重组枯草芽孢杆菌在预防或治疗猪肺炎支原体感染中的应用的制作方法

本发明属于生物技术基因工程领域，具体涉及重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1和b.s-p46在预防或治疗猪肺炎支原体感染中的应用。

背景技术：

猪支原体肺炎又称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，广泛存在于世界各地。可以感染各年龄段猪，猪只感染后可以导致饲料转化率降低、生长发育不良，从而继发其他病毒或细菌(猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪链球菌、副猪嗜血杆菌等)感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重。

目前，通过疫苗进行免疫是预防本病最重要的手段。市场上关于猪肺炎支原体疫苗，主要是国外的猪支原体肺炎灭活疫苗和国内的猪支原体肺炎弱毒活疫苗，对猪支原体肺炎的预防控制都取得了一定的成绩，但是各自存在一些问题。其中，灭活疫苗免疫效果差，容易造成生物安全污染；而弱毒活疫苗免疫效果好，但培养困难，成本高，存在毒力返强的风险。此外，大部分猪支原体肺炎疫苗是通过肺内注射途径免疫，该途径给仔猪造成较大的应激反应。因此，为了预防猪支原体肺炎的发生，急需研发一种方便安全的新型疫苗。

猪肺炎支原体主要从呼吸道入侵并主要感染呼吸系统，通过喷鼻免疫可直接切断病原的入侵，阻止疾病的发生。而在猪肺炎支原体入侵过程中，p97蛋白具有重要作用，其c端的r1区不仅与细菌的黏附有关，还具有一定免疫原性。此外，其表面膜蛋白p46可以引起早期免疫反应，也是猪肺炎支原体的主要免疫优势蛋白。因此，p97r1，p46蛋白常作为候选免疫原蛋白制备新型疫苗。

枯草芽孢杆菌是一类获得gras安全认可的益生菌，其作为工程菌具备很多的优势，如枯草芽孢杆菌遗传操作系统成熟，具有很强的蛋白质分泌功能；没有明显的密码子偏好性，同时表达产物不易形成包涵体等。近年来应用枯草芽孢杆菌表达抗原取得较大进展。此外，枯草芽孢杆菌是一种需氧菌，其能在鼻腔中繁殖，以枯草芽孢杆菌作为抗原递送载体，可充分提高其局部黏膜免疫效果。

另外，目前市场上还没有预防猪肺炎支原体感染的喷鼻疫苗。

技术实现要素：

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1和重组枯草芽孢杆菌b.s-p46在用于制备预防或治疗哺乳动物呼吸道疾病方面的应用。本发明所述的呼吸道疾病主要是针对猪肺炎支原体。

本发明提供了重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1和重组枯草芽孢杆菌b.s-p46在用于制备预防或治疗猪肺炎支原体感染药物中的应用。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种治疗哺乳动物呼吸道疾病的制剂。

本发明还要解决的技术问题是提供了一种预防或治疗哺乳动物呼吸道疾病的喷鼻剂。

本发明最后要解决的技术问题是提供了一种预防哺乳动物肺炎支原体的喷鼻疫苗。

本发明在已研究的猪肺炎支原体主要免疫原蛋白基础上，采用基因工程技术，制备表达猪肺炎支原体免疫原蛋白p97r1、p46的重组枯草芽孢杆菌，经动物试验获得较好的免疫保护效果。该重组枯草芽孢杆菌耐逆性强，易于运输，应用方便，为我国预防猪气喘病提供一种简便而有效的工程疫苗。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：本发明提供了重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1和重组枯草芽孢杆菌b.s-p46在用于制备预防或治疗猪肺炎支原体感染药物中的应用。

其中，所述重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1以p97r1-f2和p97r1-r2为引物，以p97r1基因为模板，扩增带同源臂的p97r1基因，并通过同源重组方法将目的基因p97r1连接至分泌型枯草芽孢杆菌pp43nmk载体中，成功构建分泌表达质粒pp43nmk-p97r1，然后电转化获得重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1。

其中，所述重组枯草芽孢杆菌b.s-p46以p46-f4和p46-r4为引物，以p46基因为模板，扩增带同源臂的p46基因，并通过同源重组方法将目的基因p46连接至分泌型枯草芽孢杆菌pp43nmk载体中，成功构建分泌表达质粒pp43nmk-p46，然后电转化获得重组枯草芽孢杆菌b.s-p46。

