生物科技有限公司，纯度经高效液相色谱(hplc)测定大于95％。使用二甲基亚枫(dmso)配置成3mmol/l的储液，冻于-20度，每次使用时用培养基稀释至工作浓度。

细胞系：实施例中所用细胞系均购自atcc或中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

抗体：购自美国santacruz公司或者cellsignalingtechnology公司。

实施例1、重楼皂苷i抑制前列腺癌细胞生长

分别将处于对数生长期的前列腺癌du145和pc3细胞株接种于96孔板(每孔接种约5000个细胞，90μl培养基)，培养(37℃，5％co2培养箱)24小时后用不同浓度梯度(0.1-3μmol/l)的重楼皂苷i(polyphyllini,ppi)处理2种细胞。分别培养20和44小时后每孔加入10μl浓度为5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(mtt)溶液，继续培养4小时。终止反应后，吸掉培养基，每孔加入150μl二甲基亚砜，低速振荡充分溶解，然后用酶标仪测定490nm处的吸光值(od490)，计算生存率。

实验结果参见图1a与图1b。结果表明，不同浓度的本发明的ppi对人源性前列腺癌du145和pc3具有不同程度的抑制。

实施例2、重楼皂苷i能够诱导自噬体的增加

构建lc3过表达载体，载体加入dsred基因可表达红色荧光蛋白，当转染载体进入细胞后，在载体携带的lc3蛋白表达的同时，红色荧光蛋白也会在554nm激发光下可见红色荧光。由于lc3i亚型是水溶性蛋白，在细胞中以弥散状态存在；而lc3ii亚型是水不溶性蛋白，在水中以聚集态存在。因此，通过免疫荧光观察细胞中红色荧光的分布，即可了解lc3i亚型和lc3ii亚型在细胞中的分布高低，进一步可判定细胞是否发生自噬。

1.将前列腺癌du145和pc3细胞株分别在铺上载玻片的12孔板中以5×105个细胞/ml的密度铺板(四个孔)，培养24小时后，采用lipofectamine3000转染dsred-lc3质粒，4小时后按照如下方法得到2种经过不同浓度的ppi处理的癌细胞：

①将du145细胞分为2组，分别放入ppi浓度为0μmol/l和0.7μmol/l含10％fbs的dmem培养基中，在在37℃培养24小时，分别收集得到0μmol/l的ppi处理的du145细胞、0.6μmol/l的ppi处理的du145细胞、0.7μmol/l的ppi处理的du145细胞、0.8μmol/l的ppi处理的du145细胞。

②将pc3细胞分为2组，分别放入ppi浓度为0μmol/l和1.7μmol/l含10％fbs的dmem培养基中，在在37℃培养24小时，分别收集得到0μmol/l的ppi处理的pc3细胞、1.6μmol/l的ppi处理的pc3细胞、1.7μmol/l的ppi处理的pc3细胞、1.8μmol/l的ppi处理的pc3细胞。

2.使用4％多聚甲醛固定以上细胞15分钟，再用含0.2％的tritonx-100的pbs中透化细胞20分钟，3％牛血清蛋白(bsa)的pbs封闭30分钟后，荧光显微镜检测细胞中自噬体的形成情况。

3.实验结果：

免疫荧光结果显示，lc3ii型自噬体随着ppi作用浓度的增高而有升高趋势(图2a与图2b)，说明ppi能有效诱导前列腺癌细胞形成自噬体。

实施例3、重楼皂苷i能够促进人前列腺癌细胞lc3bii的表达增高

lc3是细胞自噬信号通路中的一个标志性蛋白，包括lc3i和lc3ii两种亚型。细胞在无自噬作用发生时，该蛋白在细胞质中以水溶性的lc3i亚型存在；细胞在有自噬作用发生时，该蛋白会转化为水不溶性的lc3ii亚型。通过检测细胞中lc3ii含量的多少，可以判定细胞发生自噬作用的强弱。

1.两种癌细胞的ppi处理的：

①将du145细胞分为四组，分别放入ppi浓度为0μmol/l、0.6μmol/l、0.7μmol/l和0.8μmol/l含10％fbs的dmem培养基中，在在37℃培养24小时，分别收集得到到0μmol/l的ppi处理的du145细胞、0.6μmol/l的ppi处理的du145细胞、0.7μmol/l的ppi处理的du145细胞、0.8μmol/l的ppi处理的du145细胞。

②将pc3细胞分为四组，分别放入ppi浓度为0μmol/l、1.6μmol/l、1.7μmol/l和1.8μmol/l含10％fbs的dmem培养基中，在在37℃培养24小时，分别收集得到到0μmol/l的ppi处理的pc3细胞、1.6μmol/l的ppi处理的pc3细胞、1.7μmol/l的ppi处理的pc3细胞、1.8μmol/l的ppi处理的pc3细胞。

2.检测：

用ripa裂解液裂解四种经过不同浓度的ppi处理的癌细胞du145和pc3细胞，蛋白溶液使用蛋白质印迹法(westernblot)上样。根据检测蛋白的分子量大小(14kda及36kda)配制15％聚丙烯酰胺凝胶，加样后电泳，根据分子量(14kda及36kda)分离后的蛋白质转移至pvdf膜上。转膜后用5％的脱脂奶粉封闭pvdf膜1小时，4℃过夜(7小时)孵育相应的抗体anti-lc3和anti-gapdh，第二天用洗膜缓冲液tbst(1:5000)每5分钟洗膜1次，共5次，tbst稀释相对应的二抗，室温25℃孵育1.5小时，tbst每5分钟洗膜1次，共5次。室温25℃孵育pvdf膜2分钟，ecl试剂盒暗室检测曝光(曝光时间：lc3需要10分钟，gapdh需要20秒)，检测各癌细胞中lc3ii亚型蛋白的表达量的变化。

3.检测结果：

westernblot结果显示，lc3ii型蛋白的表达量随着ppi作用浓度的增高而有升高趋势(图2)，说明ppi能有效诱导癌细胞发生自噬。

实施例4、重楼皂苷i对前列腺癌细胞异种移植瘤裸鼠的影响

将6×106个du145细胞注射入balb/c裸鼠(雌雄各半性，5周龄，体重18克左右)构建du145移植瘤小鼠模型，在平均瘤大小达到40～50mm3时，将小鼠分成两组(对照组和药物组)，每组6只。通过腹腔注射给药(每周连续5次)，药物组注射1μg/g的重楼皂苷i(将重楼皂苷i溶解于dmso中，再补充生理盐水，dmso含量是2％)，对照组注射安慰剂(2％dmso生理盐水)注射量是5μl安慰剂/g(体重)。给药期间用游标卡尺测量瘤的长径和短径(每周2次)，按公式：体积(mm3)＝长径×短径2×4π/3，计算瘤体积。4周后处死小鼠，取瘤组织称重。结果表明重楼皂苷i明显抑制肿瘤的生长(图4a、b、c)，并且对裸鼠体重影响不大(图4d)，并且通过测量药物组和对照组小鼠给药前后的瘤体积大小也说明重楼皂苷i明显抑制肿瘤的生长(表1)。

表1裸鼠注射药物前后肿瘤对比

以上对本发明提供的一种七叶一枝花提取物在制备用于治疗人前列腺癌的药物中的应用进行了详细介绍。具体实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。