一种DNA四面体-汉黄芩素复合物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及骨关节炎药物领域，具体涉及一种dna四面体-汉黄芩素复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

骨关节炎(oa)是一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生。oa可分为原发性和继发性两类。原发性oa多发生于中老年，无明确的全身或局部诱因，与遗传和体质因素有一定的关系。继发性oa可发生于青壮年，可继发于创伤、炎症、关节不稳定、慢性反复的积累性劳损或先天性疾病等。

目前骨关节炎的药物多为抗炎药和镇痛药，只能缓解患者疼痛，实质性的治疗效果十分有限。

汉黄芩素(wogonin)是一种具有抑制肿瘤细胞增殖的黄酮类化合物。最近有研究报道，汉黄芩素能抑制il-1β诱导的软骨细胞炎症反应，显示其在治疗oa中有一定潜能。

但是，汉黄芩素的这种抗炎效果并不足以使汉黄芩素超过现有药物，取得进一步的实质性治疗作用。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种dna四面体-汉黄芩素复合物。

首先，本发明提供了一种纳米分子载药复合物，它是dna四面体和汉黄芩素按照1∶(40～200)的摩尔比、由dna四面体对汉黄芩素封包而成。

进一步地，所述dna四面体和汉黄芩素的摩尔比是1∶200。

进一步地，所述dna四面体由序列如seqidno.1-4的四种单链dna分子通过碱基互补配对组成。

本发明还提供了所述载药复合物的制备方法，包括如下步骤：将汉黄芩素溶液与dna四面体溶液混合，在2-8℃摇床孵育6h以上。

进一步地，所述孵育温度是4℃；所述孵育时间是8h。

本发明还提供了前述复合物在制备治疗骨关节炎的药物中的用途。

前述在制备治疗骨关节炎的药物中的用途中，所述药物是抑制基质金属蛋白酶，肿瘤坏死因子α(tnf-α)，和白介素-1β(il-1β)的药物。

进一步地，前述在制备治疗骨关节炎的药物中的用途中，所述药物是促进软骨形成相关的标志物col-ii和agc，金属蛋白酶组织抑制剂1(timp1)及bcl2的表达的药物。。

前述在制备治疗骨关节炎的药物中的用途中，所述药物是抑制骨关节炎的炎症反应的药物。

前述在制备治疗骨关节炎的药物中的用途中，所述药物是抑制软骨细胞凋亡的药物。

前述在制备治疗骨关节炎的药物中的用途中，所述药物是促进软骨层增生的药物。

前述在制备治疗骨关节炎的药物中的用途中，所述药物是减缓骨胶原丢失的药物。

本发明还提供了一种治疗骨关节炎的药物，其特征在于：它是以前述的纳米分子载药复合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料和/或载体制备而成。

本发明具有以下有益效果：

本发明的复合物可以通过抑制基质金属蛋白酶以及肿瘤坏死因子，来抑制骨关节炎的炎症反应，且效果要显著优于单独使用汉黄芩素。

本发明的复合物还能促进软骨层增生，抑制软骨细胞凋亡，减缓骨胶原丢失，维持软骨表面光滑，进而改善骨损伤，其效果也要显著好于单独使用汉黄芩素的情况。

本发明的复合物在抑制炎症反应和改善骨损伤方面都比单独使用汉黄芩素效果好，将本发明的复合物用于治疗骨关节炎药物制备中，具有很好的产业化前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。下面通过具体实施方式对本发明做进一步详细说明，但是并不是对本发明的限制，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

附图说明

图1：利用afm、dls、page和zeta电位检测对tdn和wogonin(w)进行表征。(a)tdn的合成以及twc制备的示意图。(b，e)tdns和汉黄芩素用原子力显微镜进行了表征。(c)通过dls分析tdn的大小。(d)通过page确认成功合成tdn。(f)检测ssdna、tdn、w和twc的zeta电位。(g)汉黄芩素的化学结构。twc表示tdn/w复合物。

