用于抗肿瘤药物载体的石墨烯基纳米材料及制备方法与流程

本发明涉及一种功能化氧化石墨烯，对人星型胶质细胞无明显毒性，将抗肿瘤药物与石墨烯基纳米材料复合对人胶质瘤细胞呈现较强的促凋亡作用。概括地讲，本发明是制备普朗克pf127修饰的氧化石墨烯与抗肿瘤药物盐酸阿霉素均匀溶液，获得一种潜在的新型抗肿瘤治疗药物。

背景技术：

神经胶质瘤是人脑重大疾病，属于中枢神经系统最常见的原发性肿瘤，具有浸润性生长、高度弥散、发展快等特点，手术难以完全切除，目前主要的治疗方式是手术结合放疗、化疗，除了少部分低级别胶质瘤可以治愈外，大部分胶质瘤患者接受多种综合治疗后仍易复发，预后不良。虽然近些年来手术和放化疗技术已经取得非常显著的进展，但是恶性胶质瘤患者的预后仍无很大改善，因此，寻找有效且特异的治疗模式，具有重要的临床意义。盐酸阿霉素是一种广泛应用的蒽环类抗肿瘤药物，对多种肿瘤细胞具有杀灭作用，主要作用机制为直接嵌入dna，既抑制dna，也抑制rna合成，但是药物不能通过血脑屏障(bbb)，常规的总体治疗效果差；而且阿霉素本身具有强烈的细胞毒性，因此通过其它载体合成用药，不仅能够降低阿霉素的副作用，还可以有效提高药物疗效。

石墨烯及衍生物具有独特的结构、物理化学性质及生物学性质，近年来在生物医学工程领域受到关注，包括材料的抗微生物活性及药物载体。经过国内外科研工作者近十几年的探索研究，已成为了一种具有良好生物学性质的生物医用材料。石墨烯衍生物氧化石墨烯(go)的二维平面结构使其具有超大的比表面积，芳香环平面使其具有芳香族化合物的能力，二维平面上的含氧亲水基团，拥有良好的水溶性和化学可调性，能在溶液状态下实现与其它物质分子包括药物分子实现键合，从而制备性能优异的复合材料，是一种理想及有效的药物纳米载体。虽然go能够在水溶液中保持较好的稳定性，但是在生理溶液中如pbs、生理盐水以及细胞培养基中容易团聚。设计合理的功能化氧化石墨烯，以增加其兼容性和稳定性，从而提高go的生物相容性和应用范围。研究表明，功能化的go载药有望实现靶向、穿越bbb缓释和高载药率的效果。未来用功能化的go载药治疗胶质瘤，可减少给药次数及计量，增加患者的依从性，改善药物耐受。

普朗克f127是一种双亲性物质，广泛应用于载药体系，但是经pf127修饰go并进行载药研究的不多。采用本发明提出的石墨烯基纳米材料及制备方法得到的pf127-go-dox具有低毒、促肿瘤细胞凋亡的作用，制备方法简单、可重复性强，适于后续进一步研究探寻胶质瘤治疗的新方法、开发新型抗肿瘤药物。

技术实现要素：

本发明在于制备经pf127功能化处理的氧化石墨烯(go)纳米颗粒担载dox药物体系，同时提供一种制备上述go基复合材料的方法。担载dox的go纳米颗粒对人源性胶质瘤细胞u251呈现促凋亡作用。

用于抗肿瘤药物载体的石墨烯基纳米材料制备，具体步骤如下：

1)采用改进hummers方法制备氧化石墨，再利用超声、搅拌或离心方法将氧化石墨剥离成氧化石墨烯(go)；

2)取步骤1)中一定量的go加入去离子水溶解，再加入一定量的一氯乙酸后超声分散；

3)将步骤2)中的分散液进行高速离心，然后移除上清液，再用去离子水清洗，得到一定浓度的go悬浮液；

4)步骤3)中的go悬浮液加入去离子水，再加入一定量的pf127溶液，偶联后，将混合液的ph值将至6-7；

5)将步骤4)中的混合液和一定浓度的盐酸阿霉素(dox)混合，加入去离子水后，避光搅拌，获得载药的go基混合液；

6)将步骤5)中的混合液高速离心，获得上清液即为分散均匀的pf127-go-dox混合溶液。

本发明中，步骤1)中的氧化石墨制备，为合成五种氧化石墨，即：go-s(无预氧化，石墨：高锰酸钾＝1:3)、go-1(预氧化，石墨：高锰酸钾＝1:3)、go-2(预氧化，石墨：高锰酸钾＝1:4)、go-3(预氧化，持续超声，石墨：高锰酸钾＝1:3)、go-4(预氧化，持续超声，石墨：高锰酸钾＝1:4)；预氧化采用的是浓硫酸、过硫酸钾、五氧化二磷。

