本发明属于靶向给药技术领域，涉及一种药物纳米运输载体，具体涉及一种ph控释靶向药物纳米运输载体及其制备方法和应用。
背景技术：
近些年来，随着纳米生物技术的快速发展，智能型有机-无机复合纳米微球子受到科学家们的广泛关注和研究，纳米材料越来越多的在重大疾病的检测与治疗、生物标记、化学催化和分离等诸多领域中体现出了它巨大的优势。其中介孔二氧化硅纳米微球子(msns)就是其中一类重要的代表，在过去几年的科学研究和应用中得到了证实，同时也取得了非常显著的进展。由于介孔二氧化硅具有良好的生物相容性、高比表面积，孔径和孔容可调、孔道均匀、表面易于修饰等优点，非常适合作为抗肿瘤药物的载体，有利于提高药效同时又可以降低药物的毒副作用(small,2010,6,1185–1190,chem.mater.,2007,17,4570–4573,chem.commun.,2010,46,3019–3921)。
对于多功能纳米载体来说，需要结合两个或者更多的组成成分来为生物医学诊断、治疗癌症病变部位提供好的平台。磁性纳米四氧化三铁纳米微球子是具有磁性强记生物相容性好的特点，使其在靶向药物输送、热疗、细胞分离，磁共振成像(mri)等诸多方面具有很多潜在的应用价值。但是，单一的磁性纳米微球子是很容易团聚的，而且不容易去装载药物，当它直接暴露在生物体系中容易被降解，同时单纯的介孔二氧化硅在体外培养几个小时也会很快速的释放药药物使其面临实用性的限制，要克服这些缺点，可以以fe3o4纳米微球子作为核，msio2作为壳形成的核壳结构不仅能克服单一的fe3o4纳米微球子以及msio2纳米微球子的局限性，而且能够提高其在靶向药物控释系统的性能。(acsnano.2010；4:529-39.,chemphyschem,2006,7(2):400-406,journaloftheamericanchemicalsociety,2010,132(31):10623-10625)。
叶酸是无毒、稳定、免疫原性弱，低成本的一种辅酶，叶酸与叶酸受体亲和性高，且具有专一性，叶酸受体在许多恶性肿瘤细胞表面过度表达，而在正常细胞中则几乎不表达或只有少量表迗，科研人员将药物、蛋白质、聚合物等与叶酸连接在一起，利用叶酸的靶向识别向作用，使药物靶向向浓集于肿瘤组织，对肿瘤进行特异性治疗，改善药物的治疗效果。(biomaterials,2016,82:178-193,journalofcontrolledrelease,2016,232:161-174,rscadvances,2016,6(42):35658-35667)。
道诺霉素(dnm)是第一代蒽环类抗肿瘤抗生素，用于各种类型的急性白血病(包括粒细胞性、淋巴细胞性和单核细胞性以及粒-单核细胞性)、红白血病、慢性粒细胞性白血病、恶性淋巴瘤，也可用于神经母细胞病、尤因肉瘤和肾母细胞瘤等。但是可以引起脱发、骨髓抑制和心脏毒性等毒副反应。目前市售的道诺霉素制剂无法区分正常细胞和癌细胞，缺少靶向性，导致其在治疗中对正常细胞有极大的损害。病人在化疗后要忍受药物的各种副反应，其中心脏毒性是不可逆的。
发明人先前报道了fe2+-阿霉素与超顺磁性氧化铁纳米微球子(spion)配位结合(jbiomaterappl.2016；31:261-72)和带有羧基的顺磁性氧化铁纳米微球子(spion)固载卟啉(rscadv.2016；6:103137-48)，在肿瘤ph环境下的释放率达到85％以上，并且在细胞水平上有良好的抗肿瘤效果。众所周知，在抗肿瘤的临床应用中，比较理想的可控药物传输系统不仅要求自身具有良好的生物相容性以及对药物有较高的负载率，还必须满足在血液循环时药物分子的“零释放”，但是到达病灶部位后却能快速而且高效的释放(chemistryofmaterials.2013,25:3030-3037,csappliedmaterials&interfaces.2013,5:1566-1574,macromolecules.2013,46:9169-9180)，然而核壳结构的fe3o4@sio2靶向性单一，在血液循环时难以达到“零释放”的效果，即使现在以介孔二氧化硅为基础的“智能型”药物释放系统，主要是ph值响应药物控释系统(int.j.pharm.2011,421:388～396)、酶响应药物控释系统(langmuir.2014,30:243～249)、光响应控释释放系统(chem.int.ed.2013,52:4375～4379)和温度响应控释释放系统(daltontrans.2014,43:18056～18065)等达到了所谓的“零释放”的效果，但他们大部分使用的有机包覆剂成本较高以及合成方法复杂，因此，寻找一种成本低且合成方法简单的有机包覆剂，结合靶向药物纳米载体控释体系具有重要研究和应用价值。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供一种ph控释靶向药物纳米运输载体及其制备方法和应用，旨在以fe3o4为核，以msio2为壳，在fe3o4@msio2表面上修饰-nh2，然后通过酰胺反应接上靶向受体叶酸(fa)、固载道诺霉素(dnm)，最后用caco3进行封堵，实现ph值响应控释，达到在血液循环中“零释放”的效果，从而降低药物对人体的毒副作用。
