一种智能巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统及其制备方法和应用与流程

本发明属于生物医学和纳米医学技术领域，涉及一种联合光热治疗效应以及光热响应性的生物治疗因子释放的巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统及其制备与应用。该巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统独特的时空选择性，可针对多种实体恶性肿瘤，联合肿瘤光热治疗以及生物治疗，实现肿瘤局部的靶向综合治疗，降低传统治疗因脱靶效应带来的毒副作用。该巨噬细胞靶向肿瘤系统可有效抑制小鼠肿瘤生长，延长荷瘤小鼠生存期，是一种优良的肿瘤靶向生物制剂，极具临床转化应用前景。

背景技术：

恶性肿瘤仍然是威胁人类健康的首要疾病之一。传统的治疗方式（包括手术治疗、化疗与放疗）存在较大的毒副作用，严重限制了其治疗效果。因此，如何增强药物抗肿瘤效应同时降低药物毒副作用，是肿瘤靶向治疗面临的主要挑战。通常，研究者将药物耦联于靶向分子或利用靶向纳米药物载体提高药物在肿瘤组织中的分布。但是，药物在循环过程中易被肝脏，肾脏和免疫系统快速清除，以及生物体复杂的生物屏障阻碍了药物向肿瘤部位的渗透，且靶向分子特异性差，从而限制了上述方法的治疗效果。

机体内某些细胞，如干细胞、巨噬细胞和t细胞，具有天然的肿瘤归巢能力，可作为药物载体，以类似于“特洛伊木马”的形式靶向肿瘤组织，实现肿瘤药物的靶向递送，发挥抗肿瘤效应。其中，巨噬细胞在肿瘤微环境释放的细胞因子和趋化因子的作用下，能够主动地迁移并渗入肿瘤组织，且在大多数人类和小鼠肿瘤组织中大量存在。此外，作为药物载体，巨噬细胞具有以下优点：容易从患者体内大量获得；天然的吞噬作用使其具有较高的载药能力；同时，临床试验中用体外培养的巨噬细胞来治疗不同类型癌症已有较长的历史，表明巨噬细胞具有临床应用的相对安全性。

目前，已有文献报道将巨噬细胞以类似“特洛伊木马”方式制备具有抗肿瘤功能的靶向递送系统。一种策略是利用基因工程技术修饰细胞以表达分泌型效应蛋白，用于肿瘤靶向递送效应蛋白。另一种策略是将小分子药物或纳米药物以内吞于胞内或附着于细胞膜的形式，负载于巨噬细胞，构建用于肿瘤治疗的巨噬细胞载体。然而，不可控的分泌型效应蛋白可能会引起肿瘤以外部位产生毒副作用。细胞载体中药物载药量低，以及药物或纳米载体对载体细胞内在活性的影响等限制了巨噬细胞药物载体系统的治疗效果。因此，设计基于巨噬细胞递送系统的关键问题是，如何保持巨噬细胞的关键功能，同时药物能有效负载于细胞中并稳定存在，一旦到达肿瘤组织后释放药物杀伤肿瘤。

本发明利用巨噬细胞为细胞载体，经基因工程技术在巨噬细胞内过表达去信号肽的非分泌型效应蛋白（例如：肿瘤坏死因子（tnfα），不限于tnfα），同时通过纳米材料负载能够响应近红外光照射（nir）的光敏剂吲哚菁绿（icg），过表达效应蛋白的巨噬细胞经摄取icg纳米材料后，获得具有光热治疗效应以及光热响应性的生物治疗因子释放的巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统。

本发明制备的巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统以类似“特洛伊木马”方式靶向肿瘤组织，经近红外光照射后，巨噬细胞内光敏剂产生光热治疗效应，同时光热效应导致巨噬细胞裂解释放效应蛋白，从而实现肿瘤组织时空可控的光热与生物联合治疗效应。因此，本发明为临床恶性实体肿瘤的治疗提供了一种优良的肿瘤靶向生物制剂，极具有临床转化应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种智能巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统及其制备与应用。具体而言，旨在以巨噬细胞为细胞载体，经基因工程技术在巨噬细胞内过表达去信号肽的非分泌型效应蛋白（例如：肿瘤坏死因子（tnfα），不限于tnfα），同时通过纳米材料负载光敏剂吲哚菁绿（icg），过表达效应蛋白的巨噬细胞经摄取icg纳米材料后，制备具有光热治疗效应以及光热响应性的生物治疗因子释放的巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统。