本发明中，步骤1)中的超声功率为80w，超声时间为每次170分钟，两次超声之间搅拌10-30分钟，共计时间为18小时；离心转速为5000rpm。

本发明中，步骤2)中的go量为20-80mg，去离子水为10-100ml，一氯乙酸为2-8g，超声功率80w，超声时间3小时。

本发明中，步骤3)中的离心转速为10000rpm，go悬浮液的浓度范围为0.2-2mg/ml。

本发明中，步骤4)中的go悬浮液为5-20ml，去离子水为20-60ml，pf127为40-120ml。

本发明中，步骤5)中的dox的浓度范围为0.5-5mg/ml，dox和go的质量比为1:1-10:1，去离子水的加入量为8ml，搅拌时间为12-24小时。

本发明中，步骤6)中的离心转速为12000rpm，离心时间为60-90分钟。

综上所述，用于抗肿瘤药物载体的石墨烯基纳米材料及制备方法，其特征在于，结合x-射线衍射仪、傅立叶变换红外光谱仪、原子力显微镜、紫外分光光度计测试发现，功能化的氧化石墨烯纳米片横向尺寸小于200nm，厚度小于2nm，药物成功担载在氧化石墨烯纳米片上，复合物在细胞培养液中不发生大面积的聚集；cck-8法结合倒置荧光显微镜体外检测实验表明，复合溶液具有较强的抗人神经胶质瘤u251细胞作用。

附图说明：

图1是实施实例中五种氧化石墨烯(go)纳米片的x-射线衍射图。

图2是实施实例中go纳米片的傅立叶变换红外光谱图。

图3是实施实例中go纳米片的原子力显微镜图像。

图4是实施实例中盐酸阿霉素(dox)、go、pf127-go、pf127-go-dox复合材料的紫外吸收光谱图。

图5是实施实例中dox的浓度-吸光度标准曲线。

图6是实施实例中pf127-go-dox复合材料在u251中分布的荧光显微镜图像：a.为fitc；b.为dox；c.为hocehst33342标记的细胞核；d.为abc三图的融合图。

图7.1是实施实例中dox、pf127-go(pg)、pf127-go-dox(pgd)作用于u251，24小时后细胞存活率柱状图。

图7.2是实施实例中dox、pf127-go(pg)、pf127-go-dox(pgd)作用于u251，48小时后细胞存活率柱状图。

图7.3是实施实例中dox、pf127-go(pg)、pf127-go-dox(pgd)作用于u251，72小时后细胞存活率柱状图。

图8是实施实例中dox、pf127-go(pg)、pf127-go-dox(pgd)作用于u251后细胞的荧光显微镜图像。

具体实施方式：

实施实例：

制备用于抗肿瘤药物载体的石墨烯基纳米材料的实验条件及参数如下：

1)将浓硫酸(25ml)、过硫酸钾(4g)、五氧化二磷(4g)搅拌溶解后，加入4g石墨，恒温反应6小时，加入去离子水(800ml)，静置12小时；移除上清液，将沉淀用去离子水洗涤至接近中性，完成石墨的预氧化；

2)在锥形瓶中加入浓硫酸(50ml)、硝酸钠(1g)、预氧化的石墨(1g)，搅拌均匀后，加入高锰酸钾(4g)，在超声波清洗机中，升温至60℃，功率为80w，每超声170分钟后搅拌10分钟，共计用时18小时；然后在室温下，先后分别加入双氧水、30wt％盐酸、去离子水、乙醇清洗至接近中性；最后将上述溶液经80w功率、2小时超声处理分散后，用5000rpm转速下离心收集上清液，并将上清液放入透析袋中充分透析后干燥。