图2：twc的成功形成。(a、b、c)透射电镜分别证实汉黄芩素、tdn和twc。(d)由dls确定的twc的流体力学粒径。(e)h2o、tdn、汉黄芩素和twc的图像。(f)tdn、汉黄芩素和twc(t+w)在245-300nm波长范围的吸收光谱。(g，h)在双蒸水中浓度依次增加(10-50um)的twc(t-w)的存在下，gel-red，激发波长为312nm和gel-red-tdns(250nm)混合物的荧光发射光谱。根据600nm处的荧光强度计算包封率。

图3：免疫荧光和流式细胞仪检测ssdna和tdns进入正常和炎性软骨细胞的能力。(a、b、e、f)ssdna-cy5和tdns-cy5分别被正常软骨细胞和炎性软骨细胞内化的免疫荧光检测的代表性图。(cy5：红色；细胞骨架：绿色；细胞核：蓝色)(标尺：100μm)。(c、d、g、h)流式细胞仪定量检测正常软骨细胞和炎症性软骨细胞对ssdna-cy5和tdns-cy5的摄取。

图4：实时定量pcr分析在il-1β导致的炎症环境下，各种材料对软骨细胞基质金属蛋白酶(mmp1、mmp3、mmp13)、炎性因子(tnf-α)、软骨形成标志物(col-ii、agc)和timp1、bcl2表达的影响。基因表达被管家基因β-actin标准化。统计学分析：(*)表示和il-1β组比较有统计学差异，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001.(#)表示和空白组比较有统计学差异，^#p＜0.05，^##p＜0.01，^###p＜0.001.

图5：酶联免疫吸附试验(elisa)检测。mmp1(a)，mpm3(b)，mpm13(c))和tnf-α(d)在被不同材料处理以后的正常的软骨细胞和炎症性软骨细胞中的表达情况。统计学分析：(*)表示和il-1β组比较有统计学差异，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001.(#)表示和空白组比较有统计学差异，^#p＜0.05，^##p＜0.01，^###p＜0.001.

图6：(a)免疫印迹法检测nf-κbp65和iκbα蛋白的表达。(b，c)nf-κbp65和iκbα蛋白表达的定量统计分析。统计学分析：(*)表示和空白组比较有统计学差异，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001.(^)表示和il-1β组比较有统计学差异，^p＜0.05，^^p＜0.01.

图7：(a，b)elisa分析各组大鼠关节液中il-1β、tnf-α和mmp3蛋白分别在1个月(a)和2个月(b)的表达。统计学分析：(*)表示和假手术组比较有统计学差异，*p＜0.05，**p＜0.01.(^)表示和生理盐水组有统计学差异，^^p＜0.01.(#)表示和tdn处理组有统计学差异，^##p＜0.01.(&)表示和汉黄芩素处理组有统计学差异，^&p＜0.05，^&&p＜0.01.(c)各组大鼠关节液中il-1β、tnf-α和mmp3在一个月(1m)和两个月(2m)表达情况的比较。统计学分析：(*)表示和假手术组比较有统计学差异(一个月)，**p＜0.01.(^)表示和生理盐水组有统计学差异(一个月)，^^p＜0.01.(#)表示和tdn处理组有统计学差异(一个月)，^##p＜0.01.(&)表示和汉黄芩素处理组比较有统计学差异(一个月)，^&&p＜0.01.(a)表示和假手术比较有统计学差异(两个月)，^aap＜0.01.(b)表示和生理盐水组比较有统计学差异(两个月)，^bbp＜0.01.(c)表示和tdn处理组比较有统计学差异(两个月)，^cp＜0.05，^ccp＜0.01.($)表示和汉黄芩素处理组比较有统计学差异(两个月)，^$$p＜0.01.t表示tdn；w表示汉黄芩素。

图8：大鼠膝关节的micro-ct图像。(a、c)应用micro-ct分析评价不同药物治疗一个月和两个月后大鼠膝关节的变化。(b，d)分别在一个月和两个月内通过显微ct扫描体模计算骨密度。统计学分析：(*)表示和假手术组比较有统计学差异，*p＜0.05，**p＜0.01.(#)表示和生理盐水组比较有统计学差异，^#p＜0.05.(^)表示和汉黄芩素处理组比较有统计学差异，^p＜0.05.

