一种含益生菌提取活性因子的眼用制剂及其制备方法与流程

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种含益生菌提取活性因子的眼用制剂及其制备方法。

背景技术：

我国是近视发生率较高的国家，从知识型人群中观察，其发生率已超过60％。另一方面受现代化办公特点影响，以及在老龄化社会的发展，干眼症的发生率以每年10％的速度递增，从而构成了眼科抗炎、润目用药的主要消费群体。

与此同时，老年性白内障、青光眼有逐步上升的趋势，从而客观上造就了庞大的眼科用药市场，伴随着保健、医疗开支付费用指数的增长，眼科用药水平也在不断提高。

在知名品牌的广告宣传教育下，消费者的眼睛保健意识增强，对于亚健康状态越来越关注，对相关产品的使用也越来越普遍，从而直接拉动该类药品在零售市场上的销售；同时，眼科产品的价格不断上升，在一定程度上促进了该市场总体销售规模的扩大。上述两个因素是直接导致眼科用药零售终端市场快速增长的驱动力。

眼药市场是一个持续发展的市场，自权威资料证实，目前我国的眼病市场总体规模是100亿人民币；伴随人们的工作环境和生活环境的变化，众多眼病都呈现着快速增长的势头，上网、电脑办公的普及导致使用滴眼液缓解视疲劳的需求量越来越大，并以每年25％的比例增加。白内障、青光眼等患者数量随着老年化日趋严重现象和众多科技电子产品使用，导致患者数量每年以百万数的增长，此现象将再次催生眼药市场的巨大潜力急待开发。

零售药店的眼科用药消费者主要以减轻视疲劳、干眼症、轻度炎症等症状为主。销售的产品主要以明目、缓解疲劳、营养滋润、清洁护卫、抗菌抑菌、止涩止痒等眼科保健产品为主，中药滴眼液在其中占较大比例。

目前国内眼药水主要存在以下问题：

(1)防腐剂对眼睛的长期刺激将引发一系列眼部疾病

因为眼药水打开后容易感染细菌，所以在国家相关规定中，滴眼液和眼药水中可以含有少量防腐剂，但一般对于防腐剂不会做出标注，。消费者使用眼药水后，虽然能暂时改善眼睛干涩，但长期使用会影响人体自身泪腺分泌，眼药水中的防腐剂还会改变眼球表面的环境，经常使用会对眼角膜、结膜健康不利，引发结膜和角膜损伤，使眼睛产生依赖，引发眼部疾病。除微生物导致的眼部炎症以外，也有相当一部分的炎症是由于防腐剂对眼上皮细胞的长期刺激导致的。

(2)视网膜的氧化损伤是导致青光眼的主要因素

目前在临床上关于青光眼发病机制的研究主要集中于眼球局部的解剖结构上，而在基础医学上，研究表明氧化胁迫是导致青光眼发病的重要机制之一；同时，已有研究表明青光眼的发生与视网膜活性氧代谢失衡具有一定关系。

(3)vdt综合征

vdt综合征是光学终端显示器带来的综合征，也叫办公室用眼综合征。vdt即视频显示终端，是英文“visualdisplayterminal”的缩写，包括电视机、计算机的显示器、电子屏幕、游戏机等，在我们的各种工作场合及社会生活中随处可见。vdt对操作者健康的影响已被公认，操作者可出现眼及全身不适，包括眼、手、肩、足、腰部疲劳，称之为vdt症侯群。美国加州大学光学系的研究显示，长期使用电脑的人普遍患有vdt干眼症，即容易眼干、眼红和疲倦，美国现在1000万人受其影响。估计我国这一人数不低于2000万。vdt工作者的视疲劳是普通工作者的4倍，关于vdt对眼睛的损害，吕杰写的《电脑人最易视疲劳》一文有很详细的研究。随着信息技术广泛普及，人们接触上述终端显示屏的机会日益增多，每天在办公室工作使用视屏显示终端人数也逐年增加。这些人容易用眼过度，尤其是长时间、近距离注视闪烁或单调、刺眼的屏幕等，均可引起视疲劳。

