一种肿瘤疫苗及其制备方法与流程

本发明涉及一种疫苗及其制备方法，尤其涉及一种肿瘤疫苗及其制备方法。

背景技术：

树突状细胞是免疫系统中的专职抗原递呈细胞，在免疫细胞的启动、活化、效应和稳态维持等阶段均发挥重要作用。自树突状细胞被发现以来，其在抗肿瘤领域的应用就成为肿瘤免疫的热点。树突状细胞肿瘤疫苗借助树突状细胞强大的免疫激活能力，对受体的免疫系统发挥肿瘤抗原特异性/非特异性激活效应，逆转癌前或肿瘤中形成的抑制性免疫微环境，介导对癌前突变细胞或者肿瘤细胞的免疫杀伤和清除。

2011年，provenge作为第一个被fda批准的树突状细胞肿瘤疫苗上市应用于前列腺癌治疗，揭开了近年来肿瘤免疫治疗飞速发展的新篇章。但后续治疗过程发现，provenge抗肿瘤效果极其有限，其他的树突状细胞瘤苗，在临床实验中，多停留在临床i/ii期，极少数能够进入临床iii期，最终也因疗效不佳而停滞。

cd44分子属于黏附分子，是一种广泛表达于细胞表面的i类跨膜单链糖蛋白；该分子呈现多态性，分子质量在80-200kb间变化；主要介导细胞间相互作用、细胞迁移和细胞黏附，并参与淋巴细胞的归巢和t淋巴细胞的活化与信号转导，促进t细胞、b细胞分化以及t细胞活化。

现有文献报道，cd44分子可以和透明质酸、胶原蛋白、层黏连蛋白和纤连蛋白结合。抗cd44的抗体能够抑制淋巴细胞与hev(戊型肝炎病毒)的相互作用，cd44多克隆抗血清亦可以抑制淋巴细胞与周围淋巴结、滑膜和粘膜淋巴组织的相互作用。但尚无将cd44分子应用在肿瘤免疫治疗领域的报道。

技术实现要素：

本发明提供一种肿瘤疫苗，包含阻断了cd44分子信号通路的树突状细胞，所述肿瘤疫苗具有良好的免疫激活和抗肿瘤作用，同时抗瘤谱广泛，并具有良好的使用安全性。

本发明还提供了所述的肿瘤疫苗在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明还提供了一种预防或治疗肿瘤用组合物，包含所述的肿瘤疫苗作为有效成分。该组合物同时具有预防和治疗肿瘤的作用。

本发明还提供了一种制备肿瘤疫苗的方法，实现了将阻断了cd44分子信号通路的树突状细胞作为疫苗实体制备肿瘤疫苗。

本发明提供的一种肿瘤疫苗，包含阻断了cd44分子信号通路的树突状细胞。

在本发明的方案中，阻断了cd44分子信号通路的树突状细胞(表示为cd44^-/-dc细胞)可以为以下的树突状细胞：1)所述树突状细胞表面上表达mhc-i类分子、mhc-ii类分子、cd40、cd80和cd86，但不表达cd44；2)所述树突状细胞表面上的cd44分子被抗体、配体封闭或被小分子抑制剂阻断。

进一步的，所述配体包括透明质酸、胶原蛋白、层黏连蛋白、纤连蛋白等；所述抗cd44分子的抗体可以商购获得。

在本发明的一个方案中，出于刺激t细胞的活化效率和强度以及增加树突状细胞总数量(因为本发明的树突状细胞疫苗在血液中的比例较小)从而延长回输后血中树突状细胞半衰期的考虑，本发明的所述肿瘤疫苗允许包含一定比例的cd44^+/+dc细胞，即没有阻断cd44分子信号通路的树突状细胞。

具体的，在本发明的方案中，所述肿瘤疫苗中阻断了cd44分子信号通路的树突状细胞占总树突状细胞的比例为30％以上，优选40％以上，更优选50％以上，最优选60％以上。

更进一步的，所述肿瘤疫苗中阻断了cd44分子信号通路的树突状细胞占总树突状细胞的比例为100％。

在本发明的方案中，所述树突状细胞源自哺乳动物。所述哺乳动物可以是健康动物和患癌动物。进一步的，所述哺乳动物为健康动物。更进一步的，所述哺乳动物可以是牛科动物、马科动物、猫科动物、犬科动物、兔科动物、猪科动物、骆驼科动物、啮齿类动物和灵长类动物中的一种或多种。更进一步的，所述哺乳动物可以是牛、马、犬、山羊、绵羊、猫、兔、猪、骆驼、羊驼、大鼠、小鼠、豚鼠、非人灵长类动物(诸如猿、猴、狒狒、猩猩)和人中的一种或多种。

本发明所述哺乳动物也可以是常见的宠物。进一步，所述宠物包括猫、龙猫、仓鼠、小白鼠、沙鼠、金花鼠、八齿鼠、松鼠、鼯鼠、大花鼠，兔、貂、刺猬、豚鼠、猪、狗和猴中的一种或多种。

本发明提供的肿瘤疫苗可以是任何适于临床应用的剂型和用药规格，例如，可以是注射剂。所述肿瘤疫苗的制备方法还包括按照常规的疫苗制备方法制成所需要的剂型，例如制成注射剂，可以是通过加入生理盐水制成注射针剂等。