其中，所述p97r1-f2和p97r1-r2序列如下：

p97r1-f2：5’-tgtaacacatgcctcagctgcagcattacctcagccgccagc-3，

p97r1-r2：5’-ccatgattacgccaagcttaagccattgggaaatagtcttcttttgg-3’。

其中，所述p46-f4和p46-r4序列如下：

p46-f4：5’-tgtaacacatgcctcagctgcagaaatgaaakkaatgcttagaaaaaaatttttgtattcatcagc-3’，

p46-r4：5’-ccatgattacgccaagcttttaggcatcaggattatcaacattagcttttgtaaca-3’。

本发明内容还包括一种治疗哺乳动物呼吸道疾病的制剂，所述制剂包括重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1和b.s-p46。

其中，所述制剂为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、乳剂、混悬剂、注射剂、喷雾剂、滴剂、贴剂或软膏剂中的一种。

本发明内容还包括一种预防或治疗哺乳动物呼吸道疾病的喷鼻剂，所述喷鼻剂包括重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1和b.s-p46。

本发明内容还包括一种预防哺乳动物肺炎支原体的喷鼻疫苗，所述喷鼻疫苗包括重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1和b.s-p46。

本发明所述的哺乳动物包括但不仅限于为猪或鼠，其他的哺乳动物均在本发明的保护范围之内。本发明的喷鼻免疫小鼠和仔猪，诱导小鼠和仔猪产生有效的特异性免疫应答水平的生物学应用。本发明的喷鼻疫苗对猪肺炎支原体效果显著。本发明的重组枯草芽孢杆菌喷鼻后对预防猪肺炎支原体感染效果显著。

有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：

1、本发明成功构建了猪肺炎支原体p97r1、p46蛋白重组型枯草芽孢杆菌表达质粒pp43nmk-p97r1、pp43nmk-p46，并电击转化进入枯草芽孢杆菌wb800中，即b.s-p97r1、b.s-p46。猪肺炎支原体p97r1、p46蛋白在重组枯草芽孢杆菌wb800内可以被成功表达，并通过喷鼻免疫小鼠可以诱导其产生特异性的系统性免疫应答和局部黏膜免疫应答，同时喷鼻免疫21日龄仔猪可以刺激机体产生有效的特异性免疫应答水平，并对免疫后42天攻毒产生一定的攻毒保护作用。重组枯草芽孢杆菌耐逆性强，易于运输，应用方便，为我国预防猪气喘病提供一种简便而有效的工程疫苗。

2、本发明通过基因工程方法获得了以枯草芽孢杆菌为载体的猪肺炎支原体疫苗。该疫苗选用枯草芽孢杆菌作为载体，确保疫苗安全性，也可降低疫苗生产成本、减少毒株返强的危险。且疫苗免疫方式简单，主要通过喷鼻免疫即可激发黏膜免疫、体液免疫、细胞免疫，减少病变反应，从而保护动物免于猪肺炎支原体的攻击，保持正常的生长速度，减少经济损失。本发明应用重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1和b.s-p46分别喷鼻免疫小鼠和仔猪，且能够产生有效的攻毒保护作用。本发明有望开发成预防猪肺炎支原体的基因工程喷鼻疫苗。

3、本发明首先以b.s-p97r1、b.s-p46喷鼻免疫小鼠，能诱导小鼠血清和肺泡涮洗液中产生有效的特异性的igg、siga。然后给21日龄仔猪喷鼻免疫后，不仅可诱导仔猪血清和鼻腔黏液中产生特异性igg、siga抗体，而且在免疫42天后攻毒猪肺炎支原体，与对照组(未免疫但攻毒)相比，免疫本发明重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1、b.s-p46组猪的生长状态好，临床症状、肺脏病理变化轻，肺内支原体载量低，具有一定攻毒保护作用。

