一种激活潜伏HIV病毒的组合物及其应用的制作方法

本发明涉及医药领域，具体涉及一种激活hiv潜伏病毒的组合物及其应用。

背景技术：

艾滋病是一种重大威胁人类生命安全的传染病，目前尚无有效疫苗且现有药物不能彻底治愈。随着hiv研究的不断深入，研究发现目前hiv不能治愈的主要障碍是hiv在感染极早期就在机体内建立起隐秘的病毒“储藏库”(latentreservoir)，以清除病毒储藏库为出发点的新型艾滋病治疗策略-“激活再杀灭”“(shockandkill)正逐渐成为hiv研究的热点，并为治愈hiv带来了希望，称为hiv/aids治疗的第二次革命。同时，不可忽视的现实是，随着hiv感染的进程，作为体内主要的能直接杀伤hiv感染细胞和分泌细胞因子抑制hiv复制的效应细胞，细胞毒性t细胞(ctl)出现数量减少和功能缺陷。甚至连ctl激活依赖的树突状细胞(dc)也出现类似的功能损伤，而且这些缺陷即使经过cart治疗也无法恢复。这预示着通过抗逆转录病毒治疗重建的机体免疫系统将不能有效的清除那些被激活的细胞，必需要通过联合增强机体hiv特异性免疫应答的方法来增强对hiv储藏库的清除效果。因此，对hiv潜伏性病毒“储藏库”的形成及激活策略和以重建机体免疫功能的治疗性疫苗的探索都是迈向治愈hiv时代极有价值的研究方向。

在病人接受联合高效抗逆转录病毒治疗(haart)时，潜伏的hiv病毒储藏库能在体内长期稳定存在并缓慢更新，半衰期大约为6个月。一旦停药，体内的病毒储藏库细胞则快速释放艾滋病病毒。hiv形成潜伏的机制主要有：1)组蛋白去乙酰化，形成异染色质，使hivdna更紧地缠绕在组蛋白上，不利于转录而维持hiv的潜伏状态；2)组蛋白甲基化可促进或抑制hiv转录；3)dna甲基化，进一步招募组蛋白去乙酰化酶(hdacs)，不利于转录。此外还有转录干扰﹑起始抑制和延长抑制等。

hiv形成潜伏机制的多样性决定了激活的多样性，首先是细胞激活水平，细胞激活促进异质二聚体p50/rela进入细胞核而启动细胞基因转录，而nf-κb也是hiv最重要的转录因子。研究表明，无论是hiv潜伏感染细胞模型还是从hiv感染病人体内分离到的潜伏感染细胞同样在体外细胞激活后能产生具有感染性的病毒。另外，临床研究中对于激活潜伏hiv时，是否需要细胞水平激活及其细胞毒性的认知上则存在较大争议。一些临床研究表明不同程度的细胞激活有助于激活并清除潜伏的hiv，但会产生明显的细胞毒副作用。最新研究证明，双特异性抗体vrc07-a-rhesuscd3，在猕猴能有效激活并清除潜伏感染的cd4+t细胞，在停止cart后病毒没有反弹，并未出现毒副作用。分析认为不同的试验结果可能在于激活方案和剂量等因素不同。其次是在染色质水平，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(hdaci)可以打开染色质，使潜伏的hiv前病毒更易于被转录。伏立诺他(saha)主要抑制一类hdac的抑制剂，是目前激活hiv潜伏储藏库的首选药物。体外实验证明单剂saha可使静息cd4+t细胞中的hivrna的转录增强4.8倍，然而对saha激活hiv潜伏感染的临床价值也存在争议。有研究发现saha的临床剂量仅能激活0.079％静息cd4+t细胞中的hiv前病毒，尚不能达到充分激活hiv储藏库的目的。这些提示我们需要发现更强有效的药物或联合其他方法以更有效的激活病毒储藏库。第三，hiv病毒特异性的转录因子水平，多种转录因子如nf-κb﹑激活t细胞核因子(nfat)刺激蛋白1(sp1)等对调节hiv转录非常重要，而nf-κb是hiv复制过程中最重要的转录因子。蛋白激酶c(pkc)是nf-κb关键调节因子，pkc激活剂激活pkc途径减少iκbα，致使转录因子释放并穿透进入胞核与hivltr结合启动转录。prostratin和bryostatin1是pkc激活剂，体外实验表明能明显增加潜伏hiv转录和表达，而且后者效果优于前者，但目前尚未看到有关动物体内实验或临床研究的相关报道。