本发明所述的巨噬细胞靶向系统具有通式:hims@m(p)。

其中m为巨噬细胞，所属的巨噬细胞为单核/巨噬原代细胞，或者永生化单核/巨噬细胞株；p为去信号肽的非分泌型效应蛋白，包括tnfα，不限于tnfα；m(p)为经基因工程技术构建的过表达去信号肽的非分泌型效应蛋白的巨噬细胞。

hims为负载光敏剂吲哚菁绿的透明质酸包被的氨基介孔硅纳米材料。

hims@m(p)为摄取hims的m(p)巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统。

为达到上述目的，本发明提供具有光热治疗效应以及光热响应性的生物治疗因子释放的巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统的制备方法，包括以下步骤：

1.制备响应近红外光产生光热效应的纳米材料-负载吲哚菁绿的透明质酸包被的氨基介孔硅纳米粒子，简称为hims。

(1)利用溶胶凝胶及表面活性剂模板法制备氨基化介孔硅纳米粒子；

(2)将步骤（1）中的氨基化介孔硅纳米粒子与光敏剂吲哚菁绿反应，离心得到负载吲哚菁绿的介孔硅纳米粒子；

(3)将负载吲哚菁绿的介孔硅纳米粒子与医用透明质酸分子反应，利用介孔硅纳米粒中表面的氨基与透明质酸分子的羧基静电作用，将透明质酸分子包裹在介孔硅纳米颗粒表面，即得到负载吲哚菁绿的透明质酸包被的氨基介孔硅纳米材料。

所述步骤（1）中氨基化介孔硅纳米粒子为实验室前期研究纳米材料，具体制备方法见专利：丝胶蛋白包裹的丝胶/介孔硅复合型载药纳米颗粒的制备方法；专利号：201510560758.5。

所述步骤（2）是将氨基介孔硅纳米材料分散于双蒸水中（1-10mg/ml），加入吲哚菁绿(0.1-1mg/ml)，4℃下，磁力搅拌反应6-12h，离心收集得到负载光敏剂吲哚菁绿的氨基化介孔硅纳米粒子，本步骤中所用的吲哚菁绿与氨基化介孔硅纳米粒子的用量质量比为1:10-1:100；最优质量比为1:10。

所述步骤（3）将医用透明质酸分子（ha-tlm20-40）溶解于磷酸缓冲盐溶液（pbs，ph=7.4）中（1-10mg/ml），加入步骤（2）的负载吲哚菁绿的介孔硅纳米粒子（1-10mg/ml），超声分散30min（jp020120w），避光4℃，磁力搅拌反应1-2小时，离心（8000rpm，10min）收集沉淀，得到hims，本步骤中所用的透明质酸与氨基化介孔硅纳米粒子的投料质量比为1:01-1:10；最优质量比为1:1。

2.具有光热治疗效应以及光热响应性的生物治疗因子释放的巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统（hims@m(p)）的制备。

1）利用基因工程技术在单核/巨噬细胞内过表达去信号肽的非分泌型效应蛋白（m(p)）（例如：tnfα）；

2）将步骤1）中所得的m(p)，与hims共孵育，经细胞摄取內吞后，得到hims@m(p)。

所述步骤1）中具体步骤如下：

(1)过表达去信号肽的非分泌型效应蛋白质粒的构建，选用plenti-cmv-puro-3×flag作为过表达蛋白的载体质粒，用限制酶切割质粒，用聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，pcr）扩增目的基因片段，在重组酶条件下，将目的基因片段与载体质粒融合，获得载有目的基因的过表达蛋白质粒。

(2)转染，将上述3）中的质粒用于病毒的包装获得含有目的基因的整合慢病毒。

(3)感染，将上述收集病毒用于感染单核/巨噬细胞，将目的基因整合于细胞染色体上稳定表达。

(4)筛选，将上述感染后的细胞用嘌呤霉素筛选出稳定表达目的基因的细胞。

所述步骤2）中具体步骤如下：

步骤1）中所得的m(p)细胞，接种于细胞培养板，37℃培养24h后，分别加入不同浓度的hims（50-300ug/ml），继续培养12h，吸去培养液，pbs洗涤3遍，收集细胞得到hims@m(p)。