图9：用h&e、masson和safranin-o染色的大鼠软骨切片的图像(一个月的实验结果)。(a)h&e的代表性图像。(b)masson染色的代表性图像。(c)safranin-o的代表性图像。

图10：用h&e、masson和safranin-o染色的大鼠软骨切片的图像(两个月的实验结果)。(a)h&e的代表性图像。(b)masson染色的代表性图像。(c)safranin-o的代表性图像。

图11：不同材料治疗后1个月及2个月不同组关节软骨tunel染色。绿色表示tunel阳性细胞。统计学分析：(*)表示和假手术组比有统计学差异，**p＜0.01，****p＜0.0001.(^)表示和生理盐水组比较有统计学差异，^p＜0.05，^^p＜0.01，^^^p＜0.001，^^^^p＜0.0001.

图12：col-ii和agc的免疫组织化学分析及定量(一个月的实验结果)。统计学分析：(*)表示和假手术组比有统计学差异，**p＜0.01.(^)表示和生理盐水组比较有统计学差异，^p＜0.05，^^^p＜0.001.

图13：col-ii和agc的免疫组织化学分析及定量(两个月的实验结果)。统计学分析：(*)表示和假手术组比有统计学差异，**p＜0.01，***p＜0.001.(^)表示和生理盐水组比较有统计学差异，^^p＜0.01.(#)表示和tdn材料处理组有统计学差异，^##p＜0.01.(&)表示和汉黄芩素处理组比较有统计学差异，^&p＜0.05.

图14：本发明的原理图。

具体实施方式

实施例1dna四面体的制备和表征

1.方法

1.1dna四面体(tdn)的制备方法

tdn是由独特设计的四条dna单链(s1，s2，s3，s4)通过一个快速、简单、特定的pcr程序(95℃维持10min，快速降温到4℃维持20min，4℃长期保存)自组装合成的。四条单链按照等摩尔比(每条单链加入1μl浓度为100μm的储存液)加入到含有96μl的tmbuffer(10mmtris-hcl，50mmmgcl2，ph8.0)的200μlep管中，将反应液加热到95℃维持10min，然后快速降温到4℃合成了tdn。

1.2四条dna单链的具体序列如下：

1.3聚丙烯酰胺凝胶电泳、动态光散射(dls)、原子力显微镜(afm)、透射电镜(tem)和电荷测定对tdn进行表征：

①page：成功合成的tdn首先进行8％聚丙烯酰胺凝胶电泳表征，上样跑胶，恒压100v跑胶80min，然后采用1∶50的goldview进行染色曝光观察。

②dls：合成出来的tdn用二次蒸馏水稀释至250nm然后在zetapals分析仪上进行观察。

③afm：原子力显微镜对tdn纳米颗粒的表面形貌进行表征是由轻敲扫描模式下shimadzuspm-9700原子力显微镜完成的。tdn用tm缓冲溶液稀释至20nm，然后将10μl的该溶液滴在新鲜的云母片上待干大约15min，然后进行观察。

④tem：透射电镜对tdn的微观结构进行观察，显示tdn纳米材料为粒径10nm的分布均匀的小颗粒。

⑤zetapotential：采用zetasizernanozs90(malverninstrumentsltd，u.k.)测定单链、tdn的电位。

2.结果

结果如图1所示。非变性的8％聚丙烯酰胺凝胶电泳显示合成出来的tdn大小为200bp左右。同时，动态光散射分析出tdn的流体动力学大小为7nm左右。另外原子力显微镜观察tdn的表面形貌，结果显示tdn的粒径大约为2-3nm。透射电镜检测结果表明tdn分布均匀并且大小小于10nm。从以上结果可知，tdn的合成是成功的。

实施例2汉黄芩素(w)溶液及tdn-汉黄芩素复合物(twc)的制备和表征

1.w溶液和twc的制备

w溶液的制备：w购买自coolaber(china，beijing)，直接采用二甲基亚砜(dmso)进行溶解，得到汉黄芩素溶液。

twc的制备：取适量的汉黄芩素溶液、双蒸水(或者tm缓冲液)和tdn溶液，混合，使得汉黄芩素在混合溶液中的浓度为10μm、25μm和50μm，tdn浓度为250nm；然后直接在4℃恒温摇床上孵育8h。

