本发明属于医疗
技术领域：
：，具体涉及非编码小rna基因mir-146a-5p的应用，尤其是mir-146a-5p在制备治疗肠易激综合征患者内脏高敏感性的药物中的应用。
背景技术：
：：肠易激综合征(irritablebowelsyndrome,ibs)是以腹痛或腹部不适并伴有排便习惯改变但无形态学和生化改变为特征的功能性胃肠疾病，ibs病理生理学机制尚未探明，其作为消化系统疾病中最常见的疾病类型之一，已成为影响患者生存质量，加重社会经济负担的重要因素。全球约10％-20％的成年人和青少年存在ibs症状，且以女性居多。多项研究表明，约有30％至40％的ibs患者相较于正常人对于结直肠扩张存在高敏感性症状，主要表现为内脏痛阈下降和(或)对扩张刺激的感知增强。因此，内脏高敏感状态成为部分ibs患者重要的临床特征性表现。microrna被认为是生物体内源性非编码rna，长度约21～23个碱基序列，可靶向结合到具有同源序列的mrna的3′-utr端进而阻止蛋白翻译的进程。近些年来研究发现，microrna在肠易激综合征(ibs)患者中异常表达，从而导致肠道通透性、5-羟色胺信号通路及内脏或躯体高敏感性异常。研究表明，作为最重要的免疫及炎症信号调控microrna分子，mir-146a有助于机体建有立免疫耐受，避免过度炎症反应导致机体组织器官损伤。在肠道相关疾病中，mir-146a在溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，uc)、克罗恩病(crohn′sdisease，cd)、肠炎相关结肠癌(colitis-associatedcolorectalcancer，cac)及婴幼儿嗜酸性肠炎(eosinophiliccolitis，ec)中均有异常表达。mir-146a-5p作为固有免疫通路的重要负向调控分子，被认为参与调控肿瘤、自身免疫疾病的发生发展过程。在肠道疾病中，mir-146a可通过负向调控炎症因子减轻肠道缺血再灌注损伤，介导婴幼儿肠道免疫耐受的形成及促进肠道稳态的建立。目前尚未有关于mir-146a-5p在肠易激综合征疾病内脏高敏感性的诊断和/治疗的相关报道。技术实现要素：针对现有技术存在的问题，本发明公开了小rna基因mir-146a-5p在制备肠易激综合症内脏高敏感性药物中的研究，mir-146a-5p可有效缓解肠易激综合征内脏高敏感性的发生发展。本发明选取了5名肠易激综合征患者(内脏高敏感状态临床表现)及5名健康对照，采集血清并利用qrt-pcr技术检测mir-146a-5p表达水平。同时利用2，4，6-三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonicacid,tnbs)灌肠建立小鼠肠易激综合征疾病模型，取其结肠黏膜qrt-pcr法检测mir-146a-5p表达水平。结果显示，在肠易激综合征患者血清及小鼠疾病模型中，mir-146a-5p表达量显著低于正常对照组。这对于肠易激综合征内脏高敏感性的临床诊断和指导治疗具有重要的参考意义。为进一步探究mir-146a-5p在肠易激综合征内脏高敏感性中的作用，本发明使用hsa-mir-146a-5pagomir灌肠使其在小鼠结肠组织高表达，后进行结肠扩张试验，实验结果显示，tnbs造模后小鼠进行agomir灌肠，其内脏敏感性较tnbs造模后生理盐水灌肠小鼠有所下降，进一步证实mir-146a-5p在肠易激综合征内脏高敏感发生过程中起到保护性作用。具体的，本发明涉及以下技术方案：首先，本发明公开了mir-146a-5p在制备治疗肠易激综合征内脏高敏感性的药物中的应用。本发明提供的mir-146a-5p由以下核苷酸组成：5′-ugagaacugaauuccauggguu-3′。具体的，所述药物为提高mir-146a-5p表达量的试剂或药物。具体的，所述药物为mir-146a-5pagomir。其次，本发明公开了一种治疗肠易激综合征内脏高敏感性的药物组合物，所述药物包含提高mir-146a-5p表达量的试剂或药物，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。本发明所述药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、鼻腔、口腔粘膜、肺和呼吸道、直肠等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。本发明所述药物组合物可以制成普通制剂、也可以制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。例如，为了将本发明所述药物组合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。为了将给药单元制成胶囊剂，可以将药物有效成分与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备胶囊剂。本发明的药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的药物组合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。此外，本发明也可以是mir-146a-5p在制备治疗肠易激综合征内脏高敏感性的药物中的应用。本发明提供的mir-146a-5p由以下核苷酸组成：5′-ugagaacugaauuccauggguu-3′。具体的，所述药物为提高mir-146a-5p表达量的试剂或药物。优选的，所述药物为mir-146a-5pagomir。本发明以上技术方案取得了以下有益效果：本发明所述mir-146a-5p在腹泻型肠易激综合征内脏高敏感患者外周血清及肠易激综合症疾病模型小鼠肠黏膜中低表达，且在肠易激综合征小鼠模型中给予腹腔注射hsa-mir-146a-5pagomir【激动剂】使其在肠道中高表达后，疾病模型小鼠内脏敏感性显著下降，表明mir-146a-5p可有效降低肠易激综合征内脏高敏感性，为肠易激综合征内脏高敏感性的治疗提供了有效的途径。附图说明图1ibs-d患者及健康志愿者血清mir-146a-5p相对表达量。图2各组实验小鼠疼痛阈值测定。具体实施方案应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