本发明所述的具有光热治疗效应以及光热响应性的生物治疗因子释放的巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统，经实验证实：单核/巨噬细胞经基因工程技术过表达非分泌型效应蛋白tnfα，以及摄取icg光热纳米材料后，具有较高的肿瘤趋向性和肿瘤归巢能力，并且能够成功响应近红外激光照射，发挥光热治疗效应的同时释放具有生物活性的治疗因子tnfα；在荷瘤鼠中，显著抑制肿瘤的生长，显著延长了小鼠生存期，且具有良好的生物相容性。

本发明制备的巨噬细胞肿瘤靶向治疗系统能够以类似“特洛伊木马”方式靶向肿瘤组织，且具有优越的光热效应和智能光热响应性生物治疗因子释放的特点，可实现时空精准可控的光热治疗与生物治疗协同治疗实体肿瘤，从而达到安全高效的治疗肿瘤的目的。此外，利用icg的近红外荧光特性，可以荧光实时监控巨噬细胞肿瘤靶向系统的体内定位，有利于实现诊疗一体化的目的，且所涉及实验方法可行，技术成熟，有利于临床大批量生产。

附图说明

图1为透明质酸包裹后的氨基介孔硅球扫描电镜形貌图、表面电势图及负载吲哚菁绿的透明质酸包被的氨基介孔硅纳米粒子(hims)的紫外-可见光-近红外光吸收光谱图。

图2为体外验证hims响应近红外光照射后的光热效应。

图3为体外验证基因工程改造后的巨噬细胞能够成功过表达非分泌型egfp-tnfα融合蛋白且发挥tnfα蛋白的生物学活性。

图4为激光共聚焦显微镜以及流式细胞仪检测巨噬细胞对hims的摄取以及滞留效应。

图5为体外验证摄取hims的巨噬细胞响应近红外光照射的光热效应。

图6为体外hims对巨噬细胞的细胞相容性评价。

图7为激光共聚焦显微镜实时观察hims@m(et)响应近红外光照后触发细胞内egfp-tnfα的释放。

图8为体外验证近红外光照射触发hims@m(et)释放egfp-tnfα释放并发挥其生物学活性。

图9为体外验证基因工程改造以及摄取hims纳米粒子后巨噬细胞向肿瘤迁移的能力。

图10为体内验证基因工程改造及摄取hims纳米粒子后的巨噬细胞肿瘤归巢的能力。

图11为体内验证基因工程改造及摄取hims纳米粒子后的巨噬细胞归巢到肿瘤部位响应近红外光的照射后进行光热转换的能力。

图12为在小鼠结肠癌皮下肿瘤模型中，检测肿瘤生长以及小鼠生存期，评价hims@m(et)联合近红外光照射的抗肿瘤效果。

具体实施方式

实施例1：负载吲哚菁绿的透明质酸包被的氨基介孔硅纳米材料的制备。

(1)将十六烷基三甲基溴化铵（1.0g）分散于双蒸水（480ml）中，加入氢氧化钠（0.28g），磁力搅拌，油浴加热至80℃，滴加正硅酸四乙酯（5.0g），持续搅拌反应2-3小时后，离心（8000rpm，10min）收集沉淀，分别用甲醇和双蒸水洗涤1遍，低温冷冻干燥机冻干，即得到白色粉末状含有模板的介孔硅纳米粒子。

(2)将步骤（1）所得的介孔硅纳米粒子（1.0g）分散于甲醇（75ml）中，磁力搅拌下，加入3-氨丙基三乙氧基硅烷（2ml），室温反应24小时后，离心（8000rpm，10min）收集即得到氨基化的介孔硅纳米粒子。

(3)将步骤（2）中所得的氨基化介孔硅纳米粒子（1.0g）分散于甲醇/浓盐酸（甲醇192ml，浓盐酸12ml，体积比为16:1）混合液中，磁力搅拌，油浴加热至80℃，回流反应48小时后，离心（8000rpm，10min）得到具有规则孔道的氨基化介孔硅纳米颗粒（ha@msns），其扫描电镜形貌图，以及表面电势结果如图1所示，电镜图显示氨基介孔硅球在包裹透明质酸前能明显观察到硅球表面的介孔，而在包裹透明质酸后硅球表面介孔不明显；电势的结果显示氨基介孔硅球在包裹透明质酸前带正电荷，而包裹透明质酸后转为负电荷；以上表明透明质酸能够成功包裹在氨基介孔硅球表面。