2.w的表征

对w进行了zeta电位(zetasizernanozs90)的测定，同时，采用afm，tem对w的形貌结构和大小进行表征。结果表明w的电位为负的17左右。结合afm和tem结果显示w大小为1-3nm的分布均匀的微小颗粒。

3.twc的表征

成功合成的twc采用zetasizernanozs90测定电位，dls测定粒径，tem测定形貌和大小，紫外分光光度计测定吸收光谱，荧光分光光度计测定两组复合以后的包封率。

结果显示：twc的电位为-15，流体动力学粒径大约为20nm，tem测定显示粒径为20nm左右的均匀分布的颗粒。为了进一步测定twc，紫外分光光度计测定吸收光谱显示twc成功合成；荧光分光光度计测定tdn(250nm)和w(50μm)有最大的包封率(53.94±15％)，表明twc成功合成(图2)。

以下将以实验例的形式对dna四面体-汉黄芩素复合物的应用做进一步说明。

在未做特别说明时，如下实验例中：dna四面体-汉黄芩素复合物twc溶液中，tdn的浓度是250nm、汉黄芩素浓度是50μm；tdn溶液中，tdn浓度为250nm；汉黄芩素溶液中，汉黄芩素的浓度为50μm。

实验例1细胞实验

1.细胞类型：软骨细胞。

2.实验设置：当软骨细胞培养传代到p1代的时候将软骨细胞消化种在6孔板里培养，10％血清培养12h后，进行梯度降血清8％，2％，1％培养，当血清降到1％后，做如下处理：

对照组：培养38h。

模型组：培养14h后，加入il-1β(浓度为10ng/ml)处理24h。

实验组(tdn、汉黄芩素和twc)：在培养12h后分别加入tdn、汉黄芩素或twc溶液进行处理2h，再在各组中加入il-1β(浓度为10ng/ml)处理24h。

在实验例中，“炎症软骨细胞”指的是：经过il-1β(浓度为10ng/ml)处理24h的软骨细胞。

3.相关检测方法和结果

(1)检测tdn进入正常软骨细胞和炎症软骨细胞的情况

采用免疫荧光和流式细胞术对tdn进入软骨细胞(正常和炎症)进行检测。带有cy5(红色荧光基团)的s1单链dna和tdn(其s1单链dna同样带cy5)分别与正常软骨细胞和炎症软骨细胞(采用il-1β处理)孵育6h，之后采用4％多聚甲醛固定细胞，鬼笔环肽(绿色)和dapi(蓝色)分别用来染细胞骨架和细胞核。最后采用共聚焦显微镜进行观察采图。结果发现在正常软骨组，单链进入细胞的量很少，而tdn进入细胞的量远大于单链。在炎症软骨组，不管是单链还是tdn进入细胞的量都增加了，而且tdn可以大量的进入炎症软骨细胞。比起正常软骨细胞，tdn进入炎症软骨细胞的量远远大于它(图3a、b、e、f)。

另外，为了进一步验证这个实验结果，发明人采用了流式细胞术进行定量分析，结果显示和免疫荧光一致。单链很少进入软骨细胞，但是进入炎症软骨细胞的量多于正常软骨细胞(图3c、d、g、h)。tdn可以大量进入正常软骨细胞和炎症软骨细胞，并且进入后者的量远远大于了前者。

(2)twc对骨关节炎相关基因和蛋白的表达的影响

在膝关节软骨中，基质金属蛋白酶(mmps)扮演着重要的角色，主要是负责软骨细胞外基质的合成和降解。在骨关节炎(oa)中，mmps(mmp1，mmp3，mmp13)的表达大幅度提高，使得胞外基质被大量降解，同时胞外基质中的大分子-软骨细胞的标志物：二型胶原(collagenii，col-ii)和蛋白聚糖(aggrecan，agc)也显著下降。肿瘤坏死因子(tnf-α)和白介素(il-1β)均是重要的炎症介导因子，促使分解代谢酶的表达。金属蛋白酶的组织抑制剂(timp1)可以抑制mmps的表达。研究表明，timp1是mmp13相关的软骨细胞衰老和软骨基质中老化变化的功能调节剂。b淋巴细胞瘤-2(bcl2)是重要的抗凋亡细胞因子，当它的表达升高时，可以显著抑制软骨细胞的凋亡。因此，发明人使用实时定量pcr和elisa检测了以上基因的表达和相关的蛋白的表达。

