一种用于基因治疗或转染的组合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种用于基因治疗或转染的组合物，属于生物化学和生物材料技术领域。

背景技术：

基因治疗作为一种新的治疗手段被广泛应用于治疗多种疾病，如肿瘤，遗传性疾病，炎症，免疫紊乱，内分泌失调，精神失常，心血管疾病等。它主要通过将外源基因导入靶细胞来改变现有基因的转录翻译、蛋白的表达、生物酶的合成等一系列作用调控生命活动来达到治疗效果。基因疗法的成功在于能够高效安全地递送外源基因进入靶细胞。因此高效安全的基因载体是关键。

阳离子分子，作为非病毒类载体中的一大类，主要通过静电相互作用与核酸分子形成带正电的复合物，通过内吞作用进入细胞。然而阳离子分子的转染效率与细胞毒性存在恶性交联，阳离子分子的正电荷越多，分子量越大，转染效率越好，但同时细胞毒性也越高，而低分子量的阳离子分子，多肽或者聚合物等生物相容更好，但因为表面正电荷少，与核酸结合弱，这种弱的复合物在受到蛋白质、磷脂等分子干扰时变得不稳定，从而提前释放核酸导致其转染效率低。而阳离子分子这种转染效率与细胞毒性的恶性交联限制了阳离子分子在生物医学和临床基因治疗领域的发展。

现有技术中众多基因转染方法复杂，材料合成工艺复杂，组成不可控，基因转染效果不佳，毒性较高。

技术实现要素：

本发明通过引入天然多酚这一元素，解决阳离子分子结合核酸弱的问题。天然多酚通过氢键结合核酸，形成负电的纳米颗粒，然后与阳离子分子结合，帮助阳离子分子稳定核酸，形成更均一的纳米颗粒(如图1和2)，从而提高阳离子分子的转染效率，降低阳离子分子的用量，同时具有良好的生物安全性。与单独使用阳离子分子进行递送相比，此组合物可以显著提高转染效率约60～70％，降低阳离子分子有效转染的剂量约20倍，从而降低转染的毒性，表现出更好的生物相容性。本发明中所述组合物不引入其他化学试剂，无需合成，生物安全性高，能够高效、安全地将多种核酸分子递送到细胞中，同时借助天然多酚清除转染过程中产生的活性氧，利用天然多酚自身的抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用，可以充分发挥此组合物在肿瘤和炎症等相关疾病治疗中的作用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种用于基因治疗或转染组合物，其包括核酸、天然多酚和阳离子高分子。

作为优选方案，所述核酸包括sirna、mirna、lncrna、mrna或修饰的rna中的一种。

作为优选方案，所述核酸包括sirna、mirna、寡聚核苷酸，肽核酸和修饰的sirna中的一种。

作为优选方案，所述核酸为sirna或修饰的sirna。

作为优选方案，所述天然多酚选自黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类植物提取物中的至少一种。

作为优选方案，所述天然多酚包括表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、表没食子儿茶素(egcg)、表儿茶素没食子酸酯、单宁(ta)、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、1,2,3,6-四没食子酰葡萄糖、1,3,6-三没食子酰葡萄糖、原花青素、花青素、鞣花酸、咖啡酸中的至少一种。

作为优选方案，所述阳离子分子包括阳离子高分子、阳离子天然小分子化合物、阳离子多肽和带正电的蛋白质中的至少一种。

作为优选方案，所述阳离子分子包括聚酰胺-胺树形高分子、聚丙烯亚胺树形高分子、聚赖氨酸阳离子聚合物、支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物、线性聚乙烯亚胺阳离子聚合物中的至少一种。

作为优选方案，所述所述阳离子分子包括式i、式ii、式iii、式iv和式v中的一种化合物：

其中，m包括氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和1,12-十二烷二胺中的一种，n为1～10的整数，m为2～4的整数，a为1～100000的整数，式iii化合物的质均分子量为100～100000，式iv化合物的质均分子量为100～100000，式v化合物的质均分子量为100-100000；所述阳离子多肽包括细胞穿膜肽。