(4)将步骤（3）中所得的脱模板氨基介孔硅纳米粒（10mg）分散于2ml双蒸水中，加入吲哚菁绿(1mg)，4℃下，磁力搅拌反应12h，离心（8000rpm，10min）收集沉淀，双蒸水洗涤1遍，离心（8000rpm，10min）得到负载光敏剂吲哚菁绿的氨基化介孔硅纳米粒子。

(5)将医用透明质酸分子（ha-tlm20-40）溶解于pbs中（1mg/ml），加入步骤（4）中所得的负载吲哚菁绿的氨基化介孔硅纳米粒子（1mg/ml），超声分散30min（jp020，120w），避光4℃，磁力搅拌反应2小时，离心（8000rpm，10min）收集hims纳米粒子，其紫外吸收光谱图如图1所示，负载吲哚菁绿的透明质酸包被的氨基介孔硅纳米粒子，仍保留了游离icg在808nm处的光吸收能力，并产生了一定的红移，有利于其响应近红外光照射。其光热转换能力如图2所示，相同浓度的游离icg和hims均能够响应近红外的照射，二者在5min内能够达到最大温度，表明hims能够成功响应808nm近红外光的照射，进行光热转换。

实施例2：过表达去信号肽tnfα的单核/巨噬细胞株的构建。

(1)利用聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,pcr）扩增去信号肽的tnfα编码序列，经dna重组技术构建过表达非分泌型tnfα质粒dna。选用plenti-cmv-puro-3×flag作为载体质粒，用sal1和bamh1两种限制酶切割质粒（酶切体系：双蒸水3μl；plenti-cmv-puro-3×flag10μl；10×buffert3μl；sal1酶2μl；bamh12μl；37℃酶切过夜，-20度保存）。用pcr技术扩增基因片段egfp编码序列，其中前向引物(5’-3’)：ctagatatcttcgaaggatccaccatggtgagcaaggg；反向引物(5’-3’)：atccagaggttgattgtcgaccttgtacagctcgtccatg。将扩增的egfp编码序列基因，经重组酶反应连接到载体plenti-cmv-puro，经转化，得到plenti-cmv-puro-egfp的过表达质粒。用pcr技术扩增tnfα去信号肽的编码序列，其中前向引物(5’-3’)：gacgagctgtacaaggtcgacatgctcagatcatcttctc；反向引物(5’-3’)：atccagaggttgattgtcgacttacagagcaatgact。将扩增的tnfα去信号肽的编码序列基因，经重组酶反应连接到载体plenti-cmv-puro-egfp，经转化，得到plenti-cmv-puro-egfp-tnfα的过表达质粒。

(2)将293t细胞接种于细胞培养皿中，培养12h（细胞融合度约为20%~30%），换无血清培养1小时。配置a液：将pspax2（3mg），pmgd2（1mg）和plenti-cmv-puro-egfp-tnfα（4mg）加入到200μl无血清培养基中，轻轻混匀静置5min；同时配置b液：将pei（20μl）加入到200μl的无血清培养基中，轻轻混匀静置5min，将上述a和b两悬液混合，静置20min后，加入到上述无血清培养的293t细胞中，6~8小时后换成含1%~2%胎牛血清的培养基培养48和72小时，分别收集病毒上清。

(3)将单核/巨噬细胞（raw（264.7））接种于细胞培养板，培养12h，吸出细胞培养基，取上述（2）收集的病毒上清，3500rpm/min离心5分钟，0.45μm滤器过滤，加入到巨噬细胞中，同时加入polybrane，终浓度为8μg/ml，培养24~48小时。

(4)将上述感染后的巨噬细胞，换新鲜含10%胎牛血清的培养基培养，同时，培养基中加入嘌呤霉素筛选出细胞内稳定表达目的基因egfp-tnfα的巨噬细胞（m(et)），其过表达非分泌型tnfα融合蛋白如图3所示，分别利用egfp和tnfα的特异性抗体检测egfp-tnfα融合蛋白，结果显示二者均能够检测到大小为44kda的egfp-tnfα融合蛋白，表明利用基因工程技术在巨噬细胞内成功过表达效应蛋白egfp-tnfα。