实时定量pcr结果如图4所示：采用il-1β处理以后的模型组基质金属蛋白酶，炎症因子显著上调；软骨细胞标志物，timp1和bcl2的表达被抑制。t、w和twc处理以后，mmps(mmp1，mmp3，mmp13)和tnf-α的表达得到了显著的抑制，twc的抑制效果相较于其他两者而言更强。相较于模型组而言，col-ii，agc，timp1，bcl2的表达在三种材料处理以后得到一定程度的上调。

elisa结果如图5所示：与ctrl相比，il-1β处理以后的模型组mmps(mmp1，mmp3，mmp13)和tnf-α的表达显著上调。但是采用三种材料处理以后，以上蛋白的表达都得到了一定程度的抑制，尤其是twc的抑制效果更佳。

(3)tdn对nf-κb与iκbα的调控

核因子κb(nuclearfactorkappa-b，nf-κb)蛋白家族可以选择性的结合在b细胞κ-轻链增强子上调控许多基因的表达。在几乎所有的动物细胞中都能发现nf-κb，它们参与细胞对外界刺激的响应。当细胞处于静息状态时，nf-κb通过与抑制性蛋白iκbα结合，从而以无活性的形式存在于细胞质中。在多种外界因素刺激下，其活性可以被多种因子激活，这些因子产生的第2信使信号导致iκbα的磷酸化和泛素化，继而被降解，nf-κb脱离了iκbα的阻滞，可转位至细胞核，p65的核转位是nf-κb信号转导通路活化的重要标志。因此，在细胞的炎症反应、免疫应答等过程中nf-κb起到关键性作用。iκbα和nf-κbp65在炎症反应中起着重要的作用。因此，发明人使用westernblot检测了tdn对nf-κbp65与iκbα的表达情况的影响。

实验结果如图6所示，tdn可以抑制炎症软骨细胞中nf-κbp65的激活，并且抑制炎症软骨细胞中iκbα的降解。表明tdn本身具有一定的抗炎作用。

本实验例结果表明，本发明的twc可大量进入炎症软骨细胞，通过调控软骨细胞外基质合成和降解的相关基因、炎症介导因子以及软骨细胞标志物的表达，实现关节炎的治疗。

实验例2体内实验

1.主要实验材料：

动物：雄性wistar大鼠(180-200g)。

试剂：elisa试剂盒：il-1β，tnf-α，mmp-3；tunel试剂盒；免疫荧光抗体：col-ii，agc。

2.实验设置：

2.1实验分组(5组*6只)

a：假手术组(sham组)

b：膝骨关节炎模型(koa)+生理盐水组(ns)

c：koa+tdn(t)组

d：koa+wogonin(w)组

e：koa+tdn/wogonin(twc)组

b组：koa模型建立：大鼠均采用1％戊巴比妥钠40μg/g腹腔内注射麻醉，麻醉后大鼠平卧于手术台，右膝关节处剃毛清洁，消毒。取右膝关节内侧纵形切口长约0.5em，分别切开皮肤，分离皮下组织，显露并切断内侧副韧带，打开膝关节关节腔，显露并切断前后交叉韧带，暴露并切除内侧半月板，彻底止血，用生理盐水反复冲洗关节腔，逐层缝合，在伤口处涂抹氯霉素眼膏以预防感染。造模后1个月，进行治疗。膝关节腔内注射生理盐水，大鼠每只给药100μl/次/d，连续给药30d后，进行后续检测。