本发明提供的肿瘤疫苗可以通过静脉注射、腹腔或皮下注射给药，对个体进行免疫以抑制肿瘤发生或进行治疗以杀伤肿瘤细胞。具体的，对于50kg体重人体的临床应用，所述肿瘤疫苗每次注射量可以为1×10⁶～1×10⁸个细胞，优选1～10×10⁷个细胞，所述细胞为阻断了cd44分子信号通路的树突状细胞。

本发明还提供了所述的肿瘤疫苗在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用。进一步的，所述肿瘤包括黑色素瘤、淋巴瘤、结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、食管癌、宫颈癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌和肾癌中的一种或多种。

本发明还提供了一种预防或治疗肿瘤用组合物，包含所述的肿瘤疫苗作为有效成分。进一步的，所述肿瘤包括黑色素瘤、淋巴瘤、结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、食管癌、宫颈癌、膀胱癌、卵巢癌、子宫内膜癌和肾癌中的一种或多种。

本发明的预防或治疗肿瘤用组合物包含本发明的肿瘤疫苗作为主要活性成分。进一步的，所述预防或治疗肿瘤用组合物中还可以含有其它具有治疗用途的生物分子(例如，蛋白质、核酸、抗体等)和/或化学药物(例如，化学合成药物)。

更进一步的，所述生物分子和/或化学药物的治疗用途与所述肿瘤疫苗的治疗用途可以相同，例如，均用于抗肿瘤。更进一步的，所述生物分子和/或化学药物的治疗用途与所述肿瘤疫苗的治疗用途也可以不同，例如，所述生物分子和/或化学药物可以发挥拮抗施用所述肿瘤疫苗后的不良反应或副作用，以及用于治疗其它肿瘤并发症或合并症(例如，发热、寒战、焦虑；腹水、恶心、呕吐、腹胀、腹泻、梗阻、心力衰竭、心律失常、干咳、咳嗽、呼吸困难、少尿、多尿、蛋白尿、血尿、疼痛、皮肤过敏、皮肤红斑、皮肤瘙痒等等)的作用。

当本发明的所述组合物为包含所述肿瘤疫苗与治疗用生物分子和/或化学药物的组合形式(所述组合形式可以是混合物的形式，也可以是分开独立包装的形式，在本发明中不受任何限制)时，则按重量计本发明的所述肿瘤疫苗占本发明的治疗用组合物的活性成分(即，肿瘤疫苗与治疗用生物分子和/或化学药物的总量)的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％以上，甚至100％，优选50％以上，更优选60％以上，最优选70％以上。

在一个优选实施方案中，本发明的所述组合物还可以包含药学上可接受或生理学可接受的药用辅料、载体、稳定剂、稀释剂、赋形剂、缓冲液、等渗剂和/或添加剂等。

在进一步优选的实施方案中，本发明的所述组合物还可以包含常规用于淋巴细胞低温保存的抗冻液(例如，zenoaq公司cellbanker系列细胞冻存液)，从而可以进行深低温(-80℃以下，例如，在液氮中)保存。

本发明还提供了一种制备所述肿瘤疫苗的方法，包括以下步骤：

1)由哺乳动物外周血或/脐带血获取单个核细胞，并将其诱导为成熟树突状细胞，或者由哺乳动物的骨髓获取骨髓造血前体细胞，并将其诱导为成熟树突状细胞；

2)阻断所述成熟树突状细胞的cd44分子信号通路；

3)收集阻断了cd44分子信号通路的树突状细胞。

进一步的，本发明中成熟树突状细胞优选源自本发明肿瘤疫苗要预防或治疗的对象，并按照本发明所记载方法由该成熟树突状细胞获得阻断了cd44信号通路的树突状细胞。更进一步的，所述成熟树突状细胞可以源自与本发明肿瘤疫苗要预防或治疗的对象半相合的个体(例如父母和子女)。更进一步的，所述成熟树突状细胞可以源自本发明肿瘤疫苗要预防或治疗的对象同种异体的个体(即同种不同基因型个体)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述成熟树突状细胞的cd44分子信号通路的阻断通过a)基因工程手段敲除所述成熟树突状细胞中cd44分子基因(例如crisper/cas9、talen、rna干扰等方法)，或者通过b)使用能与cd44分子结合的抗体、配体或小分子抑制剂实现。

更进一步的，通过基因工程手段将所述成熟树突状细胞中cd44分子基因敲除包括：将含敲除cd44分子基因的载体的病毒(也可以是腺病毒、慢病毒等常用载体)转染所述步骤1)获得的成熟树突状细胞，收集转入含敲除cd44基因的载体的成熟树突状细胞，即获得阻断了cd44分子信号通路的树突状细胞。

在本发明的一个具体实施方式中，可以将成熟树突状细胞与靶向敲除cd44基因的慢病毒以2:1-1:50数量比混合来实现对cd44基因的敲除。更进一步的，所述成熟树突状细胞与靶向敲除cd44基因的慢病毒数量比为1:10。本领域技术人员可以根据需要在上述范围选择所述成熟树突状细胞与靶向敲除cd44基因的慢病毒的比例，只要能够实现对cd44基因的敲除即可，这对于本领域技术人员来说是可以实现的。