附图说明

图1、p97r1、p46基因目的片段pcr电泳图；

图2、pp43nmk-p97r1载体构建示意图；

图3、pp43nmk-p46载体构建示意图；

图4、鉴定重组枯草芽孢杆菌p97r1，p46基因表达westernblot试验图片；

图5、间接elisa检测小鼠血清、肺泡涮洗液中p97r1，p46特异性igg，iga抗体；

图6、免疫组与对照组猪肺部临床病理变化图；

图7、间接elisa检测猪血清、鼻拭子p97r1，p46特异性igg，iga抗体；

图8、猪肺脏组织中猪肺炎支原体载量图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

实施例1表达猪肺炎支原体p97r1、p46基因的重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1、b.s-p46构建

1、引物的设计和合成：

根据genbank中发表的猪肺炎支原体168株(江苏省农业科学院兽医研究所冯志新研究员馈赠)(nc_017509.1)p97r1、p46基因序列(参见序列表中的seqidno：1和seqidno：2)，设计引物，序列如下：

p97r1-f：5’-cattacctcagccgccagcag-3’，

p97r1-r：5’-aagccattgggaaatagtct-3’；

p46-f：5’-aaatgaaaaaaatgcttag-3’，

p46-r：5’-ttaggcatcaggattatcaacat-3’；

以上引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

2、模板的准备：

取培养好的猪肺炎支原体168株，使用水煮法进行粗提全基因组，具体操作步骤如下：1)取猪肺炎支原体培养液(浓度10⁷ccu/ml)1ml，12000r/min离心15min，弃去上清；2)加入30μl无菌蒸馏水，重悬沉淀；3)将上述重悬液体在沸水浴中煮沸10min，立即放入-20℃冰浴10min；4)取出冰浴样品，让其室温融化；5)待其融化完全，取出，12000r/min离心10min，吸取上清，即为粗提的猪肺炎支原体dna模板。

3、目的基因获取：

以上述p97r1-f，p97r1-r；p46-f，p46-r为引物，猪肺炎支原体168株基因组为模板，通过pcr方法克隆p97r1、p46基因，目的片段大小分别为250bp、1260bp左右(如图1)。

4、p46基因定点突变：

猪肺炎支原体具有一套独立的密码子翻译系统，tga密码子在其体内表示色氨酸，在其他原核表达系统表示终止密码。因此，根据p46基因上3个突变位点，设计3对overlappcr引物，序列如下：

p46-f1：5’-tcctcgatggattagtgcc-3’，

p46-r1：5’-ggcactaatccatcgagga-3’；

p46-f2：5’-aataactggctcactcagc-3’，

p46-r2：5’-gctgagtgagccagttatt-3’；

p46-f3：5’-cccaggatggaattatgga-3’，

p46-r3：5’-tccataattccatcctggg-3’；

其中，每对引物突变位点的tga设计为tgg(表示色氨酸)且以下划线表示，以上引物均由南京金斯瑞生物科技公司合成。分别以p46-f、p46-r1，p46-f1、p46-r2，p46-f2、p46-r3，p46-f3、p46-r为引物，p46基因片段为模板，将p46扩增为a、b、c、d4个片段。以p46-f、p46-r2，p46-f2、p46-r为引物，分别以a与b，c与d为模板，获得ab、cd突变片段，再以p46-f、p46-r为引物，将ab、cd相连，获得可表达的p46基因，且测序正确。

5、重组质粒的构建：

以p97r1-f，p97r1-r；p46-f，p46-r引物为基础，设计同源重组的引物，序列如下：

p97r1-f2：5’-tgtaacacatgcctcagctgcagcattacctcagccgccagc-3’，

p97r1-r2：5’-ccatgattacgccaagcttaagccattgggaaatagtcttcttttgg-3’；

p46-f4：5’-tgtaacacatgcctcagctgcagaaatgaaaaaaatgcttagaaaaaaatttttgtattcatcagc-3’，

p46-r4：5’-ccatgattacgccaagcttttaggcatcaggattatcaacattagcttttgtaaca-3’；

引物中含有与表达载体pp43nmk相对应的酶切位点psti和hindiii，酶切位点5’前均加入18bp左右载体同源臂序列。下划线为酶切位点，该引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。以p97r1-f2，p97r1-r2；p46-f4，p46-r4为引物，p97r1，p46基因为模板，扩增带同源臂的p97r1，p46基因，并通过同源重组方法将目的基因p97r1、p46连接至分泌型枯草芽孢杆菌pp43nmk载体(南京农业大学生命科学学院林建副教授馈赠)(如图2，图3)。并通过测序验证结果正确，成功构建分泌表达质粒pp43nmk-p97r1，pp43nmk-p46。