c组：koa模型建立方法与b组相同，造模后1个月，膝关节腔内注射t，大鼠每只给药100μl/次/d，连续给药30d后，进行后续检测。

d组：koa模型建立方法与b组相同，造模后1个月，膝关节腔内注射汉黄芩素，大鼠每只给药100μl/次/d，连续给药30d后，进行后续检测。

e组：koa模型建立方法与b组相同，造模后1个月，膝关节腔内注射twc，大鼠每只给药100μl/次/d，连续给药30d后，进行后续检测。

a组：假手术组：不切断前后交叉韧带，不切除内侧半月板，其余处理与b组相同。

2.2标本采集和处理

取大鼠右侧全膝关节(包括全膝关节、股骨远端及胫骨近端)，去除附着肌肉及韧带，置于40g/l多聚甲醛溶液中固定48h后行micro-ct扫描及病理切片染色。

2.3免疫印迹法(westernblot)和elisa检测蛋白表达

取所有组别各4只动物的关节液进行elisa实验，检测il-1β、tnf-α和mmp3蛋白的表达。

2.4micro-ct检测(5组*1指标*6只动物)

取大鼠右侧全膝关节(包括全膝关节、股骨远端及胫骨近端)，去除附着肌肉及韧带，置于40g/l多聚甲醛溶液中固定。

所有组别，将固定后大鼠右膝关节取出置于工作站支架，将其定位于扫描中心，保证所观察的部位处于ct扫描范围内。ct扫描参数为：80kv、500μa，扫描时间8min，分辨率：10μm，扫描时间600s。

后续每组选择典型的4只动物，进行后续检测。

2.5he检测(5组*1指标*4只动物)

所有组别，取右膝关节标本，脱钙后进行包埋和切片。观察关节软骨形态学变化。

2.6番红固绿染色(5组*1指标*4只动物)

所有组别，取右膝关节标本，进行番红固绿染色，观察软骨结构变化。

2.7masson染色(5组*1指标*4只动物)

所有组别，取右膝关节标本，进行masson染色，观察胶原纤维变化。

2.8tunel染色(5组*1指标*4只动物)

所有组别，取右膝关节样本，进行tunel染色，dapi染核。荧光显微镜下，计数6个视野下每组大鼠同一部位的阳性染色数量，作统计分析。

2.9免疫荧光染色(5组*1指标*4只动物)

所有组别，取右膝关节标本，免疫荧光标记col-ii和agc的蛋白表达，dapi染核。荧光显微镜下，计数6个视野下每组大鼠同一部位的阳性染色数量，作统计分析。

3.实验结果

(1)蛋白表达

分别在一个月和两个月的时间点收集膝关节液进行elisa检测。实验结果如图7所示，模型组il-1β，tnf-α和mmp3的表达相比于正常组显著上升。在进行三种材料处理以后il-1β，tnf-α和mmp3的表达得到了显著的抑制，并且twc的抑制效果最佳。2个月的实验结果显示相比于1个月的实验结果，il-1β，tnf-α和mmp3的表达得到了更进一步的抑制。实验结果表明twc可以有效抑制骨关节炎的炎症。

(2)采用micro-ct观察大鼠膝关节变化情况

micro-ct图像如图8所示。

一个月的结果：根据骨密度分析结果显示，与sham组相比，koa+ns，koa+t，koa+w，koa+twc的骨密度均极显著性降低；koa+ns组相比，koa+t，koa+w，koa+twc的骨密度变化无差异；koa+t组和koa+w组间骨密度变化无差异；而koa+twc组与koa+t组间骨密度变化无差异，但较koa+w组显著性升高。以上结果表明，膝骨关节炎模型的骨密度明显降低，t、w单独治疗及twc治疗1个月后，对于骨密度变化没有明显的改善作用。

两个月的结果：通过micro-ct重建3d图显示，sham组关节结构辨认清晰，软骨表面光滑，无骨赘形成；切面图显示，软骨层厚实，骨小梁形状规则，排列整齐有序，未见骨破坏。koa+ns组关节结构辨认清晰，软骨表面粗糙，有裂纹及少量剥落，软骨下骨暴露；切面图显示，软骨层变薄，骨小梁排列紊乱，软骨下骨囊性变性，显示软骨缺损。koa+t组、koa+w组和koa+twc组关节辨认清晰，软骨表面粗糙，软骨下骨暴露，且koa+twc组表面有少量剥落；切面图显示，软骨下骨暴露，软骨层较sham组变薄，较koa+ns组较厚，骨小梁形状规则，排列整齐有序。根据骨密度分析结果显示，与sham组相比，koa+ns，koa+t，koa+w，koa+twc的骨密度均显著性降低；koa+ns组相比，koa+t和koa+w的骨密度无显著性差异，koa+twc的骨密度显著性升高；koa+t组、koa+w组和koa+twc组之间骨密度变化无显著性差异。综合以上结果表明，膝骨关节炎模型的骨损伤明显，t、w单独治疗及twc治疗2个月后，对于骨损伤有改善作用，而twc组效果优于其他组。