一种如前述的组合物制备方法，其包括如下步骤：将核酸，天然多酚和阳离子分子按照1：0.01～100000：0.01～100000的质量比混合。

一种如前述的组合物在基因转染或基因治疗药物中的用途。

作为优选方案，所述药物包括肿瘤药物、炎症药物、免疫紊乱药物、内分泌失调药物、精神失常药物、心脑血管药物和皮肤病药物中的一种。

天然多酚是一类广泛存在于植物体内的多元酚化合物，包括苯酚酸和黄酮类化合物。这种多酚类化合物的分子结构中有若干个酚羟基，多项体内外实验证明这类多酚化合物有显著的清除体内自由基、抗氧化、防紫外线、抗肥胖、预防心血管疾病、抗炎症、预防及治疗癌症的功效，常用于保健品或化妆品里的添加物。同时这类分子也是优良的氢键供体，能够通过氢键与核酸形成复合物，保护核酸免于核酸酶的降解。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明中所述方法不引入其他化学试剂，无需合成，材料天然，生物安全性高，能够有效且绿色安全地将核酸输送到细胞中，可作为兼具高效、低毒、低成本等优点的基因转染方法，在肿瘤，慢性肠炎，皮肤伤口愈合，免疫紊乱等基因相关疾病的治疗中具有良好的应用前景。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为实施例1中sirna/pll和sirna/egcg/pll两种复合物的尺寸；

图2为实施例1中sirna/pll和sirna/egcg/pll两种复合物的形貌；

图3为实施例2中不同复合物的细胞内吞情况；

图4为实施例3中此组合物(egcg)三者成分不同组合在hela-luci细胞中敲除萤光素酶基因的效率；

图5为实施例4中此组合物(egcg)使用不同阳离子聚合物在hela-luci细胞中敲除萤光素酶基因的效率；

图6为实施例5中此组合物(egcg)在hela-luci细胞中敲除萤光素酶基因的特异性；

图7为实施例6中此组合物(egcg)在人乳腺癌细胞(mda-mb-231)中敲除萤光素酶基因的效率及其特异性；

图8为实施例7中此组合物(egcg)在脑癌细胞u87中敲除基质金属蛋白酶mmp-9的效率；

图9为实施例8中此组合物(egcg)在人肺腺癌细胞pc-9中敲除甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapdh的效率；

图10为实施例中9中此组合物(egcg)在小鼠成纤维细胞nih-3t3中敲除脯氨酸羟化酶phd2的效率；

图11为实施例中10中此组合物(egcg)在小鼠肠上皮细胞iec中敲除脯氨酸羟化酶phd2的效率；

图12为实施例11中此组合物(egcg)在小鼠巨噬细胞raw264.7中敲除脯氨酸羟化酶phd2的效率；

图13为实施例12中此组合物(egcg)在小鼠肠炎中的敲除脯氨酸羟化酶phd2的效果及其肠炎治疗效果；

图14为实施例13中此组合物(ta)使用不同阳离子聚合物在hela-luci细胞中敲除萤光素酶基因的效率。

图15为实施例14中此组合物(儿茶素)在hela-luci细胞中敲除萤光素酶基因的效率。

图16为实施例15中egcg在hela-luci细胞中的细胞毒性；

图17为实施例16中egcg和lpei在hela-luci细胞中的细胞毒性；

图18为实施例17中egcg和bpei在hela-luci细胞中的细胞毒性；

图19为实施例18中egcg和pll在hela-luci细胞中的细胞毒性；

图20为实施例19中egcg和pamamg1在hela-luci细胞中的细胞毒性；

图21为实施例20中egcg和pamamg2在hela-luci细胞中的细胞毒性。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

实施例1本实施例涉及sirna/pll和sirna/egcg/pll两种复合物的尺寸和形貌的对比

将天然多酚egcg和萤光素酶luciferasesirna(质量比5:1)在室温下形成复合物，然后加入聚赖氨酸阳离子聚合物pll，通过动态光散射和透射电镜观察复合物的尺寸和形貌。

实验结果：

如图1所示为sirna/pll和sirna/egcg/pll两种复合物的尺寸，图2所示为sirna/pll和sirna/egcg/pll两种复合物的电镜形貌，结果表明与只有pll作为相比，添加egcg使得复合物能形成尺寸更均一，形貌更好的纳米颗粒。

实施例2本实施例涉及不同复合物的细胞摄入情况。

将天然多酚egcg和带荧光标签的萤光素酶luciferasesirna(fam-sirna)在室温下形成复合物，然后加入阳离子聚合物pll和pamam(质量比sirna：egcg：pll＝1:5:5，sirna：egcg：pamam＝1:10:10)，孵育之后加入到细胞中，观察sirna细胞摄入的情况。