进一步的，可以将含树突状细胞培养基(2×10⁶/ml)与抗小鼠cd44抗体(浓度0.5mg/ml)以1:10-1000的体积比混合来实现对cd44的封闭。更进一步的，所述含树突状细胞培养基与所述抗小鼠cd44抗体的体积比为1:100。本领域技术人员可以根据需要在上述范围调整抗小鼠cd44抗体的使用量，只要能够使得cd44封闭即可，这对于本领域技术人员来说是可以实现的。

在本发明的制备方法中，采集哺乳动物血液(例如外周血或脐带血)分离单个核细胞，例如，可以采用体外循环的方法或设备(例如，可以使用人单个核细胞分离机，循环500～6000ml外周血或脐带血，或注射器抽取外周血或脐带血10～500ml)。采集哺乳动物骨髓分离骨髓造血前体细胞的方法也不受特别的限制，可以采用本领域中公知的方法。

在本发明的制备方法中所采用的树突状细胞培养技术是本领域中所熟知的，可以采用本领域中常用的方法或设备来完成，在本发明中不受任何限制。只要是能够培养和诱导树突状细胞定向分化的技术均可以在本发明中使用。例如，对小鼠树突状细胞的培养多采用取骨髓造血前体细胞后体外培养的方法；而获取人树突状细胞多采用外周血或脐带血单个核细胞贴壁后取贴壁细胞体外培养的方法。上述方法在许多科学文献中均能找到，或按照相关试剂生产厂商的说明书或者推荐实验流程实施。本领域技术人员完全有能力获得这些具体实施方式或实验流程。

上述体外培养过程中，本发明的树突状细胞的培养条件不受特别的限制。对于培养基，可以采用常规用于淋巴细胞培养的培养基，如rpmi-1640培养基。对于培养条件，可以采用本领域中淋巴细胞培养的常用条件，例如温度37℃、co2浓度5v/v％，每3～5天更换一次培养基。对于本发明的所述肿瘤疫苗的体外诱导和制备，可以通过添加一些细胞因子，例如：gm-csf、il-2、il-4、il-5、ifn-γ和tnf-α等中的一种或多种来实现。

对于培养时间，本领域技术人员可以根据诱导中细胞的表型和形态具体确定，可以通过定期取样进行流式细胞术分析细胞的表型，从而获得想要的状态和功能的细胞。

在本发明的一个具体实施方式中，制备所述肿瘤疫苗的方法，包括：

1)将受试者的外周血或脐带血采集到抗凝试管中，通过密度梯度离心的方法去除红细胞；

2)从已去除红细胞的外周血或脐带血中分离单个核细胞，在完全培养基中，置于37℃、5v/v％co2环境下体外培养，采用贴壁法获得外周血或脐带血中单核细胞，并添加选自gm-csf、il-2、il-4、il-5、ifn-γ、tnf-α等的一种或多种定向诱导和活化树突状细胞的细胞因子；培养时间为3～14天，优选4～10天，更优选5～8天，期间定期取样通过流式细胞仪检测细胞，获得成熟树突状细胞；

3)对获取的成熟的树突状细胞的cd44信号通路进行阻断，包括通过基因工程手段敲除所述成熟树突状细胞中cd44分子基因(例如crisper/cas9、talen、rna干扰等手段)，或者通过使用能与cd44分子结合的抗体、配体或小分子抑制剂进行阻断；

4)收集阻断了cd44信号通路的树突状细胞。

本发明提供的方案具有以下优点：

(1)本发明提供的肿瘤疫苗，包含阻断了cd44分子信号通路的树突状细胞，能够激活受体小鼠体内的效应性免疫细胞，后者与抗肿瘤效应直接相关，可通过直接杀伤和改善抗肿瘤免疫微环境等多种方式提高受体小鼠的抗肿瘤免疫能力。

(2)本发明提供的肿瘤疫苗，抗瘤谱广泛、能对多种肿瘤细胞有效杀伤，并且对机体的毒副作用小，使用安全。

(3)本发明提供的肿瘤疫苗，可以作为治疗性疫苗也可以作为预防性疫苗，在不同的肿瘤治疗阶段使用，通过激活机体免疫系统，预防肿瘤的发生或对已有肿瘤细胞进行有效杀伤。

(4)将本发明的肿瘤疫苗制备成预防或治疗肿瘤用组合物，可以长期保存以备随时使用。

附图说明

图1a显示了没有敲除cd44基因的成熟树突状细胞的显微镜照片。图1b显示了没有敲除cd44基因的成熟树突状细胞的流式细胞仪检测结果(图1b中第一个峰为强度小于10³峰代表cd44的同型对照，第二个峰强度在10³到10⁴代表cd44)。图1c显示了敲除cd44基因的树突状细胞的显微镜照片。图1d显示了敲除cd44基因的树突状细胞的流式细胞仪检测结果(因cd44基因被敲除，图1d中仅有第一个峰即代表同型对照的小于10³的峰)。

图2a显示了结合抗小鼠cd44抗体的树突状细胞的显微镜照片。图2b显示了结合抗小鼠cd44抗体的树突状细胞的流式细胞仪检测结果(图2b中只有第一个峰即代表同型对照的小于10³的峰)。

图3显示了成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)和敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)的表型差异。其中-代表阴性，+代表低表达，++代表高表达。