技术实现要素：

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种能激活hiv潜伏病毒的组合物，该组合物能同时从细胞水平、染色质水平和hiv病毒特异性的转录因子水平激活hiv潜伏病毒，能够充分激活静息cd4+t细胞中的hiv前病毒，且不会产生明显的细胞毒副作用。

本发明的另一目的是提供一种能激活hiv潜伏病毒的组合物应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种激活hiv潜伏病毒的组合物，该组合物由单克隆抗体药物、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和pkc激活剂组成。

进一步地，所述单克隆抗体药物、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和pkc激活剂的摩尔比为：(10^-5～10^-4):(1～10):(0.05～0.01)。该组合物中，考滤到激活效果和细胞毒性，单克隆抗体药物、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和pkc激活剂均要求在一个合理的范围内。

进一步地，所述单克隆抗体药物、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和pkc激活剂的摩尔比为：6×10^-5:5:0.05。

进一步地，所述单克隆抗体药物选自抗人cd3单克隆抗体和抗人cd28单克隆抗体。

进一步地，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂选自伏立诺他和丙戊酸中的至少一种。

进一步地，所述pkc激活剂为12-脱氧佛波醇-13-乙酸。

本发明还提供了上述任一项所述的一种激活hiv潜伏病毒的组合物的应用，所述组合物应用于激活潜伏的hiv感染的cd4+t细胞。

进一步地，所述组合物应用于制备激活潜伏的hiv感染的cd4+t细胞的药物。具体而言，本发明的组合物在激活静息cd4+t细胞中的hiv前病毒表达后，潜伏病毒被激活。同时结合高效抗逆转录病毒疗法及在人免疫系统作用下，来杀死激活的潜伏感染的细胞，以此加速病毒库的清除，最终达到体内hiv的清除。

进一步地，所述药物中单克隆抗体药物、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和pkc激活剂的摩尔比为：(10^-5～10^-4):(1～10):(0.05～0.01)。

进一步地，所述药物中单克隆抗体药物、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和pkc激活剂的摩尔比为：6x10^-5:5:0.05。

本发明的有益效果在于：

1.该组合物的设计考虑同时从细胞水平、染色质水平和hiv病毒特异性的转录因子水平激活hiv潜伏病毒，研究结果显示，该病毒能够充分激活静息cd4+t细胞中的hiv前病毒，具有高的诱导激活作用，且效果持续时间长。

2.本发明的组合物用于激活潜伏的hiv感染的cd4+t细胞时，与同类阳性药物相比，不会产生明显的细胞毒副作用。

3、本发明的组合物可应用于制备激活潜伏的hiv感染的cd4+t细胞的药物，钙药物与多种抗hiv药物联合使用将为hiv潜伏感染病毒激活和最终清除提供了新的途径和手段。