实验结果：

如图3所示为不同复合物的细胞摄入情况，结果表明，与只有阳离子分子相比，添加egcg后，sirna细胞摄增强。

实施例3本实施例涉及核酸、天然多酚和阳离子分子三者成分不同组合在hela-luci细胞中敲除萤光素酶基因的效率。

将组合物中的三者成分按照不同的组合，在室温中孵育，然后在hela-luci细胞中进行转染，通过检测萤光素酶的表达量来评估复合物的基因转染效率。

实验结果：

如图4所示为不同成分组合在hela-luci细胞中敲除萤光素酶基因的效率，结果表明，如果只有一种或者两种成分，不管怎么组合，都不能有效敲除萤光素酶基因，但是三者在一起(质量比sirna：egcg：pll＝1:5:5)，可以有效敲除基因达77.2％，这三种成分缺一不可。

实施例4本实施例使用不同阳离子聚合物在hela-luci细胞中敲除萤光素酶基因的效率。

将天然多酚egcg和萤光素酶luciferasesirna(siluc)在室温下形成复合物，然后加入不同阳离子分子(质量比sirna：egcg：pll＝1:5:5，sirna：egcg：lpei＝1:5:5，sirna：egcg：dgl＝1:10:10，sirna：egcg：bpei＝1:10:10，sirna：egcg：ppi＝1:10:10，sirna：egcg：pamam＝1:10:10)，孵育之后在hela-luci细胞中进行转染，通过检测萤光素酶的表达量来评估复合物的基因转染效率。

实验结果：

如图5所示为不同阳离子聚合物在此组合物中敲除萤光素酶基因的效率，结果表明，不同的阳离子分子均能有效敲除基因达65～80％。

实施例5本实施例涉及一种组合物在hela-luci细胞中敲除萤光素酶基因的特异性。

将天然多酚egcg和萤光素酶luciferasesirna(siluc)和无意义序列sirna(sinc)在室温下形成复合物，然后加入聚赖氨酸阳离子聚合物pll(质量比sirna：egcg：pll＝1:5:5，sinc：egcg：pll＝1:5:5)，孵育之后在hela-luci细胞中进行转染，通过检测萤光素酶的表达量来评估复合物的基因转染效率。

实验结果：

如图6所示，只有sirna组基因有效敲除，sinc组没有有效的基因沉默，结果表明，此组合物的基因沉默效果具有特异性，没有出现非靶向性敲除。

实施例6本实施例涉及一种组合物在人乳腺癌细胞(mda-mb-231)中敲除萤光素酶基因的效率及其特异性。

将天然多酚egcg和萤光素酶luciferasesirna(siluc)和无意义序列sirna(sinc)在室温下形成复合物，然后加入聚赖氨酸阳离子聚合物pll(质量比sirna：egcg：pll＝1:20:20，sinc：egcg：pll＝1:20:20)，孵育之后在人乳腺癌细胞(mda-mb-231)中进行转染，通过检测萤光素酶的表达量来评估复合物的基因转染效率。

实验结果：

如图7所示，此组合物也可以在人乳腺癌细胞(mda-mb-231)中进行78％的基因沉默达，并且没有出现非特异性敲除现象。

实施例7本实施例涉及一种组合物在脑癌细胞u87中敲除基质金属蛋白酶mmp-9的效率

将天然多酚egcg和mmp-9sirna和无意义序列sirna(sinc)在室温下形成复合物，然后加入聚赖氨酸阳离子聚合物pll(质量比sirna：egcg：pll＝1:5:5，sinc：egcg：pll＝1:5:5)，孵育之后在u87细胞中进行转染，通过荧光定量rt-pcr检测mmp-9mrna的表达水平来评估复合物的基因转染效率。

实验结果：

如图8所示，此组合物可以在u87细胞中进行特异性的基因敲除，效率达79％。

实施例8本实施例涉及一种组合物在人肺腺癌细胞pc-9中敲除甘油醛-3-磷酸脱氢酶gapdh的效率

将天然多酚egcg和gapdhsirna和无意义序列sirna(sinc)在室温下形成复合物，然后加入聚赖氨酸阳离子聚合物pll(质量比sirna：egcg：pll＝1:5:5，sinc：egcg：pll＝1:5:5)，孵育之后在pc-9细胞中进行转染，通过荧光定量rt-pcr检测gapdhmrna的表达水平来评估复合物的基因转染效率。