6、重组分泌型表达质粒电击转化获得的表达猪肺炎支原体p97r1、p46蛋白的重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1、b.s-p46。具体方法如下：

1)枯草芽孢杆菌电击转化感受态制备：

b.subtiliswb800菌株在无抗的固体lb平板划线。24h后，挑取单菌落进行扩培，16h后按照1∶16接种于生长培养基(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，山梨醇91g，定容至1000ml，高压蒸汽灭菌)，37℃180r/min进行扩培，待细菌生长至od600≈0.9时，将菌液放入冰中10min。随后4℃5000r/min离心8min收集菌体，用预冷的电击洗液(山梨醇91g，甘露醇69g，海藻糖189g，甘油10％，定容至1000ml，高压蒸汽灭菌)冲洗菌体4次，直至无培养基成分。最后用1/40生长培养基体积的电击洗液重悬菌体，至终浓度为1×10¹⁰cfu/ml。每管60μl分装后放置于-80℃保存。

2)电击转化重组分泌表达载体质粒：

取60μlb.subtiliswb800电转化感受态细胞与1μl(50ng/μl)上述分泌表达载体质粒pp43nmk-p97r1，pp43nmk-p46分别混合后加入1mm电击杯中冰浴30min后进行电击，电击条件：22kv/cm，25μf，200ω，5ms电击一次。加入1ml电击恢复液(蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，山梨醇91g，甘露醇69g，海藻糖189g，定容至1000ml，高压蒸汽灭菌)，37℃100r/min孵育3h，涂布于硫酸卡那霉素抗性固体lb培养板，14-18h可见阳性菌落。

3)重组枯草芽孢杆菌验证：

3.1)提取阳性菌落质粒：5000r/min离心5min收集菌体，按omega质粒提取试剂盒说明书提取(枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，solutioni配合溶菌酶10mg/ml，37℃孵育30min)，其余步骤相同。

3.2)酶切、测序验证：使用psti、hindiii限制性内切酶按说明书进行质粒酶切，酶切产物经1％琼脂糖进行电泳鉴定，其余质粒送南京金斯瑞生物科技公司进行测序验证。

3.3)westernblot验证：5ml阳性菌液离心后1ml0.01mol/lpbs重悬，超声破碎，12000r/min离心15min；沉淀用sds-loadingbuffer重悬，沸水浴10min；12％蛋白胶跑胶，将条带通过湿转进入pvdf膜；5％脱脂奶粉封闭2h；1∶1000p97r1、p46单克隆抗体(江苏省农业科学院冯志新老师馈赠)4℃孵育过夜；tbst洗涤5次，每次5min；1∶1000羊抗鼠二抗(碧云天生物技术公司)室温孵育1h；tbst洗涤3次，每次5min；ecl发光液显色，凝胶成像系统观察。

结果如图4所示，在p97r1蛋白在12kd左右、p46蛋白在46kd左右有相应条带，空载对照组无条带显示。将验证正确的重组枯草芽孢杆菌命名为b.s-p97r1，b.s-p46。

实施例2重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1、b.s-p46喷鼻免疫小鼠试验

1、选取80只6周龄spf雌性小鼠(南京市江宁区青龙山动物繁殖场)，随机分为4组，每组20只，组1：空白对照组(pbs组，同剂量20μl无菌pbs滴鼻小鼠)；组2：空载体组(b.s组，同剂量(20μl5×10⁸cfub.s)滴鼻小鼠)；组3：b.s-p97r1组(第0天滴鼻免疫20μl5×10⁸cfub.s-p97r1，第28天二次免疫同剂量菌)；组4：b.s-p46组(第0天滴鼻免疫20μl5×10⁸cfub.s-p46，第28天二次免疫同剂量菌)，并于第0天，免疫后第7天，14天，28天每组处死4只采集血清和肺泡涮洗液，第42天全部处死，采集血清和肺泡涮洗液。