图4a显示了成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)和敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)注射小鼠后产生细胞因子的差异。图4b显示了常规树突状细胞瘤苗(cd44^+/+dc)和本发明的所述肿瘤疫苗(cd44^-/-dc)注射小鼠后产生cd8t细胞的比例差异。图4c显示了常规树突状细胞瘤苗(cd44^+/+dc)和本发明的所述肿瘤疫苗(cd44^-/-dc)注射小鼠后产生cd8t细胞的数量的差异。

图5a显示了使用本申请肿瘤疫苗和常规树突状细胞瘤苗免疫的小鼠注射el4细胞后el4肿瘤大小的差异。图5b显示了使用本申请肿瘤疫苗和常规树突状细胞瘤苗免疫的小鼠注射b16-f10黑色素瘤细胞后黑色素瘤肺转移灶的差异。

图6a显示了使用本申请肿瘤疫苗和常规树突状细胞瘤苗治疗的荷el4肿瘤小鼠el4肿瘤大小的差异。图6b显示了使用本申请肿瘤疫苗和常规树突状细胞瘤苗治疗的荷b16-f10黑色素瘤小鼠黑色素瘤肺转移灶的差异。

图7a显示了荷mc38结肠癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7b显示了荷lewis肺癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7c显示了荷h22肝癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7d显示了荷mfc胃癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7e显示了荷4t1乳腺癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7f显示了荷renca肾癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7g显示了荷pan02胰腺癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7h显示了荷rm-1前列腺癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7i显示了荷akr食管癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7j显示了荷u14宫颈癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7k显示了荷mb49膀胱癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7l显示了荷id8卵巢癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。

图8显示了本申请肿瘤疫苗的安全性评价结果。

图9显示了本申请肿瘤疫苗的单次给药致瘤性评价结果。

图10显示了本申请肿瘤疫苗的多次给药致瘤性评价结果。

图11显示了本申请肿瘤疫苗的家兔血管刺激实验结果。

具体实施方式

除非另外定义，本文中使用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域中的一般技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文中所述的那些相似或等同的任何方法和材料可以用于实施或测试本发明，但是现在描述优选的方法和材料。本文中引用应用的全部出版公开物和专利申请通过引用整体结合于本文中。本文中没有任何内容可以被解释为承认本发明无权通过在先发明而使早于本公开内容的日期获得授权。

必须注意，用于本文中和所附权利要求中时，单数形式“一个”、“某个”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地规定。

“树突状细胞”：免疫细胞中的一类专职的抗原递呈细胞，因形状似树突而得名。该细胞功能为识别抗原并加工、处理抗原，借助其表面高表达的mhc-i类分子和mhc-ii类分子将抗原片段分别递呈给cd8t细胞和cd4t细胞，介导t细胞的活化和增殖。树突状细胞是免疫应答的中心环节，是连接先天性免疫和适应性免疫的桥梁。

“瘤苗”：瘤苗即肿瘤疫苗的简称，有广义和侠义两种定义。广义的肿瘤疫苗即预防性肿瘤疫苗和治疗性肿瘤疫苗的总称；侠义的肿瘤疫苗单指预防性肿瘤疫苗。在本发明中，如果未明确指明，当提及肿瘤疫苗时均指广义的肿瘤疫苗。

“cd44^+/+dc”：成熟树突状细胞(或没有阻断cd44分子信号通路的树突状细胞)。

“cd44^-/-dc”：敲除cd44基因的树突状细胞(或其他手段阻断了cd44信号通路的树突状细胞)。

以下实施例进一步描述本发明，但所述实施例仅用于说明本发明，但而不是要限制本发明的范围。当阅读说明书并参考公知常识时，其它实施方案对本领域技术人员来说将是显而易见的。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规试剂公司购买得到。

实施例1

本申请肿瘤疫苗的制备

1.实验材料和试剂

实验用c57bl/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，年龄6-8周，体重18g左右。

胎牛血清(fcs)：购自pan公司；

rpmi-1640培养基：购自pan公司；

gm-csf，il-4均购自美国peprotech公司；

2.实验步骤

(1)分离小鼠股骨骨髓造血前体细胞；

(2)将分离的小鼠骨髓造血前体细胞以2×10⁶/ml的密度培养于添加含50ng/mlgm-csf，50ng/mlil-4，10％胎牛血清(fcs)的rpmi-1640培养基中，温度37℃、co2浓度5v/v％，诱导7天，收集细胞沉淀，取样用生理盐水重悬后涂片，在显微镜下观察，结果如图1a所示；同时取样使用流式细胞仪检测，结果如图1b所示，纵坐标代表数量，横坐标代表荧光强度，第一个峰为小于10³峰代表同型对照，第二个峰强度在10³到10⁴峰代表cd44。

(3)将步骤(2)所获得的成熟树突状细胞沉淀，用pbs洗涤去除胎牛血清(fcs)，然后以2×10⁶/ml密度重悬于不含10％fcs的rpmi-1640培养基中获得含成熟树突状细胞的培养基，在其中加入靶向敲除cd44基因的慢病毒，控制成熟树突状细胞与靶向敲除cd44基因的慢病毒数量比为1:10，在37℃下，感染2h后，收集细胞沉淀，取样用生理盐水重悬后涂片，在显微镜下观察，结果如图1c所示；同时取样使用流式细胞仪检测，结果如图1d所示。