因此一个好的眼用制剂一般需要以下功能：

(1)无防腐剂或者减轻防腐剂的伤害

(2)抗氧化

(3)减轻光线对细胞的损伤

(4)补充维生素等营养元素

(5)给人带来清凉的感觉。

目前解决方法有以下几种：

(1)无防腐剂的产品为无菌制剂，即单瓶单次使用，这导致价格非常昂贵，普通消费者无法接受，因此目前市场上90％以上的眼用制剂仍含有防腐剂。如瑞珠滴眼液，采用聚乙烯醇模拟泪液，可以缓解干眼症的发生，但偶有眼部刺激症状和过敏反应，过敏体质者慎用。

(2)通过添加ve，白藜芦醇等抗氧化成分。但白藜芦醇为油溶性，不溶于水，因而一般无法在眼科制剂中使用，目前有德国公司通过脂质体包裹等技术将其添加到水剂中，但由于其稳定性较差，货架有效期一般不超过1年。

(3)针对vdt综合征，一般采用人工泪液提供屏障，减轻干眼症的发生，同时舒缓眼部疲劳。但紫外线和蓝光等短波光线对于眼部细胞的杀伤却也是不可忽视的。白内障属于多因素疾病，不过动物实验及流行病学调查都已显示，紫外线属于白内障的高危因素之一，而且它还可能增加黄斑变性的风险。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一目的在于提供一种无菌无防腐的眼用制剂。

为实现上述目的，本发明提供了一种含益生菌提取活性因子的眼用制剂，包括如下组分：

其中，所述em因子为益生菌的提取物溶液，具体的可以通过如下方法得到：

(1)将益生菌置于溶剂中得混合液，采用物理方法裂解益生菌，并离心，取上清液；

(2)将上清液加入阴离子交换柱进行洗脱，分别收集每个组分；

(3)检测并去除无多糖的组分以及含有蛋白质的组分，即粗品；

(4)将粗品进一步提纯。

优选的，所述含益生菌提取活性因子的眼用制剂，包括如下组分：

本发明的创新点之一体现在首次发现em因子施用于眼部时具有良好的效果。

进一步的，所述含益生菌提取活性因子的眼用制剂，包括如下组分：

上述百分比均为质量百分比。

优选的，所述vb族维生素为vb6和vb12，其中vb6和vb12的质量比为5:1～1:1。

优选的，所述益生菌选自双歧杆菌属(bifidobacterium)、乳酸杆菌属(lactobacillus)或拟杆菌属(bacteroides)中的任意一种或几种；更佳的，所述益生菌选自双歧杆菌属(bifidobacterium)。

所述步骤(1)还含有以下特征中的任意一种或几种：

优选的，所述混合液中菌的重量百分数为5％～45％；进一步的，所述混合液中菌的重量百分数为8％～45％；

优选的，所述裂解的方法选自超声波裂解仪裂解、组织破碎仪裂解、高压均质机裂解或者化学方法裂解中的任意一种或几种；

优选的，所述离心的条件为8000g～30000g/分，时间是10～60分钟；

优选的，将离心获得的沉淀物再次采用物理方法裂解，离心后取上清液，将两次离心后的上清液合并。

所述溶剂可以选自水、磷酸钠水溶液中的任意一种。

优选的，所述步骤(2)还含有以下特征中的任意一种或几种：

优选的，所述洗脱前使用平衡液调整阴离子交换柱，所述平衡液选自10-300mmph6.5-8.5的tris-hcl(三(羟甲基)氨基甲烷)溶液或10-200mmph6-9的磷酸溶液；

优选的，所述洗脱液选用10-300mmtris-hcl/1m氯化钠溶液和10-200mm的磷酸溶液/1m氯化钠溶液；ph为6.0-8.5；

优选的，所述洗脱时使用检测器选用比旋度检测器、视差折光检测器或紫外检测器中的任意一种。

所述步骤(3)中检测并去除无多糖的组分以及含有蛋白质的组分，可以采用现有技术，例如采用苯酚-硫酸方法测总糖含量，采用bca蛋白试剂盒测总蛋白。

为了进一步优化设计方案，步骤(3)还包括将粗品中的蛋白质去除，更优选的，采用分子排阻层析法除去蛋白质。

优选的，所述步骤(4)将粗品进一步提纯包括将粗品通过分子排阻层析和滤膜所述分子排阻层析中平衡液选自10-300mmph6.5-8.5的tris-hcl溶液或10-200mmph6-9的磷酸溶液；收集多糖组分并通过孔径小于等于0.22μm的滤膜。