实施例3：基因工程改造后的巨噬细胞内过表达tnfα蛋白存在形式及活性检测。

取对数生长期的l929细胞，以每孔3万细胞数接种于96孔板中，培养24小时。分别收集三种巨噬细胞（野生型、过表达egfp蛋白，以及过表达egfp-tnfα蛋白）的培养上清，同时细胞计数后，用pbs配制细胞悬液，经液氮冻融裂解。将巨噬细胞的培养上清及冻融裂解液以5万，10万，以及20万分别加入l929细胞中，同时加入放线菌素d（0.5μg/ml），37℃培养48小时后，mts检测l929细胞活力，tnfα蛋白的存在形式及活性如图3所示，m(et)的培养上清未表现出细胞毒性作用，而m(et)的细胞裂解液对l929表现出明显的细胞毒作用，接着sirna敲减tnfα的受体tnfr1后重复m(et)的细胞毒性试验，其毒性作用大大减弱或消失，以上表明过表达tnfα以非分泌形式存在且具有生物学活性。

实施例4：内载hims及过表达非分泌型效应因子tnfα的巨噬细胞肿瘤靶向系统的制备。

将过表达非分泌型效应蛋白tnfα的巨噬细胞raw264.7接种于细胞培养板，37℃培养24h后，加入hims（icg浓度50-300μg/ml），继续培养12h，吸去培养液，pbs洗涤3遍，收集细胞得到内载hims及过表达非分泌型效应因子tnfα的巨噬细胞（hims@m(et)）。

实施例5：基因工程改造后的巨噬细胞摄取并滞留hims纳米粒子效率检测。

将过表达egfp蛋白（m(e)），以及过表达egfp-tnfα（m(et)）的两株巨噬细胞，以每孔25万的细胞数分别接种于24孔细胞培养板（细胞培养板预先放置细胞爬片）培养24小时后，分别加入游离icg（100μg/ml），以及hims（icg浓度为100μg/ml），继续培养12小时。吸出细胞上清，pbs洗涤3遍，继续培养0，24，以及48小时，多聚甲醛固定细胞，dapi细胞核染色，激光共聚焦显微镜下观察各细胞内icg的红色荧光强度。

将m(et)细胞以每孔100万的细胞数接种于24孔细胞培养板中，分别加入游离icg（50-500μg/ml），以及hims（icg浓度为50-500μg/ml），继续培养12小时。吸出细胞上清，pbs洗涤3遍，收集细胞，流式细胞仪检测巨噬细胞内icg荧光强度。m(et)内载hims的效率如图4所示，共聚焦观察显示hims组细胞内icg红色荧光相对于游离icg组明显增强，并且随着时间的延长荧光强度也随之增强。流式的结果显示，icg的浓度在50-300ug/ml时，m(et)摄取hims，m(et)细胞内icg的荧光强度显著大于游离icg组；将分别摄取游离icg和hims的m(et)继续培养24h和48h后，hims组细胞内的icg荧光强度仍远大于游离icg组；综上表明m(et)细胞能够有效摄取和滞留hims。

实施例6：内载hims及过表达非分泌型效应因子tnfα的巨噬细胞光热效应检测。

将巨噬细胞（野生型、过表达egfp蛋白，以及过表达egfp-tnfα）以每孔250万细胞数接种于6孔细胞培养板中，培养24小时后，分别加入hims（icg浓度为100μg/ml）。继续培养12小时后，吸出细胞上清，pbs洗涤3遍，收集各孔细胞，计数后用pbs配置成每毫升100万的细胞悬液，用1w/cm²功率的808nm近红外光垂直照射细胞悬液5分钟，同时用近红外热成像仪记录细胞悬液温度，如图5所示，分别摄取了hims的三株巨噬细胞均能够成功响应近红外光的照射，5min内温度上升到最大温度。综上表明hims@m(et)能够成功响应808nm近红外光的照射进行光热转换。