(3)he、masson、safranino染色检测各组大鼠膝骨关节情况。

①he：

一个月的实验结果：如图9a所示：sham组关节软骨结构层次清晰，软骨表面光滑，软骨细胞排列整齐，软骨基质分布均匀，软骨层较厚；骨小梁规则有序，骨细胞分布均匀。koa+ns组关节软骨结构层次紊乱，软骨表面粗糙，纤维化增生，软骨细胞排列无规则，软骨基质分布不均，软骨层较薄；骨小梁形态较乱，骨细胞簇集分布。koa+t组、koa+w组和koa+twc组关节软骨结构层次清晰，软骨表面较光滑，软骨细胞增生，排列较整齐，软骨基质分布轻度不均，软骨层较koa+ns组厚，但比sham组薄，骨小梁分布轻度不均匀。以上结果表明，膝骨关节炎模型的骨损伤明显，t、w单独治疗及twc治疗1个月后，对于骨损伤有改善作用。

两个月的实验结果：从图10a中可以看出，sham组关节软骨结构层次清晰，软骨表面光滑，软骨细胞排列整齐，软骨基质分布均匀，软骨层较厚，潮线清晰；骨小梁规则有序，骨细胞分布均匀。koa+ns组关节软骨结构层次部分紊乱，软骨表面粗糙，纤维化增生，软骨细胞排列无规则，软骨基质分布不均，软骨层较薄，潮线较模糊；骨小梁形态较乱，骨细胞簇集分布。与koa+ns组相比，koa+t组、koa+w组和koa+twc组关节软骨结构层次清晰，软骨表面较光滑，软骨细胞增生，排列较整齐，软骨基质分布轻度不均，软骨层较koa+ns组厚，但比sham组薄，骨小梁分布轻度不均匀。其中koa+twc组关节软骨表层较koa+w组和koa+t组光滑，关节软骨细胞增生也较koa+w组和koa+t组少；koa+t组软骨细胞形态结构较koa+w组和koa+twc组好。以上结果表明，膝骨关节炎模型的骨损伤明显，t、w单独治疗及twc治疗2个月后，对于骨损伤有改善作用，而twc组改善效果优于其他组。

②masson：

一个月实验结果：masson染色(图9b)显示，sham组染色均匀一致，细胞排列规则，软骨胶原呈蓝色，钙化软骨及骨小梁胶原呈红色。koa+ns组蓝色丢失较多，从潮线向上有许多呈火焰状上升起的红染物，着色同钙化软骨。koa+t组蓝色丢失明显减少，红色较koa+ns组减少。koa+w组从潮线向上的火焰状红染物消失，软骨胶原略微呈红色，但软骨层变薄。koa+twc组蓝色丢失减少，潮线向上的火焰状红染物消失，软骨胶原略微呈红色，但软骨层略微变薄。以上结果表明，膝骨关节炎模型的软骨胶原丢失严重，t对软骨胶原丢失有一定的改善效果，汉黄芩素单独治疗及twc治疗1个月后也可减缓软骨胶原的丢失。

两个月实验结果：masson染色(图10b)显示，sham组染色均匀一致，细胞排列规则，软骨胶原呈蓝色，钙化软骨及骨小梁胶原呈红色。koa+ns组蓝色丢失较多，从潮线向上有许多呈火焰状上升起的红染物，着色同钙化软骨。koa+t组蓝色丢失明显减少，红色较koa+ns组减少，软骨层较sham薄。koa+w组从潮线向上的火焰状红染物消失，软骨胶原略微呈红色，软骨层较sham薄。koa+twc组蓝色丢失减少，潮线向上的火焰状红染物消失，软骨胶原红色较少，软骨层较koa+t组和koa+w组厚。以上结果表明，膝骨关节炎模型的软骨胶原丢失严重，t对软骨胶原丢失有一定的改善效果，汉黄芩素单独治疗及twc治疗2个月后也可减缓软骨胶原的丢失。