2、间接elisa检测小鼠血清和肺泡涮洗液：用包被液(0.05mol/l碳酸盐缓冲液(ph9.6)，碳酸钠0.75g，碳酸氢钠1.46g，去离子水定容至500ml，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存备用)将p97r1、p46纯化蛋白(采用本领域常规方法将p97r1，p46基因克隆至载体pet28a(+)，化学转化至大肠杆菌并表达，验证后通过镍离子亲和层析法纯化获得p97r1、p46纯化蛋白，-70℃保存备用)稀释成4μg/ml，包被elisa板，每孔加100μl。于37℃温育1h后，再放入4℃过夜。倒出孔内液体，加入400μl/孔洗涤液pbst(0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.4)，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8g，0.05％tween-20，加去离子水定容到1000ml)，每次5min，拍干，重复洗涤3次。每孔加入400μl5％脱脂奶封闭液(0.02mol/l磷酸盐缓冲液(ph7.4)，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8g，加去离子水定容到1000ml，取100ml，加5g脱脂奶，充分混匀)，于37℃封闭2h。倒出孔内液体，洗涤3次，拍干。每孔加入100μl检测样品(血清1∶100稀释，肺泡涮洗液1∶50稀释)，稀释液为0.1％bsa(取100ml0.02mol/l磷酸盐缓冲液，加0.1gbsa，充分混匀)，于37℃温育1.5h，倒出孔内液体，洗涤3次，拍干。检测不同样品，每孔分别加入100μl经稀释液1∶2000稀释的hrp标记的羊抗小鼠iga抗体(southernbiotech)、羊抗小鼠igg抗体(cst公司)；于37℃温育1h，倒出孔内液体，洗涤3次，拍干。每孔加入100μltmb显色液(索莱宝生物公司)，于37℃避光作用7min。每孔加入50μl硫酸终止液，酶标仪检测od450nm值。

3、间接elisa检测小鼠血清，肺泡涮洗液中特异性igg，iga抗体水平，结果如图7上方两幅图所示，小鼠血清中p97r1，p46特异性igg抗体水平在第14天明显高于pbs组、b.s组，且在第28天，第42天维持一定抗体水平；表明b.s-p97r1，b.s-p46重组枯草芽孢杆菌均能有效诱导小鼠系统性免疫反应。检测小鼠肺泡涮洗液中p97r1，p46特异性iga抗体水平如图5下方两幅图所示，其在第7天即出现明显增高，与对照组相比，在14天，28天抗体水平趋于稳定，第28天二次免疫后，第42天抗体水平相应增高，表明b.s-p97r1，b.s-p46重组活载体疫苗均能有效诱导小鼠局部黏膜免疫反应。

实施例3重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1、b.s-p46喷鼻免疫21日龄仔猪试验

1、选取6只21日龄spf仔猪(江苏省农业科院兽医研究所)，随机分为2组，每组3只，免疫组(免疫且攻毒)于第0天首免(1ml5×10⁹cfub.s-p97r1混合1ml5×10⁹cfub.s-p46喷鼻免疫)，28天二免(以相同剂量免疫)；对照组(未免疫但攻毒)以2ml无菌pbs喷鼻对照。免疫后14天、28天、42天采集血清(前腔静脉无菌采集血液于抗凝管中，4℃静置过夜，4℃2500r/min离心10min，收集上清作为检测样品，于-20℃冻存备用)和鼻拭子(用棉签采集猪两鼻孔拭子，将拭子置于灭菌0.01mol/lpbs中，于4℃浸泡过夜，挤干后取出，浸泡液于4℃2000r/min离心15min，收集上清作为检测样品，于-20℃冻存备用)。在免疫后42天攻毒(由江苏省农业科学院冯志新老师馈赠)(通过气管内注射含有5×10⁷ccu猪肺炎支原体js株的猪肺脏组织匀浆液5ml)，定期观察猪群生长状态，攻毒28天后统一处死采样，肉眼观察肺部病理变化，采集肺脏组织。

2、临床症状和病理变化：攻毒后第14天，对照组猪出现咳嗽症状，后期猪咳嗽声较重，猪生长缓慢，体积较小；免疫组猪状态良好，偶有轻微咳嗽症状，体积较大。剖检后观察肺部变化，如图6所示，清晰可见对照组猪肺左尖叶、左心叶、左隔叶、右隔叶、右尖叶、右心叶、副叶有不同程度的肺实质性肉变；而免疫组猪肺呈粉嫩，仅在某一部位出现轻微病变(图中病变部位箭头所示)。结果表明喷鼻免疫b.s-p97r1和b.s-p46后可以减轻猪肺炎支原体病原对肺部的损伤和病变。