实施例7：内载hims及过表达非分泌型效应因子tnfα的巨噬细胞活力检测。

将巨噬细胞（野生型、过表达egfp蛋白，以及过表达egfp-tnfα蛋白），以每孔3万的细胞数接种于96孔细胞培养板中，培养24小时后，分别加hims（icg浓度为100-300μg/ml），摄取12小时后，换新鲜培养基，细胞继续培养24和48小时后，mts试剂盒检测各孔的细胞活力，如图6所示，三株巨噬细胞在培养24h，48h和72h活力均为100%，三者无显著差异；当icg浓度分别为100和300ug/ml，三株巨噬细胞摄取hims后的24h和48均未表现出明显的毒性作用，综上表明过表达egfp-tnfα或摄取hims纳米粒子对m(et)巨噬细胞的活力无显著影响。

实施例8：内载hims及过表达非分泌型效应因子tnfα的巨噬细胞经近红外光照射后光热细胞裂解检测。

将过表达egfp-tnfα的m(et)细胞以每孔25万的细胞数接种于共聚焦细胞培养皿中，加入hims（icg浓度为100μg/ml），对照组加入同体积的pbs，培养12小时后，吸出细胞上清，pbs洗涤3遍，换取新鲜培养基继续培养6小时，加入hoechst标记细胞核后，向细胞中加入pi（2μg/ml），将细胞培养皿置于共聚焦显微镜下，确定细胞视野，用808nm激光照射1分钟后，共聚焦显微镜实时记录90分钟内，细胞中蓝色hoechst，绿色egfp和红色pi的变化情况，结果如图7所示，在808nm近红外光照射细胞后的90min内绿色荧光显著减弱，红色荧光逐渐增强，摄取pbs的对照组，在808nm近红外光照射后仍能稳定存在。提示m(et)摄取hims后能够成功响应808nm近红外光照射，光热裂解释放egfp-tnfα蛋白。

实施例9：内载hims及过表达非分泌型效应因子tnfα的巨噬细胞，经近红外光照后释放tnfα的生物学活性检测。

取对数生长期的l929细胞，以每孔3万细胞数接种于96孔板中，培养24小时。将巨噬细胞（野生型、过表达egfp蛋白，以及过表达egfp-tnfα蛋白）以每孔300万的细胞数分别接种于6孔细胞培养板中，培养24小时后，加入hims（icg浓度为100μg/ml），继续培养12小时。吸出细胞上清，pbs洗涤3遍，收集细胞，用pbs配制成细胞悬液，用1w/cm²功率的808nm近红外光照射细胞1分钟后，加入到l929细胞中，同时加入放线菌素d（0.5μg/ml），37℃，5%co2培养48小时后，mts检测l929细胞活力，如图8结果显示，m(et)细胞与l929的比为2.5：3时开始表现出细胞毒性作用，随着细胞数的增加，毒性作用也随之增强。而m(wt)和m(et)组无明显的毒性作用。综上表明hims@m(et)能够成功响应808nm近红外光照后释放egfp-tnfα，并发挥其生物学活性。

实施例10：体外检测内载hims及过表达非分泌型效应因子tnfα的巨噬细胞肿瘤趋化能力。

将巨噬细胞（野生型、过表达egfp蛋白，以及过表达egfp-tnfα蛋白）以每孔300万的细胞数分别接种于6孔细胞培养板中，培养24小时后，加入ha@msns（1mg/ml），继续培养12小时。吸出细胞上清，pbs洗涤3遍，收集细胞，接种于transwell的上室，每孔3万细胞。将c2c12小鼠成纤维细胞和ct26结肠肿瘤细胞以600万细胞数接种于直径为9cm的细胞培养皿中，37℃，5%co2培养24小时后，换无血清培养基继续培养48小时，收集细胞上清作为条件培养基。将上述收集的条件培养基加入transwell的下室，37℃，5%co2培养48小时后，将transwell小室用4%多聚甲醛固定15分钟，pbs清洗后，0.1%的结晶紫染色1小时，pbs清洗后显微镜拍照观察，如图9结果显示，三株巨噬细胞均能够向ct26肿瘤环境迁移，且三者间无明显差异，综上表明基因改造及摄取hims后仍具有向肿瘤环境迁移的能力。