：的普通技术人员通常理解的相同含义。需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。内脏高敏感系指内脏组织对各种机械、化学刺激的敏感性增强、反应性增加，包括内脏痛觉过敏、痛觉异常，扩张刺激时结直肠的容量和压力阈值均明显降低。目前ibs内脏高敏感的机制尚未完全明确，可能包括内脏感受器的敏感性增加、感觉传入神经异常和中枢内脏感觉神经元兴奋性增加,此外，内分泌和多种神经递质异常、肠道微生物和低度炎症亦参与ibs内脏高敏感的形成。agomir是经过特殊标记和化学修饰的双链小rna，通过模拟内源性的mirna来调节靶基因的生物学功能。为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。实施例1肠易激综合征患者血清mir-146a-5p表达检测纳入的研究对象肠易激综合征患者5例均为于山东大学齐鲁医院消化内科就诊患者(内脏高敏感状态)，纳入健康对照组共5例为正常健康志愿者。腹泻型肠易激综合征诊断标准参照罗马ⅲ诊断标准。排除标准为：引起腹泻的其他疾病患者(肿瘤、甲状腺疾病、乳糜泻等)；既往有腹部手术史或报警症状者(贫血、消化道出血、明显的体质量减轻、腹部包块)；有凝血功能异常或严重器质性疾病影响心、肝、肾功能者；怀孕或哺乳者。抽取10名受试者静脉血3ml于促凝管中，4℃静置30min,3000rpm离心15min，吸取上层血清于-80℃储存。本实施例采mirnaeasyserum/plasmakit(qiagen)进行血清总microrna提取，all-in-onemirnaqrt-pcrdetectionkit(genecopoeia)进行mir-146a-5p的qrt-pcr检测。按说明书步骤提取血清总microrna，反转录成cdna溶液后，进行qrt-pcr检测。pcr采用10ul体系，反应液体系按照说明书比例配制，反应条件为：预变性95℃10min，40循环(变性95℃10sec退火60℃20sec延伸72℃10sec)，以u6小rna为内参对照，样品设置3个副孔，取平均ct值采用2-δδct进行相对表达量分析。qrt-pcr结果表明，肠易激综合征内脏高敏感性患者血清中mir-146a-5p表达量较正常对照组下调(图1)。实施例2小鼠肠易激综合征疾病模型的建立及agomir干预小鼠禁食24小时，1％戊巴比妥(0.2ml/只)腹腔注射麻醉小鼠，一次性使用肛门管插入小鼠肛门，约距肛门口5cm处注射tnbs(80mg/kg)一次灌肠成模，空白对照组等体积生理盐水灌肠，灌肠后倒置小鼠约30min防止液体流出。agomir干预方法为于tnbs造模后七天开始hsa-mir-146a-5pagomir(3nmol/只)灌肠，每三天灌肠一次，疾病模型对照组及空白对照组均等体积生理盐水灌肠。第28天进行结肠扩张试验评价内脏高敏感性，后处死小鼠取结肠组织进行后续实验。实施例3qrt-pcr检测小鼠结肠组织mir-146a-5p表达水平本实例使用动物组织总rna提取试剂盒(中国北京天根生化科技有限公司)提取结肠组织总rna，具体操作步骤按照说明书进行。按照实例1所述方法进行反转录及qrt-pcr检测。结果表明，肠易激综合征动物疾病模型中有mir-146a-5p含量的降低，使用mir-146a-5pagomir灌肠处理可显著提高结肠组织microrna-146a-5p表达量(表1)。表1各动物实验组结肠组织中microrna-146a-5p相对表达量实施例4结肠扩张试验评价小鼠内脏高敏感性将宠物用双腔导尿管插入小鼠肛门，使球囊约距肛门2cm处，固定，注射器向球囊内注射不同体积的生理盐水(0-0.55ml,以0.05ml递增)进行球囊扩张，每次扩张持续20sec，当第一次引起小鼠疼痛反射(如腹壁肌肉、尾巴收缩)时记录球囊扩张的体积，提示此扩张强度反映小鼠的疼痛感觉阈值。每只小鼠进行3次重复操作，间隔4min。结果表明，肠易激综合征疾病模型小鼠对结直肠扩张试验引起的内脏疼痛的敏感性升高，在疾病进展过程中给予结肠组织microrna-146a-5p高表达干预，可显著缓解内脏敏感性升高的进程(图2)。虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属
技术领域：
：的技术人员，在不脱离本发明之精神和范围内，当可作些许之更动与改进，因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。sequencelisting<110>山东大学齐鲁医院<120>mir-146a-5p在治疗肠易激综合征内脏高敏感性中的应用<130><160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>22<212>rna<213>mir-146a-5p<400>1ugagaacugaauuccauggguu22当前第1页12当前第1页12