实验结果：

如图9所示，此组合物可以在pc-9细胞中进行特异性的基因敲除，效率达89％。

实施例9本实施例涉及一种组合物在小鼠成纤维细胞nih-3t3中敲除脯氨酸羟化酶phd2的效率

将天然多酚egcg和phd2sirna和无意义序列sirna(sinc)在室温下形成复合物，然后加入聚赖氨酸阳离子聚合物pll(质量比sirna：egcg：pll＝1:5:5，sinc：egcg：pll＝1:5:5)，孵育之后在nih-3t3细胞中进行转染，通过荧光定量rt-pcr检测phd2hmrna的表达水平来评估复合物的基因转染效率。

实验结果：

如图10所示，此组合物可以在nih-3t3细胞中进行特异性的基因敲除，效率达70％。

实施例10本实施例涉及一种组合物在小鼠肠上皮细胞iec中敲除脯氨酸羟化酶phd2的效率

将天然多酚egcg和phd2sirna和无意义序列sirna(sinc)在室温下形成复合物，然后加入聚赖氨酸阳离子聚合物pll(质量比sirna：egcg：pll＝1:5:5，sinc：egcg：pll＝1:5:5)，孵育之后在iec细胞中进行转染，通过荧光定量rt-pcr检测phd2hmrna的表达水平来评估复合物的基因转染效率。

实验结果：

如图11所示，此组合物可以在iec细胞中进行特异性的基因敲除，效率达84％。

实施例11本实施例涉及一种组合物在小鼠巨噬细胞raw264.7中敲除脯氨酸羟化酶phd2的效率

将天然多酚egcg和phd2sirna和无意义序列sirna(sinc)在室温下形成复合物，然后加入聚赖氨酸阳离子聚合物pll(质量比sirna：egcg：pll＝1:5:5，sinc：egcg：pll＝1:5:5)，孵育之后在raw264.7细胞中进行转染，通过荧光定量rt-pcr检测phd2mrna的表达水平来评估复合物的基因转染效率。

实验结果：

如图12所示，此组合物可以在raw264.7细胞中进行特异性的基因敲除，效率达79％。

实施例12本实施例涉及一种组合物在小鼠中敲除脯氨酸羟化酶phd2治疗慢性肠炎

利用硫酸葡聚糖诱导balb/c小鼠肠炎，将此组合物(质量比sirna：egcg：pll＝1:5:5，sinc：egcg：pll＝1:5:5)从肛门给药，在小鼠肠道处递送phd2sirna，观察小鼠肠炎疾病的发展。8天后，评估小鼠炎症表现(体重变化，粪便情况，肠道出血情况)并打分。然后提取组织rna，通过rt-pcr检测phd2和tnf-αmrna水平，评估此组合物在小鼠肠炎中的治疗效果。正常鼠，磷酸缓冲液(pbs)和sinc为对照组。

实验结果：

如图13所示，在小鼠体内，此组合物也可以有效的敲除小鼠肠道处phd2基因，并且下调炎症相关因子tnf-α的表达，抑制炎症的发展。实验结果表明，此组合物可以通过基因沉默调控炎症相关基因的表达，从而有效控制病情发展。

实施例13本实施例使用不同阳离子聚合物在hela-luci细胞中敲除萤光素酶基因的效率。

将天然多酚ta和萤光素酶luciferasesirna(siluc)在室温下形成复合物，然后加入不同阳离子分子(质量比sirna：ta：pll＝1:2:5，sirna：ta：lpei＝1:2:5，sirna：ta：pamam＝1:1:10)，孵育之后在hela-luci细胞中进行转染，通过检测萤光素酶的表达量来评估复合物的基因转染效率。

实验结果：

如图14所示为不同阳离子聚合物在此组合物中敲除萤光素酶基因的效率，结果表明，不同的阳离子分子均能有效敲除基因达40-55％。

实施例14本实施例涉及一种组合物(儿茶素)在hela-luci细胞中敲除萤光素酶基因的效率。

将天然多酚儿茶素和萤光素酶luciferasesirna(siluc)在室温下形成复合物，然后加入不同阳离子分子(质量比sirna：儿茶素：lpei＝1:10:10)，孵育之后在hela-luci细胞中进行转染，通过检测萤光素酶的表达量来评估复合物的基因转染效率。