3、间接elisa检测猪血清和鼻拭子抗体水平：具体操作同3.1.1，其中鼻拭子样品1∶2稀释，血清样品1∶100稀释，二抗选择1∶2000稀释的羊抗猪iga抗体(abcam)、兔抗猪igg抗体(bethyl)，其余均相同。

猪免疫试验结果如图7所示，与对照组相比，针对p97r1蛋白的特异性iga抗体水平在28天抗体水平明显高于对照组，且42天猪群仍具有一定抗体水平；针对p97r1蛋白的特异性igg抗体水平在14天出现明显升高，28天抗体水平有所降低，但仍显著高于对照组；针对p46蛋白的特异性iga抗体水平在14天出现明显升高，28天抗体水平趋于稳定，特异性igg抗体水平14天显著高于对照组，28天抗体水平降低，42天抗体降低与对照组不显著；结果表明免疫组猪群不仅可以产生体液免疫，而且可以产生黏膜免疫，且能达到较好免疫水平。

4、猪肺炎支原体载量检测：将构建好的pmd19t-p110标准载体质粒(pcr扩增猪肺炎支原体168株p110基因，克隆至pmd19t载体上，验证后-20℃保存备用)，分光光度计测定其浓度，并计算出拷贝数，然后分别稀释成10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²copy/μl浓度梯度，按说明书在荧光定量仪进行扩增，经计算机分析得出不同拷贝数的ct值，根据ct值以及相应拷贝数的对数做出标准曲线。肺脏组织样品基因制备按karroten提取组织基因试剂盒说明书操作，并用分光光度计检测样品核酸浓度，以相同浓度进行定量检测，根据标准曲线计算相应拷贝数。

结果如图8所示，免疫组猪肺炎支原体核酸拷贝数显著低于对照组拷贝数。结果表明，喷鼻免疫b.s-p97r1和b.s-p46可以显著降低肺内猪肺炎支原体载量。

综上所述，喷鼻免疫重组枯草芽孢杆菌b.s-p97r1、b.s-p46后，不仅可以诱导小鼠血清，肺泡涮洗液产生特异的显著性系统性免疫和局部黏膜免疫，而且可以诱导21日龄仔猪产生相应的全身免疫应答和局部黏膜免疫应答。同时，免疫后的猪群在针对猪肺炎支原体感染，可以有效改善猪群生长状态，降低猪群咳嗽反应，且产生的抗体能有效的抑制肺内猪肺炎支原体增殖，从而减轻其对猪肺脏组织的损伤，减缓猪肺脏组织的实质性病变，对猪支原体性肺炎具有一定的攻毒保护作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>南京农业大学

<120>重组枯草芽孢杆菌在预防或治疗猪肺炎支原体感染中的应用

<160>16

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>254

<212>dna

<213>p97r1基因序列(p97r1)

<400>1

ttacctcagccgccagcagctaaacctgaagcagcaaaaccagtagcagctaaacctgaa60

gcagcaaaaccagtagcagctaaacctgaagcagcaaaaccagtagcagctaaacctgaa120

gcagcaaaaccagtagcggctaaacctgaagcagctaaaccagtagcagctaaaccagtt180

gctactaatactaatactaatactggcttttcacttacaaataaaccaaaagaagactat240

ttcccaatggctta254

<210>2

<211>1260

<212>dna

<213>p46基因序列(p46)

<400>2

atgaaaaaaatgcttagaaaaaaatttttgtattcatcagctatttatgcaacttcgctt60

gcatcaattattgcatttgttgcagcaggttgtggacagacagaatcaggttcgacttct120

gattctaaaccacaagccgagactctaaaacataaagtaagtaatgattctattcgaata180

gcactaaccgatccggataatcctcgatgaattagtgcccaaaaagatattatttcttat240

gttgatgaaacagaggcagcaacttcaacaattacaaaaaaccaggatgcacaaaataac300

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