为解决上述问题，一方面，本发明在于提供一种ph控释靶向药物纳米运输载体，包括纳米运输载体、固载在纳米运输载体上的抗肿瘤药物和ph控释剂。
进一步地，所述纳米运输载体包括位于核心的fe3o4纳米微球、包覆在纳米微球表面的msio2、fe3o4@msio2纳米微球表面修饰的-nh2和接枝在-nh2上的叶酸。
进一步地，所述纳米运输载体：固载在纳米运输载体上的抗肿瘤药物的质量比为12.81％:1。
进一步地，所述抗肿瘤药物为蒽环类抗生素或卟啉。
进一步地，所述蒽环类抗生素为阿霉素、道诺霉素、伊达比星、米托蒽醌或表阿霉素。
进一步地，所述卟啉为tmpyp、原卟啉、血卟啉或血卟啉单甲醚。
进一步地，所述ph控释剂为msio2、caco3。
进一步地，所述ph控释靶向药物纳米运输载体的直径为10～25nm，核的直径10～20nm，壳的厚度为3～10nm。
在本发明的实施例中，fe3o4纳米微球表面包覆msio2记做：fe3o4@msio2纳米微球；纳米运输载体记做：fe3o4@msio2-fa纳米微球；表面修饰的-nh2的fe3o4@msio2纳米微球记做：fe3o4@msio2-nh2纳米微球；纳米运输载体固载抗肿瘤药物体系记做：fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球；ph控释靶向药物纳米运输载体记做：fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球。
另一方面，本发明在于提供一种ph控释靶向药物纳米运输载体的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1：制备fe3o4纳米微球：在惰性气体氛围中，向fecl3.6h2o和fecl2.7h2o混合物中加入去氧去离子水，搅拌溶解后加热，快速加入氨水后保持反应ph值在10～11，反应结束后利用磁铁吸附分离得到磁性颗粒，用去离子水超声洗涤直至ph值为中性，备用；
步骤2：制备fe3o4@msio2纳米微球：
2a)取步骤1制备的fe3o4纳米微球置于稀盐酸中，超声分散后用水洗至ph值为中性；取处理的fe3o4纳米微球子加入到水/乙醇混合体系中，加入氨水，在快速搅拌下缓慢滴加硅酸四乙酯(teos)，反应得磁流体；
2b)将磁流体用去离子水和乙醇交替洗涤后分散在含有十六烷基三甲基溴化铵(ctab)的去离子水/乙醇混合体系中，然后加入氨水进行超声分散，在室温搅拌下缓慢滴加硅酸四乙酯反应，在外加磁场的作用下分离出磁性纳米微球子，磁性纳米微球子用水和乙醇洗涤后，待用；
2c)取磁性纳米微球子分散在硝酸铵-乙醇溶液中，经超声分散均匀后，加热回流反应，用乙醇和水交替洗涤，洗涤后再重复步骤2c)两次，即得fe3o4@msio2纳米微球；
步骤3：制备fe3o4@msio2-nh2纳米微球：取步骤2所得fe3o4@msio2纳米微球加入到水/乙醇混合体系中，加入氨水搅拌均匀，然后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)进行机械搅拌，反应完成后用乙醇和水交替洗涤，用磁铁吸附收集，即得fe3o4@msio2-nh2纳米微球；
步骤4：制备fe3o4@msio2-fa纳米微球：取步骤3所得fe3o4@msio2-nh2纳米微球分散在dmso后慢慢滴加到活化的叶酸溶液中，搅拌过夜后离心分离收集制得fe3o4@msio2-fa纳米微球；
步骤5：制备fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球：将dnm溶液加入步骤4所得fe3o4@msio2-fa纳米微球中固载，然后固载后离心分离收集底部物质，用蒸馏水清洗后制得fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球；
步骤6：制备fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球：向步骤5制得的fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球中加入氯化钙溶液，放于摇床振摇均匀后，边摇匀边加入碳酸钠溶液，继续摇匀至反应完全，利用磁铁吸附静置分离，去上清液后洗涤，得fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球。