3、实验结果

图1a显示了没有敲除cd44基因的成熟树突状细胞的显微镜照片。图1b显示了没有敲除cd44基因的成熟树突状细胞的流式细胞仪检测结果，可以看出树突状细胞表面表达cd44分子。图1c显示了敲除cd44基因的树突状细胞的显微镜照片，可以看出与图1a具有相似的形态，即具有成熟的树突状细胞形态。图1d显示了敲除cd44基因的树突状细胞的流式细胞仪检测结果,可以看出该树突状细胞表面不表达cd44分子，说明转染成功，即获得敲除cd44基因的树突状细胞。

实施例2

本申请肿瘤疫苗的制备

1、实验材料和试剂

实验用c57bl/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，年龄6-8周，体重18g左右。

胎牛血清(fcs)：购自pan公司；

rpmi-1640培养基：购自pan公司；

gm-csf，il-4均购自美国peprotech公司；

抗小鼠cd44抗体购自美国biolegend公司，货号为156002。

2、实验步骤

(1)分离小鼠股骨骨髓造血前体细胞；

(2)将分离的小鼠骨髓造血前体细胞以2×10⁶/ml的密度培养于添加含50ng/mlgm-csf，50ng/mlil-4，10％fcs的rpmi-1640培养基中，温度37℃、co2浓度5v/v％，诱导7天，收集细胞沉淀，取样用生理盐水重悬后涂片，在显微镜下观察；同时取样使用流式细胞仪检测。

(3)将步骤(2)所获得的成熟树突状细胞沉淀，以2×10⁶/ml密度重悬于含10％fcs的rpmi-1640培养基中获得含树突状细胞培养液，将含树突状细胞培养基与抗小鼠cd44抗体(购买浓度0.5mg/ml)以1:1000的体积比混合，在4℃下孵育30分钟后，收集细胞沉淀，取样用生理盐水重悬后涂片，在显微镜下观察，结果如图2a所示；同时取样使用流式细胞仪检测，结果如图2b所示。

3、实验结果

图2a显示了结合抗小鼠cd44抗体的树突状细胞的显微镜照片，可以看出与图1a具有相似的形态，即具有成熟的树突状细胞形态。图2b显示了结合抗小鼠cd44抗体的树突状细胞的流式细胞仪检测结果,可以看出，该树突状细胞表面的cd44分子被抗小鼠cd44抗体封闭，获得阻断了cd44信号通路的树突状细胞。

实施例3：

本申请肿瘤疫苗(即敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc))与常规树突状细胞瘤苗(即成熟树突状细胞(cd44^+/+dc))激活受体免疫系统的能力比较。

1、实验材料和试剂

实验用c57bl/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，年龄6-8周，体重18g左右。

检测血清中细胞因子采用biolegend公司细胞因子检测试剂盒(货号740005)。

抗小鼠h2k^b,ia^b,cd40,cd80,cd86,cd44的荧光抗体均购自美国biolegend公司，货号分别为h2k^b(114605),ia^b(116410),cd40(124607),cd80(104705),cd86(105005),cd44(156002)。

标记小鼠外周血cd8细胞采用抗体为biolegend公司pe标记的抗cd8抗体(antimousecd8a抗体，货号100708)。标记后的样本应用bd公司facsariaii流式细胞仪进行检测。

2、实验过程

按照实施例1的方法获得成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)和敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)(用生理盐水重悬后，即获得常规树突状细胞瘤苗和本发明所述肿瘤疫苗)，将其分为两组，进行以下实验。

本发明所述肿瘤疫苗的注射量以阻断了cd44分子信号通路的树突状细胞的数量计，所述常规树突状细胞瘤苗的注射量以没有阻断cd44分子信号通路的树突状细胞的数量计，以下实施例中注射量均与此相同。

2.1h2k^b,ia^b,cd40,cd80,cd86,cd44分子的检测

将第一组成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)和第一组敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)，分别标记抗小鼠h2k^b,ia^b,cd40,cd80,cd86,cd44的荧光抗体，应用流式细胞仪检测两组树突状细胞表面荧光抗体标记情况，结果如图3所示。

2.2细胞因子il-2,ifn-γ，tnf-α的检测，以及cd8t细胞的数量和比例的检测

将第二组成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)和第二组敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)进行以下试验：

第1天，实验组1(cd44^+/+dc)：对c57bl/6小鼠以2×10⁶/只的量注射成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)；实验组2(cd44^-/-dc)：对c57bl/6小鼠以2×10⁶/只的量注射敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)。对照组(pbs)：对c57bl/6小鼠注射与实验组等体积的生理盐水。

第8天，取实验组与对照组小鼠外周血血清，借助多因子检测试剂盒(biolegend公司legendplex^tmmousethcytokinepanel(13-plex)试剂盒，货号740005)检测细胞因子il-2,ifn-γ，tnf-α，结果如图4a所示。

在取上述实验组与对照组小鼠外周血血清的同时采集小鼠外周血单个核细胞(pbmc)，并标记抗cd8抗体，使用流式细胞仪检测cd8t细胞的数量和比例，结果如图4b-图4c所示。

3、实验结果

图3显示了成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)和敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)的表型差异。从图3可以看出，小鼠来源的敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)与成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)均高表达mhc-i类分子(h2k^b)、mhc-ii类分子(ia^b)、cd40、cd80和cd86，不表达cd44分子。树突状细胞活化标志cd40、cd80和cd86的表达表明，本发明的敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)为活化的树突状细胞，具有树突状细胞激活免疫应答的能力。