附图说明

图1为实施例1中ecohiv潜伏病毒激活策略示意图。

图2为实施例2中用到的ecohiv嵌合病毒的结构示意图。

图3为实施例3中建立多种品系小鼠的hiv感染动物模型。

图4为实施例4中ecohiv病毒在小鼠体内建立系统性感染结果示意图。

图5为实施例5中ecohiv在小鼠cd4+t中建立潜伏性的感染示意图，其中图5a为ecohiv病毒整合dna和vifrna表达水平，图5b为病毒蛋白的表达水平。

图6为实施例6中ecohiv感染小鼠的病毒“储藏库”的体外激活结果示意图。

图7为实施例7中ecohiv感染小鼠体内病毒“储藏库”激活结果示意图。

具体实施方式

下面申请人结合具体实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为本发明请求保护范围的限定。

实施例1本发明中ecohiv潜伏病毒激活示意图

从t细胞激活水平﹑染色质结构改变和hiv特异性的转录因子激活等多角度，联合多种潜伏感染激活剂(latency-reversingagents,lras)协同激活病毒转录和蛋白表达。腹腔注射低剂量αcd3/αcd28或α-ctla4促进适度t细胞激活并结合hdaci(saha或vpa)和蛋白激酶c激活剂(prostratin)，或无t细胞激活条件下，仅以hdaci和蛋白激酶激活剂激活潜伏病毒ecohiv，从动物机体水平﹑细胞水平和分子测试最佳激活剂组合﹑剂量和最大的激活效率。

实施例2本发明构建嵌合型hiv结构示意图

目前针对潜伏性hiv病毒的“激活再杀灭”的研究中，大多数研究采用hiv-1体外建立的潜伏感染原代细胞和细胞系模型，具有生理相关性不高，不能很完全地复制静息cd4+t细胞在体内的状态，更重要的是缺乏免疫系统的交互作用。同时，采用猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyvirus，siv)感染非人灵长类动物或hiv-1感染人源化小鼠建立的潜伏感染模型虽提供了有价值的信息，但因受到动物来源稀少、价格昂贵、操作复杂等因素影响，难以大规模开展应用。本发明中将nl4-3毒株中的gp120囊膜蛋白替换为鼠白血病病毒的囊膜蛋白gp70,并以此为骨架分别将绿色荧光蛋白和荧光素酶基因置于内部核糖体进入位点之后，前期验证了插入egfp和荧光素酶(luc)基因的重组病毒的功能，病毒感染后，分离细胞可以通过染色后流式细胞仪分析定量感染细胞，同时也可以应用活体动物成像定量和定位病毒在体内的复制，评估潜伏性病毒的激活的激活效率。

实施例3建立多种品系小鼠的hiv感染动物模型

将实施例2中构建的质粒转化stbl3菌，挑取单克隆接种lb培养基，提取质粒用于293t细胞转染。病毒包装步骤如下：

1)取两个均装有16mldmem培养液的离心管，向其中一管加入300μgpei，另一管加入100μg预混的载体质粒，漩涡震荡,室温平衡10分钟。

2)取一个10ml的移液管将混有pei的培养基吹起来，将混有质粒的培养基一滴一滴地加入pei中，室温温育30分钟。

3)取一个t175瓶，向其中加入3ml胎牛血清，将和pei混合的载体质粒加入其中，然后将多层细胞培养瓶中的培养基倒入到t175瓶，上下左右颠倒与质粒混匀，最后将t175瓶中的培养基倒回到多层细胞培养瓶中。37℃，5％co2培养箱培养3天，收获上清。收集的上清4000rpm(3000g)，30min离心去除293t细胞碎片。

4)将慢病毒液上清用0.22μm滤膜过滤后，分装到250ml的离心瓶中，于4℃，30000g离心2.5小时，离心后将离心瓶小心转移至生物安全柜，用真空泵去上清，留沉淀，加入t细胞培养基500μl/离心瓶，用枪将沉淀吹散混匀，即得到ecohiv的嵌合病毒，立即使用或分装后于-80℃保存。

5)利用p24elisakit定量病毒，并以1-5μg/mouse的剂量尾静脉注射。感染后一周后，在小鼠脾脏细胞中检测到病毒dna和rna表达。

实施例4ecohiv病毒在小鼠体内建立系统性感染

取实施例3中的ecohiv感染一周后小鼠，分别收集多个组织，研磨后提取组织中的dna和rna，利用实时荧光定量pcr的方法定量，结果表明，ecohiv能够有效感染小鼠体内多个器官和组织，并建立起整合感染，主要靶细胞为淋巴细胞和巨噬细胞，与hiv在人体内感染的靶细胞基本相同，为潜伏病毒的激活奠定了基础。