3)取50g上述样品，溶于30ml去离子水中，经560w、2小时超声分散处理；再加入5g一氯乙酸，搅拌，然后经80w、3小时超声处理；再用10000rpm转速离心，移除上清液，并加入去离子水制备氧化石墨烯悬浮液(0.25mg/ml)。

4)取10ml上述氧化石墨烯悬浮液，加入30ml去离子水和80ml的pf127溶液，充分混合，得到接近中性的混合液。

5)将2mg/ml的盐酸阿霉素与上述混合溶液以1:1的质量比配置成2ml的混合液，加入8ml去离子水后，避光搅拌24小时；经12000rpm转速离心60分钟，获取上清液。根据上述发明所举的方法，可以制备出抗肿瘤药物载体的石墨烯基纳米材料，其特征如下：

1)对所制备的样品进行x-线衍射(xrd)分析，结合对比标准衍射峰pdf卡片，可以看到，石墨原料在2θ为26.5°的位置有一个明显且尖锐的衍射峰，这是石墨晶体(002)特征峰，说明石墨原料的结晶度很好；石墨氧化后，样品中的“石墨相”已经消失，取而代之的是在衍射角为10°～12°的范围内，出现了宽化的氧化石墨衍射峰。这是因为在氧化过程中，石墨中的碳原子嵌入了含氧官能团，形成了层间化合物，层间距沿着c轴方向增大，有序性降低。含氧官能团的出现会使石墨的亲水性大大增强，而且水分子与层间官能团之间以氢键的形式结合，进一步增大氧化石墨的层间距。

2)对所制备的样品进行傅里叶变换红外光谱(ftir)分析。结果表明，红外光谱中，去羧基处理前后，3428cm^-1处oh^-的特征吸收峰基本未变，1725cm^-1处的峰消失，这说明氧化石墨烯片层边缘的羧基、羰基中的c＝o得到了还原；羧基处理后，1625cm^-1的c＝c峰消失，在1600cm^-1左右出现了一个新吸收峰；相应的，在1060cm^-1和1400cm^-1左右的峰强增加，说明氧化石墨烯中的羟基含量增加；1230cm^-1处羧基中c-o的峰强减弱，说明去羧基化效果明显。

3)对所制备的样品进行原子力显微镜(afm)观测样品的表面形貌特征。结果表明，氧化石墨烯片已经粉碎成300nm以下的小片，厚度小于2nm。

4)对所制备的样品进行紫外-可见分光光度计检测样品的载药情况。从图中可以看出，dox在233nm和480nm波长处有明显的吸收峰；go样品的吸收峰位于230nm；pf127-go则无明显的吸收峰。pf127-go-dox的紫外吸收光谱结合了dox和pf127-go两者的特征，因此可以判断出，dox成功装载到了功能化的氧化石墨烯纳米粒子上。

5)对所制备的样品经紫外-可见光分光光度计检测，绘制dox在480nm波长处的浓度-吸光度曲线。结果显示，dox标准曲线线性相关。根据下式(1)可计算出载药量和包封率(公式2)：

其中ф表示负载到go上的dox的量，ee表示包封率，mdox为初始加入的dox的量，mdoxˊ表示离心后上清液中的dox的含量，mgo表示加入的go量。计算结果pf127-go-dox的载药量为0.83mg/ml，包封率为83％。

6)采用荧光显微镜检测pf127-go-dox作用于u251细胞后的分布情况，荧光分子标记物为fitc。结果显示，载药的氧化石墨烯纳米颗粒能够进入细胞中。

7)采用cck-8法检测细胞存活率。结果显示，pf127-go对u251细胞无明显毒性，dox与载药后的pf127-go对人神经胶质瘤细胞有明显的毒性作用，而且毒性大小与dox药物浓度和作用时间存在对应规律。

8)采用倒置相差显微镜观察细胞形态。如图所示，pf127-go组与对照组相比，细胞形态与数量无明显差异，增加培养时间，细胞数量增多；pf127-go-dox与dox组相比，无明显差异，与对照组相比，随着时间的增加，细胞数量下降，说明载药后的氧化石墨烯纳米颗粒对胶质瘤细胞u251有较明显的抑制作用。

其它说明：本发明统计分析软件是spss19.0(以均数±标准差表示)。采用t检验对比两组数据，采用单因素方差分析对比多组数据，p<0.05为显著性差异，具有统计学意义。