图4a显示了成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)和敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)注射小鼠后产生细胞因子的差异。可以看出，本发明的所述肿瘤疫苗(cd44^-/-dc)免疫小鼠能够激活受体免疫系统，产生较常规树突状细胞瘤苗(cd44^+/+dc)显著性增多的促炎性细胞因子il-2，ifn-γ和tnf-α。

图4b显示了常规树突状细胞瘤苗(cd44^+/+dc)和本发明的所述肿瘤疫苗(cd44^-/-dc)注射小鼠后产生cd8t细胞的比例差异。图4c显示了常规树突状细胞瘤苗(cd44^+/+dc)和本发明的所述肿瘤疫苗(cd44^-/-dc)注射小鼠后产生cd8t细胞的数量的差异。可以看出，本发明的所述肿瘤疫苗免疫小鼠能够产生较常规树突状细胞瘤苗更多的效应性cd8t细胞，能介导更有效的抗肿瘤效应。

综上，本发明的所述肿瘤疫苗能够产生更多的抗肿瘤相关细胞因子和效应细胞，说明其具有更强的抗肿瘤效果。

实施例4

本申请肿瘤疫苗具有预防肿瘤的效果

1、实验材料和试剂

小鼠黑色素瘤细胞系b16(c57bl/6遗传背景)、小鼠淋巴瘤细胞系el4(c57bl/6遗传背景)均为美国atcc来源，实验用c57bl/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，年龄6-8周，体重18g左右。

2、实验步骤

(1)按照实施例1描述的方法制备成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)和敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)，分别使用生理盐水重悬后，即获得常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗。

第1天，实验组1(cd44^+/+dc)：对c57bl/6小鼠以2×10⁶/只的量注射成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)；实验组2(cd44^-/-dc)：对c57bl/6小鼠以2×10⁶/只的量注射敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)；第8天再次以相同剂量注射。对照组(pbs)：对c57bl/6小鼠分别在第1天，和第8天注射与实验组等量的生理盐水。

(2)第11天，将上述免疫后的实验组1-2的小鼠分别分为两组，一组尾静脉注射b16-f10黑色素瘤细胞2×10⁵；另一组皮下注射el4细胞2×10⁶。将上述免疫后的对照组的小鼠分为两组，一组尾静脉注射b16-f10黑色素瘤细胞2×10⁵；另一组皮下注射el4细胞2×10⁶。

(3)对于注射el4细胞的实验组1-2和对照组小鼠，于第32天测量el4肿瘤大小，显示为长径(mm)乘以短径(mm)的数值(mm²)，结果如图5a所示；

(4)对于注射b16-f10黑色素瘤细胞的实验组1-2和对照组小鼠，于第32天时处死小鼠，分离肺组织，计数各组肉眼可见的黑色素瘤肺转移灶，结果图5b所示。

3、实验结果

图5a显示了使用本申请肿瘤疫苗和常规树突状细胞瘤苗免疫的小鼠注射el4细胞后el4肿瘤大小的差异，可以看出，使用本申请肿瘤疫苗免疫的小鼠el4肿瘤的大小显著小于使用常规树突状细胞瘤苗免疫的小鼠。

图5b显示了使用本申请肿瘤疫苗和常规树突状细胞瘤苗免疫的小鼠注射b16-f10黑色素瘤细胞后黑色素瘤肺转移灶的差异，可以看出，使用本申请肿瘤疫苗免疫的小鼠el4肿瘤的肺转移灶几乎没有，使用常规树突状细胞瘤苗免疫的小鼠肺转移灶相比于注射生理盐水的对照组没有显著差异。

综上，本申请肿瘤疫苗能够提供显著优于常规树突状细胞瘤苗的抗肿瘤免疫保护作用。

实施例5

本申请肿瘤疫苗具有治疗肿瘤的效果

1、实验材料和试剂

小鼠黑色素瘤细胞系b16(c57bl/6遗传背景)、小鼠淋巴瘤细胞系el4(c57bl/6遗传背景)均为美国atcc来源，实验用c57bl/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，年龄6-8周，体重18g左右。

2、实验步骤

(1)按照实施例1描述的方法制备成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)和敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)，分别使用生理盐水重悬后，即获得常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗。

(2)第0天，将小鼠分为两组，一组尾静脉注射b16-f10黑色素瘤细胞2×10⁵；另一组皮下注射el4细胞2×10⁶。

(3)第1天，将荷b16-f10黑色素瘤小鼠分为实验组和对照组，实验组1(cd44^+/+dc)：对荷b16-f10黑色素瘤小鼠以2×10⁶/只的量注射成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)；实验组2(cd44^-/-dc)：对荷b16-f10黑色素瘤小鼠以2×10⁶/只的量注射敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)；第8天，再次以相同剂量注射。对照组(pbs)：分别在第1天，和第8天注射与实验组等量的生理盐水。

第1天，将荷el4肿瘤小鼠分为实验组和对照组，实验组1(cd44^+/+dc)：对荷el4肿瘤小鼠以2×10⁶/只的量注射成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)；实验组2(cd44^-/-dc)：对荷el4肿瘤小鼠以2×10⁶/只的量注射敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)；第8天，再次以相同剂量注射。对照组(pbs)：分别在第1天，和第8天注射与实验组等量的生理盐水。