实施例5ecohiv在小鼠cd4+t中建立潜伏性的感染

本实施例以两步法分选小鼠静息期cd4+t细胞，分别为：(1)从脾脏单细胞悬浮液中分选cd4+t细胞；(2)从cd4+t细胞中再分选静息期cd4+t细胞。具体步骤如下：

(1)脾脏单细胞悬浮液的制备：将小鼠脾脏用磨砂玻璃载玻片研磨，将其滤过尼龙细胞过滤器制成单细胞悬浮液。

(2)cd4+t细胞富集：cd4+t淋巴细胞通过阴性富集试剂盒富集。

(3)静息期cd4+t细胞分选：使用抗鼠cd69，抗鼠cd25和抗鼠mhcii类(i-a)抗体去除活化细胞，进而从上一步总cd4+t细胞中阴性选择分离静息cd4+t淋巴细胞。

(4)分别提取获得的细胞总dna和rna,应用qpcr技术检测ecohiv病毒整合dna和vifrna表达水平(图5a)。

(5)流式细胞仪分析第一步获得的细胞悬液，检测病毒蛋白水平的表达(图5b)。

hiv在感染极早期就在机体内建立起隐秘的病毒“储藏库”，即静息的cd4+t淋巴细胞，在病人接受联合高效抗逆转录病毒药物时，该细胞表达极低甚至不表达病毒蛋白，所以很难被自身免疫系统识别来彻底清除。在停止服药后，这些隐藏的病毒又会很快从细胞中释放出来，这种潜伏病毒已经成为横亘在艾滋病根治问题上的巨大障碍。ecohiv感染的小鼠静息记忆cd4+t淋巴细胞也能作为潜伏的病毒“储藏库”。分别表明在静息记忆cd4+t细胞中存在高水平的整合前病毒的前提下，分别未检测到hivmrna和蛋白的表达，证明病毒是潜伏性的。

实施例6ecohiv感染小鼠的病毒“储藏库”的体外激活

以实施例5中ecohiv感染动物体内分离的静息记忆cd4+t细胞为研究对象，使用抗cd3/cd28抗体按图6所示组合对静息cd4+t细胞刺激2天。随后按图6所示药物组合对细胞刺激，为期两天，药物所用浓度如下：5μm5-氮杂胞苷、1μm丙戊酸、1μm伏立诺他、1μmprostratin和100ng/mltnf-α。图6中结果表明，特别是经prostratin和saha共处理能显著增强病毒vif和tatrna转录活性上百倍。说明单一激活剂对ecohiv潜伏病毒的激活是有限的，只有多种激活剂联用才能达到有效激活。

实施例7ecohiv感染小鼠的病毒“储藏库”的体内激活

静脉注射ecohiv感染129x1/svj雄性小鼠，感染后第25天开始激活，激活剂包括抗cd3/cd28抗体、丙戊酸(vpa)、伏立诺他(saha)、pkc激活剂prostratin。所述药物中单克隆抗体药物、组蛋白去乙酰化酶抑制剂和pkc激活剂的摩尔比为：6x10^-5：5:0.05(cd3/28抗体剂量为3μg,丙戊酸1.2mg/伏立诺他1mg,12-脱氧佛波醇-13-乙酸20μg)。激活结束后收集动物组织，提取总rna并进行逆转录，利用qpcr的方法定量gagrna的表达，同时，测定荧光强度用以评判荧光素酶基因的表达水平，从而从蛋白水平评价激活剂的激活效果。结果(如图7所示)与实施例6体外激活结果高度一致，同样说明单一激活剂对hiv潜伏病毒的激活是有限的，只有多种激活剂联用才能达到有效激活。这为指导临床hiv的功能性治愈提供了理论基础。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。