本发明的第二发明目的是提供一种含益生菌提取活性因子的眼用制剂的制备方法。

为实现上述发明目的，本发明提供了一种含益生菌提取活性因子的眼用制剂的制备方法，包括如下步骤：将各原料组分混合均匀后，经过767活性碳吸附纯化，去除可能的内毒素；离心去除活性炭，再过0.22微米膜过滤去除剩余杂质及细菌；进而进行分装，然后高温湿热灭菌，最后进行包装。

优选的，所述制备方法在万级洁净度环境中进行。

如上所述，本发明的含益生菌提取活性因子的眼用制剂，具有以下有益效果：不添加防腐剂，从而避免了防腐剂对眼部的伤害；活性成分em因子具有良好的抗氧化和抵御光线对细胞的损伤的作用；能够补充维生素等营养元素。

附图说明

图1为罗丹明染色后的人表皮角质细胞图，其荧光强度与线粒体跨膜电位成正相关；其中control为对照；h2o2为双氧水处理；em为1％浓度em因子处理；em+h2o2为em因子和双氧水共处理。

图2为人表皮角质细胞线粒体跨膜电位百分比柱状图。

图3不同用量em因子的对人晶状体上皮细胞中p-53基因表达量的调节作用图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。须知，下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置。此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见sambrook等

molecularcloning：alaboratorymanual，secondedition，coldspringharborlaboratorypress，1989andthirdedition，2001；ausubel等，currentprotocolsinmolecularbiology，johnwiley&sons，newyork，1987andperiodicupdates；theseriesmethodsinenzymology，academicpress，sandiego；wolffe，chromatinstructureandfunction，thirdedition，academicpress，sandiego，1998；methodsinenzymology，vol.304，chromatin(p.m.wassarmananda.p.wolffe，eds.)，academicpress，sandiego，1999；和methodsinmolecularbiology，vol.119，chromatinprotocols(p.b.becker，ed.)humanapress，totowa，1999等。

实施例1：

将短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)干菌粉与无菌水混合得混合液，混合液中菌的重量为8％(w/w)。将上述混合液用超声波裂解仪进行裂解。将该裂解过的菌液用离心机以10,000g，30分钟的速度离心并收集上清液，将不溶性细菌裂解碎片和未裂解细菌再次使用超声波裂解仪进行裂解，然后离心，收集上清液。将两次收集获得的上清液合并。

将上述收集的上清液用等体积的20mmph8.0tris-hcl溶液稀释。将该稀释的上清液通过阴离子交换柱。在上样之前，阴离子交换住用10mmph8.0的tris-hcl平衡液调节。当平衡液调节交换柱以后，将样品加入，用平衡液洗脱不与交换柱结合的组分，然后用10mmtris-hcl/1m氯化钠溶液的洗脱液进行线性梯度洗脱，分别收集每一个组分(采用紫外检测器，由uv260和uv280显示为峰)。

收集的每一个组分，用苯酚-硫酸方法测总糖含量，用bca蛋白试剂盒测总蛋白。去除无多糖或有蛋白的组分，将其他的只含多糖的组分收集并合并作为多糖组分。

将该收集的多糖组分通过分子排阻层析，平衡液选自10mmph8.5的tris-hcl溶液，并通过0.22μm滤膜过滤除不溶性杂质。

实施例2

将长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)干菌粉与20mmph8.5的磷酸钠水溶液混合得混合液，并使混合液中菌的重量15％(w/w)。将上述菌液用组织破碎仪进行裂解。将该裂解过的菌液用离心机以13,000g的速度离心25分钟，分别收集上清液。去除不溶性细菌裂解碎片和未裂解细菌。

将上清液通过阴离子交换柱。在上样之前，阴离子交换住用20mmph8.5的磷酸钠溶液调节，加入样品，用20mm磷酸钠/1m氯化钠溶液ph8.5的洗脱液进行线性梯度洗脱，分别收集每一个组分(用紫外检测器，由uv260和uv280显示为峰)。