进一步地，所述步骤1中惰性气体氛围是指在氮气氛围中。
进一步地，所述步骤1中搅拌溶解后加热是指加热至80℃，并将搅拌速度控制在6.5krp/min。
进一步地，所述步骤1中氨水为新配制的氨水，具体配制过程为：取1倍体积的浓度为25％的浓氨水稀释到4.16倍体积的氨水。
进一步地，所述步骤1中快速加入氨水保持反应ph在10～11后继续反应30min。
进一步地，所述步骤1中用去离子水超声洗涤的次数为3～4次。
进一步地，所述步骤2a)中稀盐酸的浓度为0.1mol/l。
进一步地，所述步骤2a)中超声分散时间为10min。
进一步地，所述步骤2a)中水/乙醇混合体系为体积比为3/7的水/乙醇混合体系。
进一步地，所述步骤2a)中氨水浓度为25～28％。
进一步地，所述步骤2a)中反应得磁流体的反应时间为24h。
进一步地，所述步骤2a)中fe3o4纳米微球与teos的反应的质量比为25:7。
进一步地，所述步骤2b)中去离子水/乙醇混合体系为体积比为1/1的去离子水/乙醇混合体系。
进一步地，所述步骤2b)中氨水浓度为28％。
进一步地，所述步骤2b)中超声分散的时间为10min。
进一步地，所述步骤2b)中反应的时间为6h。
进一步地，所述步骤2c)中硝酸铵乙醇溶液的浓度为10mg/ml。
进一步地，所述步骤2c)中加热回流的温度为80℃，回流过程中搅拌速度控制在200rpm/min，回流反应的时间为6h。
进一步地，所述步骤3中水/乙醇混合体系为体积比为1/15的水/乙醇混合体系。
进一步地，所述步骤3中氨水的浓度为28％，所述搅拌的时间为30min。
进一步地，所述步骤3中机械搅拌的时间为4h。
进一步地，所述步骤4中活化的叶酸溶液的制备方法如下：叶酸溶于dmso中后加入edc.hcl和sulfo-nhs，惰性气体氛围室温搅拌，得到活化的叶酸溶液。
进一步地，所述步骤4中活化的叶酸溶液的制备方法中惰性气体氛围室温搅拌是指在氮气氛围中室温搅拌3h。
进一步地，所述步骤4中搅拌过夜的时间为14～18h。
进一步地，所述步骤4中fe3o4@msio2-nh2纳米微球与叶酸的质量比为1:4。
进一步地，所述步骤5中dnm溶液的浓度为0.14～0.86mg/ml。优选为0.65mg/ml。
进一步地，所述步骤5中固载在摇床上进行，摇床的速度为180rp/min，固载时间为24h。
进一步地，所述步骤5中蒸馏水清洗次数为2～3次。
进一步地，所述步骤6中氯化钙溶液浓度为8mmol/l。
进一步地，所述步骤6中碳酸钠溶液浓度为8mmol/l。
进一步地，所述步骤6中加入氯化钙溶液后放于摇床振摇时间为10min以上。
进一步地，所述步骤6中边摇匀边加入碳酸钠溶液时采取加入1～5滴碳酸钠溶液摇匀一次的速度进行。
进一步地，所述步骤6中继续摇匀至反应完全的时间为1h以上。
进一步地，所述步骤6中去上清液后洗涤次数为2～3次。
本发明所述室温是指常温，具体可以是20～40℃。
另一方面，本发明提供一种ph控释靶向药物纳米运输载体在制备预防和治疗癌症疾病药物中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供一种ph控释靶向药物纳米运输载体及其制备方法和应用，所述ph控释靶向药物纳米运输载体以fe3o4为核、msio2为壳，在fe3o4@msio2表面上修饰-nh2，然后通过酰胺反应接上靶向受体叶酸(fa)、固载道诺霉素(dnm)，最后用caco3进行封堵，实现ph值响应控释，达到在血液循环中“零释放”的效果，从而降低药物对人体的毒副作用。本发明ph控释靶向药物纳米运输载体结合msio2良好的生物相容性、高比表面积，表面易于修饰等优点包裹fe3o4纳米微球子，通过氨基(-nh2)修饰后接枝靶向受体叶酸，利用磁靶向和受体靶向所产生的多重靶向性，提高靶向药物的抗癌性能，明显要优于单一靶向性，通过利用碳酸钙在生理ph的稳定性，提高靶向药物控释系统的性能。具体表现如下：
首先，通过将fe3o4的磁靶向和叶酸受体靶向相结合，提高抗癌药物对阳性叶酸受体细胞(例如乳腺癌，卵巢癌，肺癌，肾癌，子宫内膜癌)的靶向能力，同时超顺磁性氧化铁作为一种新型的mri造影剂，可以进行时时监控。
其次，caco3作为人体骨骼的主要无机成分，具有来源广，便宜。在生理的ph值环境下保持完整，而在一些ph值较低的环境下(例如：溶酶体内ph5-6，炎症部位ph3-5)下溶解，而且溶解产物(ca2+,co32-)无毒，实现有效的抑制药物在血液循环中提前释放，在肿瘤部位(病灶部位)高效且快速的释放的目的。