实验结果：

如图15所示为在此组合物中敲除萤光素酶基因的效率，结果表明，不同的阳离子分子均能有效敲除基因达52％。

实施例15天然多酚egcg在hela-luci细胞上的细胞毒性

研究本发明中所述天然多酚egcg的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育hela-luci细胞，细胞密度为10⁴细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含与转染浓度相同的sirna与一定量egcg的新鲜培养基。其中egcg浓度从低到高(包括转染浓度)，最终浓度远高于转染浓度，培养24小时。通过mtt法检测细胞毒性。

实验结果：

如图16所示天然多酚egcg对hela-luci细胞的毒性。图16表明，天然多酚egcg在远高于转染剂量的条件下，仍然具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，表现出较低的细胞毒性。

实施例16天然多酚egcg与lpei在hela-luci细胞上的细胞毒性

研究本发明中所述天然多酚egcg和阳离子聚合物lpei的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育hela-luci细胞，细胞密度为10⁴细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含与转染浓度相同的sirna，lpei与一定量egcg的新鲜培养基。其中egcg浓度从低到高(包括转染浓度)，最终浓度远高于转染浓度，培养24小时。通过mtt法检测细胞毒性。

实验结果：

如图17所示天然多酚egcg和lpei对hela-luci细胞的毒性。图17表明，在阳离子聚合物存在的情况下，天然多酚egcg远高于转染浓度的剂量，仍然具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，表现出较低的细胞毒性。

实施例17天然多酚egcg与bpei在hela-luci细胞上的细胞毒性

研究本发明中所述天然多酚egcg和阳离子聚合物bpei的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育hela-luci细胞，细胞密度为10⁴细胞/孔，培养12小时候将培养基移出，加入100微升含与转染浓度相同的sirna，bpei与一定量egcg的新鲜培养基。其中egcg浓度从低到高(包括转染浓度)，最终浓度远高于转染浓度，培养24小时。通过mtt法检测细胞毒性。

实验结果：

如图18所示天然多酚egcg和bpei对hela-luci细胞的毒性。图18表明，在阳离子聚合物存在的情况下，天然多酚egcg远高于转染浓度的剂量，仍然具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，表现出较低的细胞毒性。

实施例18天然多酚egcg与pll在hela-luci细胞上的细胞毒性

研究本发明中所述天然多酚egcg和阳离子聚合物pll的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育hela-luci细胞，细胞密度为10⁴细胞/孔，培养12小时后将培养基移出，加入100微升含与转染浓度相同的sirna，pll与一定量egcg的新鲜培养基。其中egcg浓度从低到高(包括转染浓度)，最终浓度远高于转染浓度，培养24小时。通过mtt法检测细胞毒性。

实验结果：

如图19所示天然多酚egcg和pll对hela-luci细胞的毒性。图19表明，在阳离子聚合物存在的情况下，天然多酚egcg远高于转染浓度的剂量，仍然具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，表现出较低的细胞毒性。

实施例19天然多酚egcg与pamamg1在hela-luci细胞上的细胞毒性

研究本发明中所述天然多酚egcg和阳离子聚合物pamamg1的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育hela-luci细胞，细胞密度为10⁴细胞/孔，培养12小时后将培养基移出，加入100微升含与转染浓度相同的sirna，pamamg1与一定量egcg的新鲜培养基。其中egcg浓度从低到高(包括转染浓度)，最终浓度远高于转染浓度，培养24小时。通过mtt法检测细胞毒性。

实验结果：

如图20所示天然多酚egcg和pamamg1对hela-luci细胞的毒性。图20表明，在阳离子聚合物存在的情况下，天然多酚egcg远高于转染浓度的剂量，仍然具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，表现出较低的细胞毒性。

实施例20天然多酚egcg与pamamg2在hela-luci细胞上的细胞毒性

研究本发明中所述天然多酚egcg和阳离子聚合物pamamg2的细胞毒性，具体实验方法是：在96孔板中孵育hela-luci细胞，细胞密度为10⁴细胞/孔，培养12小时后将培养基移出，加入100微升含与转染浓度相同的sirna，pamamg2与一定量egcg的新鲜培养基。其中egcg浓度从低到高(包括转染浓度)，最终浓度远高于转染浓度，培养24小时。通过mtt法检测细胞毒性。

实验结果：

如图21所示天然多酚egcg和pamamg2对hela-luci细胞的毒性。图21表明，在阳离子聚合物存在的情况下，天然多酚egcg远高于转染浓度的剂量，仍然具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90％以上，表现出较低的细胞毒性。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。