实施例11：体内检测内载hims及过表达非分泌型效应因子tnfα的巨噬细胞肿瘤归巢能力。

取对数生长期的ct26结肠癌肿瘤细胞，以每只小鼠50万细胞数皮下接种于balb/c小鼠的右侧腋窝，建立小鼠皮下结肠癌肿瘤模型。将巨噬细胞（野生型、过表达egfp蛋白，以及过表达egfp-tnfα蛋白）以每孔300万的细胞数分别接种于6孔细胞培养板中，培养24小时后，加入ha@msns（1mg/ml），继续培养12小时。吸出细胞上清，pbs洗涤3遍，收集细胞，加入含dir染料的无血清培养基，37℃水浴避光孵育20分钟，用无血清dmem培养基洗涤3次后，经鼠尾静脉以每只小鼠500万细胞剂量注射到ct26荷瘤鼠体内。小动物活体荧光成像观测体内dir荧光信（ex/em:750/790nm），如图10结果所示，在注射后1h，4h，8h，24h，48h和72h小动物活体成像显示各组巨噬细胞在24h开始均能在肿瘤部位观察到明显的dir的荧光。注射后的72h解剖小鼠重要组织器官荧光成像，结果显示在肿瘤有明显的dir的荧光，综上表明摄取了hims的m(et)能够归巢到肿瘤细胞。

实施例12：体内评价内载hims及过表达非分泌型效应因子tnfα的巨噬细胞的光热效应。

取对数生长期的ct26结肠癌肿瘤细胞，以每只小鼠50万细胞数皮下接种于balb/c小鼠的右侧腋窝，建立小鼠皮下结肠癌肿瘤模型。将巨噬细胞（野生型、过表达egfp蛋白，以及过表达egfp-tnfα蛋白）以每孔300万的细胞数分别接种于6孔细胞培养板中，培养24小时后，加入hims（icg浓度为100μg/ml），继续培养12小时。吸出细胞上清，pbs洗涤3遍，收集细胞，经鼠尾静脉以每只小鼠500万细胞剂量注射到ct26荷瘤鼠体内。分别在注射后24小时，利用近红外光照射（808nm，1.5w/cm²）肿瘤局部10分钟，同时近红外热成像仪记录肿瘤局部温度变化情况，如图11结果显示，三株巨噬细胞组肿瘤局部温度在照射后的6min均能升高到最高温度，分别为m(et)组52.2℃，m(e)组53.1℃，m组为51.4℃，远高于pbs组的最高温度42.8℃，综上结果表明摄取了hims的m(et)细胞归巢到肿瘤局部后能够响应808nm近红外光照射从而进行光热转换。

实施例13：内载hims及过表达非分泌型效应因子tnfα的巨噬细胞肿瘤靶向系统联合光热效应的体内抑瘤效果评价。

取对数生长期的ct26结肠癌肿瘤细胞，以每只小鼠50万细胞数皮下接种于balb/c小鼠的右侧腋窝，建立小鼠皮下结肠癌肿瘤模型。将巨噬细胞（野生型、过表达egfp蛋白，以及过表达egfp-tnfα蛋白）以每孔300万的细胞数分别接种于6孔细胞培养板中，培养24小时后，加入hims（100μg/ml），继续培养12小时。吸出细胞上清，pbs洗涤3遍，收集细胞，经鼠尾静脉以每只小鼠500万细胞剂量注射到ct26荷瘤鼠体内。将荷瘤鼠分为8组，每组5只，分别为：pbs组，hims@m组，hims@m(e)组，hims@m(et)组，pbs+l组，hims@m+l组、hims@m(e)+l组和hims@m(et)+l组，尾静脉注射后24小时，以及48小时，肿瘤局部近红外光照射（808nm，1.5w/cm²）6分钟，游标卡尺每天测量小鼠给药后14天内肿瘤体积（长×宽×1/2宽），如图12结果显示，hims@m(et)+l组小鼠肿瘤明显小于其他7组，在观察的14天内能明显抑制肿瘤的生长，另外光照后的4组肿瘤要明显小于相应的未光照组；且hims@m(et)+l组能够明显延长小鼠的生存期，综上表明内载hims及过表达非分泌型效应因子tnfα的巨噬细胞肿瘤靶向系统联合光热效应能够有效的抑制肿瘤的生长。