(3)在第21天，对于荷el4肿瘤小鼠，测量el4肿瘤大小，显示为长径(mm)乘以短径(mm)的数值(mm²)，结果图6a所示；

(4)对于荷b16-f10黑色素瘤小鼠，在第21天时处死，分离肺组织，计数各组肉眼可见的黑色素瘤转移灶，结果图6b所示。

3、实验结果

图6a显示了使用本申请肿瘤疫苗和常规树突状细胞瘤苗治疗的荷el4肿瘤小鼠el4肿瘤大小的差异，可以看出，使用本申请肿瘤疫苗治疗的小鼠el4肿瘤的大小显著小于使用常规树突状细胞瘤苗治疗的小鼠，肿瘤生长显著被抑制。

图6b显示了使用本申请肿瘤疫苗和常规树突状细胞瘤苗治疗的荷b16-f10黑色素瘤小鼠黑色素瘤肺转移灶的差异，可以看出，使用本申请肿瘤疫苗治疗的小鼠的黑色素瘤肺转移灶相比于使用常规树突状细胞瘤苗治疗的小鼠显著减少。

综上，本申请肿瘤疫苗能够提供显著优于常规树突状细胞瘤苗的治疗肿瘤效果。

实施例6

本申请肿瘤疫苗对黑色素瘤、淋巴瘤外的其它肿瘤类型同样有效

1.实验材料和试剂

小鼠结肠癌细胞系mc38(c57bl/6遗传背景)、小鼠肺癌细胞系lewis(c57bl/6遗传背景)、小鼠肝癌细胞系h22(c57bl/6遗传背景)、小鼠胃癌细胞系mfc(c57bl/6遗传背景)、小鼠乳腺癌细胞系4t1(balb/c遗传背景)、小鼠肾癌细胞系renca(balb/c遗传背景)、小鼠胰腺癌细胞系pan02(c57bl/6遗传背景)、小鼠前列腺癌细胞系rm-1(c57bl/6遗传背景)、小鼠食管癌细胞系akr(c57bl/6遗传背景)、小鼠宫颈癌细胞系u14(c57bl/6遗传背景)、小鼠膀胱癌细胞系mb49(c57bl/6遗传背景)、小鼠卵巢癌细胞系id8(c57bl/6遗传背景)均为美国atcc来源，实验用c57bl/6小鼠和balb/c小鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，年龄6-8周，体重18g左右。

2.实验步骤

(1)按照实施例1描述的方法，制备c57bl/6小鼠、balb/c小鼠和人的成熟树突状细胞(cd44^+/+dc细胞)和敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc细胞)，分别使用生理盐水重悬后，即获得常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗；

(2)第0天：

15只受体c57bl/6小鼠皮下注射mc38结肠癌细胞系5×10⁵；

15只受体c57bl/6小鼠皮下注射lewis肺癌细胞系2×10⁵；

15只受体c57bl/6小鼠皮下注射h22肝癌细胞系1×10⁶；

15只受体c57bl/6小鼠皮下注射mfc胃癌细胞系1×10⁶；

15只受体balb/c小鼠皮下注射4t1乳腺癌细胞系5×10⁵；

15只受体balb/c小鼠皮下注射renca肾癌细胞系1×10⁶；

15只受体c57bl/6小鼠皮下注射pan02胰腺癌细胞系1×10⁶；

15只受体c57bl/6小鼠皮下注射rm-1前列腺癌细胞系2×10⁵；

15只受体c57bl/6小鼠皮下注射akr食管癌细胞系1×10⁶；

15只受体c57bl/6小鼠皮下注射u14宫颈癌细胞系1×10⁶；

15只受体c57bl/6小鼠皮下注射mb49膀胱癌细胞系5×10⁵；

15只受体c57bl/6小鼠皮下注射id8卵巢癌细胞系2×10⁵；

(3)以荷mc38结肠癌小鼠为例说明实验过程,其它荷瘤小鼠的实验过程与之相同。

第1天：将荷mc38结肠癌小鼠分为实验组和对照组，实验组1(cd44^+/+dc)：对荷mc38结肠癌小鼠以2×10⁶/只的量注射成熟树突状细胞(cd44^+/+dc)；实验组2(cd44^-/-dc)：对荷mc38结肠癌小鼠以2×10⁶/只的量注射敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc)。第8天，再次以相同剂量注射。对照组(pbs)：分别在第1天，和第8天注射与实验组等量的生理盐水。

第21天，测量肿瘤大小，显示为长径(mm)乘以短径(mm)的数值(mm²)。

3、实验结果

图7a-图7l显示了各荷瘤小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7a显示了荷mc38结肠癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7b显示了荷lewis肺癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7c显示了荷h22肝癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7d显示了荷mfc胃癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7e显示了荷4t1乳腺癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7f显示了荷renca肾癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7g显示了荷pan02胰腺癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7h显示了荷rm-1前列腺癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7i显示了荷akr食管癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7j显示了荷u14宫颈癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7k显示了荷mb49膀胱癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。图7l显示了荷id8卵巢癌细胞小鼠分别经常规树突状细胞瘤苗和本申请肿瘤疫苗治疗后肿瘤大小的差异。

