let-7c/let-7d在宫腔粘连和/或薄型内膜诊断及治疗中的应用的制作方法

本发明属于生物制药领域，涉及let-7c/let-7d在宫腔粘连和/或薄型内膜诊断及治疗中的应用。

背景技术：

子宫内膜再生性障碍疾病主要包括宫腔粘连和薄型内膜。宫腔粘连是由于子宫内膜基底层损伤，功能层再生修复障碍，形成以内膜纤维化为特征的子宫壁间粘连，是子宫性不孕症最常见的原因，在不孕症患者中占比高达25-30％。在我国，随着宫腔手术特别是无痛人流数量的上升，宫腔粘连及子宫内膜纤维化的发生率明显增高。目前主要治疗方式是手术分离粘连，并放置宫内节育器或球囊或生物材料阻隔子宫前后壁，预防再粘连。但是，这些治疗方式对重度宫腔粘连的疗效不佳，再粘连的发生率仍高达62.5％，且即使不再粘连，内膜纤维化仍然是胚胎着床的严重障碍。而薄型内膜是指病人在使用大剂量雌激素刺激后内膜厚度仍无明显提高，这种内膜被称为薄型内膜。目前对于薄型内膜厚度的定义尚未达成广泛共识(一般认为<7mm)。发明人在研究工作中发现，有很大比例的薄型内膜患者也是由于宫腔手术所致，并且存在一定程度的子宫内膜纤维化。由于发病机制不清，阻碍了宫腔粘连和薄型内膜的有效治疗。因此，亟待寻找有效的预测及治疗宫腔粘连和薄型内膜的方法。

我们通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)方法分析了正常人、宫腔粘连及薄型内膜患者子宫内膜中let-7家族成员(let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7g)水平的改变。结果显示，在子宫内膜中，let-7c及let-7d表达水平比其它家族成员丰度更高。更重要的是，与正常人相比，let-7c和let-7d在宫腔粘连患者中显著降低。

let7是在秀丽隐杆线虫中最早发现的mirnas之一，在进化上高度保守。let7家族存在多种亚型，人类存在let7a、b、c、d、e、f、g、i、mir-98这9种亚型。let7家族在发育时序性及肿瘤抑制中发挥重要作用，但在干细胞的自我更新及多能性的维持中，let7似乎发挥着抑制作用。另外，一些研究显示let7在抗纤维化中发挥作用。例如在自发性肺纤维化中let7d具有逆转tgfβ介导的肺纤维化的作用。目前，let7在子宫内膜中的作用尚无报道。我们qrt-pcr分析发现let-7c/let-7d表达水平在宫腔粘连患者中显著降低。let-7c/let-7d低表达后，原代子宫内膜上皮细胞表达α-sma增多，表明其发生纤维化改变。另外，let-7c/let-7d干预子宫内膜纤维化小鼠模型结果显示，let-7c/let-7d治疗组可显著减少子宫内膜纤维化水平。这些结果表明let-7c/let-7d可能是治疗宫腔粘连和/或薄型内膜的靶分子。

技术实现要素：

本发明的目的是提供let-7c/let-7d在制备治疗宫腔粘连和/或薄型内膜的药物中的应用。

本发明的另一目的是提供llet-7c/let-7d在制备宫腔粘连和/或薄型内膜诊断试剂中的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

let-7c/let-7d或提高let-7c/let-7d表达量的物质在制备治疗与子宫内膜纤维化相关的疾病的药物中的应用。

所述的与子宫内膜纤维化相关的疾病优选宫腔粘连、薄型内膜或由宫腔粘连/薄型内膜引起的疾病。

所述的宫腔粘连引起的疾病优选指由宫腔粘连和/或薄型内膜导致的子宫性不孕、反复流产及胎盘粘连、植入。

临床上治疗宫腔粘连和/或薄型内膜主要策略就是减少粘连，抑制其再粘连。而粘连的本质就是纤维化。因此，抑制纤维化的过程就是治疗宫腔粘连、薄型内膜或由宫腔粘连/薄型内膜引起的疾病的过程。

let-7c/let-7d作为检测靶点在制备宫腔粘连和/或薄型内膜诊断试剂中的应用。

检测let-7c/let-7d的试剂在制备宫腔粘连和/或薄型内膜诊断及分型试剂中的应用。

所述的检测let-7c/let-7d的试剂优选包括：用于检测let-7c/let-7d的pcr及qpcr引物、taqman探针、地高辛或荧光染料标记探针、mirna表达谱芯片、深度测序。

本发明中所述的宫腔粘连指由于子宫内膜基底层损伤，功能层再生修复障碍，形成以内膜纤维化为特征的子宫壁间粘连。

本发明中所述的薄型内膜是指子宫内膜厚度不能在雌激素刺激下明显提高，一般指内膜厚度<7mm。

本发明中的let-7c/let-7d表示let-7c或let-7d。

有益效果：

我们发现，宫腔粘连患者子宫内膜中let-7c/let-7d表达显著降低，且let-7c/let-7d减少后会引起子宫内膜上皮细胞纤维化，而补充let-7c/let-7d可缓解小鼠子宫内膜纤维化程度,只有解决纤维化才会让子宫内膜细胞恢复正常生长，增加腺体数量及内膜厚度。因此，let-7c/let-7d在宫腔粘连及薄型内膜治疗、诊断和分型方面可能发挥重要作用，可以用于制备宫腔粘连诊断、分型、治疗或者制备治疗其他与子宫纤维化相关的疾病的药物。