③safranino：

一个月的实验结果：如图9c所示：sham组关节软骨表面光滑，浅层软骨组织和中层软骨组织细胞排列整齐，无明显差异性分布，软骨基质分布均匀；软骨组织和骨组织对比鲜明。koa+ns组关节软骨结构层次紊乱，浅层软骨组织表面粗糙，断裂，纤维化增生，软骨细胞簇集排列无规则，软骨基质分布不均，软骨层较薄；软骨组织和骨组织对比模糊。koa+t组、koa+w组和koa+twc组关节软骨结构层次清晰，软骨表面较koa+ns组光滑，软骨细胞增生，排列较整齐，软骨基质分布轻度不均，软骨层较koa+ns组厚，但比sham组薄，软骨组织和骨组织对比较鲜明。其中koa+twc组表层关节软骨较koa+w组和koa+t组光滑，软骨细胞排列也较koa+w组和koa+t组整齐；

以上结果表明，膝骨关节炎模型的骨损伤明显，t、w单独治疗及twc治疗1个月后，对于骨损伤有改善作用，而twc组改善效果优于其他组。

两个月的实验结果：从图10c可以看出，sham组关节软骨表面光滑，浅层软骨组织和中层软骨组织细胞排列整齐，无明显差异性分布，软骨基质分布均匀；软骨组织和骨组织对比鲜明。koa+ns组关节软骨结构层次紊乱，浅层软骨组织表面粗糙，断裂，纤维化增生，软骨细胞簇集排列无规则，软骨基质分布不均，软骨层较薄；软骨组织和骨组织对比模糊。koa+t组、koa+w组和koa+twc组关节软骨结构层次清晰，软骨表面较koa+ns组光滑，软骨细胞增生，排列较整齐，软骨基质分布轻度不均，软骨层较koa+ns组厚，但比sham组薄，软骨组织和骨组织对比较鲜明。其中koa+twc组表层关节软骨较koa+w组和koa+t组光滑，软骨细胞排列也较koa+w组和koa+t组整齐；以上结果表明，膝骨关节炎模型的骨损伤明显，t、w单独治疗及twc治疗2个月后，对于骨损伤有改善作用，而twc组改善效果优于其他组。

(4)tunel染色检测各组大鼠膝关节软骨细胞凋亡情况

结果如图11所示。sham组关节软骨表面，浅层软骨组织和中层软骨组织细胞未见细胞凋亡；koa+ns组关节软骨细胞凋亡明显增加。koa+t组、koa+w组和koa+twc组关节软骨细胞凋亡和koa+ns组均相比有不同程度减少。其中koa+twc组软骨细胞凋亡最少。以上结果表明，膝骨关节炎模型的软骨细胞凋亡明显，t、w单独治疗及twc治疗后，对于软骨细胞凋亡有改善作用，而twc组改善效果优于其他组。

(5)col-ii和agc蛋白荧光染色检测在大鼠膝关节的表达

结果如图12(一个月实验结果)和图13(两个月实验结果)所示。相对于sham组关节软骨col-ii和agc蛋白表达情况，其他各组col-ii和agc蛋白表达出现不同程度的增加，koa+t组、koa+w组和koa+twc组之间比较发现，koa+twc联合治疗组col-ii和agc蛋白表达高于单独治疗组。以上结果表明，膝骨关节炎模型的骨损伤明显，t、w单独治疗及twc治疗后，对于骨损伤有改善作用，而twc组改善效果优于其他组。

实验例的概括如图14所示。

综上，本发明的复合物可以抑制骨关节炎症、抑制软骨细胞凋亡、促进软骨层增生、减少骨胶原丢失、维持骨密度，因而适用于骨关节炎药物的制备中，具有良好的产业化应用前景。

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<110>四川大学

<120>一种dna四面体-汉黄芩素复合物及其制备方法和应用

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