收集的每一个组分用苯酚-硫酸方法测总糖和用bca蛋白试剂盒测总蛋白。去除无多糖或有蛋白的峰/组分，将其他的峰收集并合并作为多糖组分。

该收集的多糖组分通过分子排阻层析脱盐，平衡液和洗脱液均选自100mmph6.5tris-hcl溶液并通过0.22μm滤膜过滤除不溶性杂质。

实施例3

将两岐双岐杆菌(bifidobacteriumbifidum)干菌粉与无菌水混合得混合液，并使混合液中菌的重量12％(w/w)。将上述菌液用高压均质机进行裂解。将该裂解过的菌液用离心机以20,000g的速度离心10分钟，并收集上清液，去处除不溶性细菌裂解碎片和未裂解细菌。

将上述收集的上清液用等体积的20mmph8.2磷酸钠溶液稀释。将该稀释的上清液通过一个阴离子交换柱。在上样之前，阴离子交换住用10mmph8.2的磷酸钠溶液，当样品附着以后，用10mm磷酸钠/1m氯化钠溶液ph8.2的洗脱液进行线性梯度洗脱，分别收集每一个组分或峰(用紫外检测器，由uv260和uv280显示为峰)。

收集的每一个组分，用苯酚-硫酸方法测总糖和用bca蛋白试剂盒测总蛋白。去除无糖或有蛋白的峰/组分，将其他的峰收集并合并作为多糖组分。

将该多糖组分加入到体积为多糖组分1/4的5m氯化钠溶液中，使最后的氯化钠浓度大于等于1m。并将该含多糖的组分通过疏水层析进行进一步分离。平衡液为用10mmph8.2磷酸钠/1m氯化钠溶液，并收集不附着疏水层析柱的组分。当样品其他组分附着以后，用10mmph8.2的磷酸钠溶液进行线性梯度洗脱，根据导电率，收集先于600mm氯化钠(按照分离设备上显示的导电性曲线来确定)洗脱的多糖组分，并与未附着组分进行合并作为有效总糖组分。

将以上多糖组分通过分子排阻层析脱盐，平衡液选自50mmph8的tris-hcl溶液，并通过0.22μm滤膜过滤除菌和其他不溶性杂质。

实施例4

一种含益生菌提取活性因子的眼用制剂，包括：

实施例5

一种含益生菌提取活性因子的眼用制剂，包括：

实施例6

一种含益生菌提取活性因子的眼用制剂，包括：

实施例7

通过测定氧自由基吸收能力(oxygenradicalabsorbancecapacity,orac)来确定em因子的抗氧化能力。经过测算，3.5μg/ml的em因子相当于150μm的trolox水溶性维生素e的抗氧化能力(表1)，说明em因子具有较强的体外抗氧化能力。表1中使用的em因子按照实施例1方法制备得到。

表1.em因子的抗氧化能力评估(orac)

实施例8

发明人测试了em因子对表皮角质细胞抵御过氧化氢氧化损伤的能力，如图1和2所示，用31.25μg/ml的过氧化氢单独处理神经细胞4小时，会诱发明显的线粒体跨膜电位降低，而单独添加1％浓度的em因子，却不会造成细胞的凋亡(对照组和em处理组没有显著差异，p>0.05)，因此，em因子本身是安全的。而将em因子与h2o2一同添加到细胞中时(em+h2o2组)，em因子可以显著提高细胞的抗氧化能力(h2o2处理组)(p<0.05)。因此，em因子还具有有效防护过氧化氢诱发的细胞氧化损伤的功能。实施例8的使用的em因子按照实施例2方法制备得到。

实施例9

发明人使用uvb照射人晶状体上皮细胞系(sra01/04)，探讨了em因子对p53转录水平的调控，进而证实了em因子对细胞凋亡的抑制作用。如图3所示，经过em因子预处理8小时的人晶状体上皮细胞系(sra01/04)在uvb照射10分钟后，p53的mrna表达量显著低于未处理组的细胞。因此，em因子具有有效抑制细胞凋亡的功能。实施例9的使用的em因子按照实施例3方法制备得到。

实施例10

取按实施例6方法制备得到的洗眼液5ml，倒入备用的硅胶杯，然后将硅胶杯倒扣到目标眼睛，清洗15min，然后取下杯子，杯内可以看到洗出的眼内杂质。通过em因子接触眼球周边环境，可以清除过氧化物，同时减轻炎症的发生，减少红血丝。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。