附图说明

图1、qrt-pcr分析正常人及宫腔粘连患者子宫内膜组织中let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7g的表达情况。

图2、let-7c/let-7d减少后，子宫内膜上皮细胞纤维化标志的改变。

图3、let-7c/let-7d干预子宫内膜纤维化小鼠模型后，子宫内膜纤维化改变。

具体实施方式

实施例1let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f和let-7g在正常及重度宫腔粘连患者子宫内膜组织中的表达

1、材料，试剂，设备

1.1人子宫内膜组织来源

收集11例正常子宫内膜组织以及11例宫腔粘连综合征重度患者子宫内膜组织，获取子宫内膜组织时，通过超声检测卵泡大小，确保内膜组织获取阶段全部统一为增殖晚期阶段。所有参与者均签署了纸质版的知情同意书，并经过南京鼓楼医院伦理委员会批准。

1.2主要试剂

trizol(invitrogen)、逆转录酶(takara)、qpcr酶(roche)，let-7家族成员逆转录及qpcr引物。

1.3主要仪器

qpcr仪(roche)、pcr仪(abi)

1.4主要方法

rna提取及实时荧光定量pcr

采用trizol法提取总rna。取1ugrna，用let-7家族成员特定反转录引物，反转录得到目标mirna，用两倍体积的rnase-free水稀释后，sybrgreen方法进行荧光定量pcr检测，每个样品3个复孔。不同目标基因的表达量采用u6作为内参标准的δδct值做统计。

2、结果

let-7c在子宫内膜组织中表达丰度最高，其次为let-7d；重度宫腔粘连患者子宫内膜组织中，let-7c、let-7d及let-7e表达均显著减少(图1)。

实施例2let-7c/let-7d减少后，子宫内膜上皮细胞纤维化标志的改变。

1、材料，试剂，设备

1.1主要试剂

胶原酶(sigma)、透明质酸酶(sigma)、dnaase(roche)、上皮细胞培养基(gibco)、血清(gibco)、trizol(invitrogen)、逆转录酶(takara)、qpcr酶(roche)、let-7c/7dinhibitor(锐博生物，广州)。

1.2主要仪器

细胞培养箱、摇床、qpcr仪(roche)、pcr仪(abi)

1.3主要方法

1.3.1原代子宫内膜上皮细胞分离培养

将内膜组织放置在新的60mm培养皿中，剪碎组织至无肉眼可见块状，加入配置好的消化液，吹打混匀，37℃培养箱中放置5min；取出培养皿，镜下观察组织消化情况；加入dna酶，浓度为4mg/ml，继续消化5mim；吹打消化后的组织，将组织悬液滴加到40μm筛子里。筛子里剩余的组织转移至干净的35mm培养皿中，加入蛋白酶和胶原酶的混合液2ml，充分混匀后放入37℃培养箱中5min；镜下观察消化后的组织腺体是否已分散成单个腺体，然后加入上皮细胞培养液终止消化，将腺体置于培养皿培养。

1.3.2rna提取及实时荧光定量pcr

采用trizol法提取总rna。取1ugrna反转录后得到cdna，用两倍体积的rnase-free水稀释后，sybrgreen方法进行荧光定量pcr检测，每个样品3个复孔。不同目标基因的表达量采用gapdh作为内参标准的δδct值做统计。

2、结果

分别转染let-7cinhibitor或let-7dinhibitor(用来沉默let-7c/let-7d表达)至子宫内膜上皮细胞48h后，let-7c/let-7d表达水平显著下降，而纤维化的有效分子标志物α-sma基因表达显著升高，表明let-7c/let-7d表达下调后促进细胞纤维化。

实施例3let-7c/let-7d干预子宫内膜纤维化小鼠模型后，子宫内膜纤维化改变。

1、材料，试剂，设备

1.1主要试剂

he染色液(solarbio)、masson染色液(thermo)、angomirlet-7c/let-7d及angomircontrol(广州锐博)。

1.2主要仪器

组织包埋机、切片机

1.3主要方法

1.3.1小鼠子宫内膜纤维化模型制作

选取8-10周的balb/c雌鼠，体重约20g，处于动情期。腹腔注射4％水合氯醛0.2ml麻醉小鼠，医用胶布黏住四肢固定。手术剪剪开腹部，于子宫上段伸进自制搔刮器，来回搔刮单侧子宫全长约2min，致子宫内膜表面粗糙；胰岛素针宫腔内注射20μl2.5mg/mllps，两端用镊子夹闭5min，生理盐水冲洗腹腔，5号线缝肌层、4号线缝皮，术后肌肉注射(大腿)青霉素2万u/d，连续3d。每3天宫腔注射对照mirna或angomirlet-7c以及angomirlet-7d，术后第4个动情周期麻醉后收集子宫组织。

1.3.2he染色及masson染色

子宫组织固定，石蜡包埋后，切片。进行he染色及masson染色。

2、结果

与正常组小鼠相比，损伤及注射mirna对照组的小鼠子宫内膜组织结构异常，纤维化形成，而angomirlet-7c/let-7d治疗组的小鼠内膜纤维化程度显著降低(masson染色减少)。