可以看出，相比于施用常规树突状细胞瘤苗，施用本申请肿瘤疫苗，各种荷癌小鼠的皮下肿瘤生长均被显著抑制，肿瘤大小显著减小，说明本发明的所述肿瘤疫苗具有广谱治疗肿瘤的效果。

实施例7

本申请肿瘤疫苗的安全性评价

1、实验材料和试剂

实验用c57bl/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，年龄6-8周，体重18g左右。

2、实验步骤

(1)按照步骤1的方法制备敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc细胞)，使用生理盐水重悬后，即获得本申请肿瘤疫苗；

(2)将c57bl/6小鼠分为实验组和对照组，实验组1，注射常规剂量的本申请肿瘤疫苗(2×10⁶/只)；实验组2，注射常规剂量20倍剂量的本申请肿瘤疫苗(4×10⁷/只)；对照组：注射与实验组等量的pbs。

(3)注射后30天内，持续观察小鼠是否死亡、毛色是否顺滑、体重是否下降以及活动能力是否异常，结果如图8所示。

3、试验结果

图8显示了本申请肿瘤疫苗的安全性评价结果，可以看出，即使按照常规剂量20倍注射，c57bl/6小鼠未出现死亡，毛色、体重、活动能力等各项指标均正常，表明本申请肿瘤疫苗具有良好的使用安全性。

实施例8

本申请肿瘤疫苗的单次给药致瘤性评价

1、实验材料和试剂

实验用裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，年龄6-8周，体重18g左右。

2、实验步骤

(1)按照步骤1的方法制备敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc细胞)，使用生理盐水重悬后，即获得本申请肿瘤疫苗；

(2)将裸鼠分为实验组和对照组，实验组1，注射常规剂量的本申请肿瘤疫苗(2×10⁶/只)；实验组2，注射常规剂量20倍剂量的本申请肿瘤疫苗(4×10⁷/只)；对照组：注射与实验组等量的pbs。

(3)注射后90天内，持续观察小鼠是否出现肿瘤，是否出现死亡，结果如图9所示。

3、实验结果

图9显示了本申请肿瘤疫苗的单次给药致瘤性评价结果，可以看出，各组裸鼠均未出现肿瘤或死亡，表明本申请肿瘤疫苗在观察周期内无单次给药致瘤性。

实施例9

本申请肿瘤疫苗的多次给药致瘤性评价

1、实验材料和试剂

实验用裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，年龄6-8周，体重18g左右。

2、实验步骤

(1)按照步骤1的方法制备敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc细胞)，使用生理盐水重悬后，即获得本申请肿瘤疫苗；

(2)将裸鼠分为实验组和对照组，实验组1，注射常规剂量的本申请肿瘤疫苗(2×10⁶/只)；实验组2，注射常规剂量20倍剂量的本申请肿瘤疫苗(4×10⁷/只)；对照组：注射与实验组等量的pbs。

(3)对实验组和对照组小鼠，每周1次，连续给药4周，共给药5次，恢复期4周。注射后90天内，持续观察小鼠是否出现肿瘤，是否出现死亡，结果如图10所示。

3、实验结果

图10显示了本申请肿瘤疫苗的多次给药致瘤性评价结果，可以看出，各组裸鼠均未出现肿瘤或死亡，表明本申请肿瘤疫苗在观察周期内多次给药均没有致瘤性。

实施例10

本申请肿瘤疫苗的局部刺激实验

1、实验材料和试剂

实验用家兔，年龄6-8周，体重1000-2000g左右；生理盐水，注射用水，

2、实验步骤

按照实施例1的方法制备敲除cd44基因的树突状细胞(cd44^-/-dc细胞)，使用生理盐水重悬到2×10⁶/ml后，获得本申请肿瘤疫苗。

家兔股四头肌法：将一定量的供试品注射家兔股四头肌内，在规定时间内，部开肌肉观察供试品对局部肌肉剌激反应的情况，以判断供试品的局部剌激试验是否符合规定。

试验方法：取健康无伤、体重在2.0kg以上的家兔(雌雄均匀)2只，分别在后左、右两腿四头肌内各注入供试品(本申请肿瘤疫苗或者pbs生理盐水)1ml，48小时后处死动物，取出股四头肌，纵向剖开，观察局部剌激反应。并按下表记录相应的剌激强度，然后算出4块股四头肌反应级的总和。如各股四头反应的最高与最低级之差大于2时，应另取2只家兔复试，方法同上。

剌激强度与剌激反应对照表

剌激强度剌激反应的情况

0级无明显变化

1级轻度充血：范围在0.5×1.0cm以下

2级中度充血：范围在0.5×1.0cm以上

3级重度充血：伴有肌肉变色

4级出现坏死：有褪色变性

5级出现广泛性坏死

结果判断

在初试或复试的2只家兔4块股四头肌剌激强度的反应级之和在10以下认为样品的局部剌激试验符合规定。

3、实验结果

图11显示了本申请肿瘤疫苗的局部刺激实验评价结果，可以看出，各实验组均未出现明显变化，局部刺激为阴性。

虽然已经举例说明和描述了本发明的具体实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明实质和范围的情况下可以做出多种其他改变和变型。因此，在随附的权利要求书中包括属于本发明范围内的所有这些改变和变型。