第三，本发明所制备的ph控释靶向药物纳米运输载体水溶性好，粒径在100nm以下，分散性较好，载药量高，在肿瘤环境下释放药物量大且能够持续很长时间，而在正常生理环境下释放药物量非常小。
本发明的制备方法简单易行，制备条件温和原材料经济来源广，产物易得，可靠，后处理简单，适合批量生产。
附图说明
图1ph控释靶向药物纳米运输载体的合成流程图。
图2ph控释靶向药物纳米运输载体作用机理图；
图中，tomurcell癌细胞，nucleus核，endosome/lysosome内体/溶酶体，folatereceptors叶酸受体。
图3红外光谱图谱；
图中，transmittance透过率，wavenumber波长，(a)fe3o4@msio2纳米微球，(b)fe3o4@msio2-fa纳米微球，(c)fe3o4@msio2-nh2纳米微球，(d)fa。
图4fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球电镜图。
图5fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球电镜图。
图6fe3o4@msio2-fa的孔径图；
图中poresize：孔径，cumulative累积，dv/dw表示孔微分分布，stp表示孔积分体积。
图7缓释图；
图中，a和c分别代表fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球在ph＝5.6和ph＝7.4的条件下的缓释曲线；b和d分别代表fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球在ph＝5.6和ph＝7.4的条件下的缓释曲线；cumulativerelease累积释放，time时间。
图8生物相容性图；
其中，图a为fe3o4@msio2-caco3纳米微球对hela细胞的生物相容性图；图b为fe3o4@msio2-fa-caco3纳米微球对hela细胞的生物相容性图；
图c为fe3o4@msio2-caco3纳米微球对a549细胞的生物相容性图；图d为fe3o4@msio2-fa-caco3纳米微球对a549细胞的生物相容性图；
图中，cellviability细胞活性，concentration浓度。
图9a游离dnm、fe3o4@msio2-dnm-caco3、fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3对hela细胞的mtt图；
图9bfe3o4@msio2-fa-dnm-caco3在叶酸培养基和不含叶酸的培养基条件下对hela细胞的mtt图；
图9c游离dnm、fe3o4@msio2-dnm-caco3、fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3(不含叶酸的培养基条件下)、fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3(含叶酸的培养基条件下)的ic50图；
图中，cellviability细胞活性，concentration浓度，ic50半抑制浓度。
图10实施例2固载道诺霉素的固载率图；
图中：loadingcapacity固载率，concentration浓度。
图11fa、fe3o4@msio2与fe3o4@msio2-fa紫外表征图；
图中，absorbance吸光度，wavelength波长。
图12fe3o4@msio2、fe3o4@msio2-nh2与fe3o4@msio2-fa电荷图；
图中，zatapotential电势。
图13hela细胞摄取游离dnm溶液和负载dnm纳米微球溶液的荧光强度值；
图中，mfi荧光强度。
图14a549细胞摄取游离dnm溶液和负载dnm纳米微球溶液的荧光强度值；
图中，mfi荧光强度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1ph控释靶向药物纳米运输载体fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球的制备
具体制备过程可参考图1，流程如下：
步骤1：fe3o4纳米微球的制备
首先称取1.99gfecl3.6h2o和0.99gfecl2.7h2o(fe2+：fe3+摩尔比大约为2：1，fe2+的稍微过量，因fe2+容易被氧化)于250ml的圆底烧瓶中，通入一会氮气后加入100ml去氧去离子水，搅拌溶解，在加热油浴锅里加热到80℃，搅拌转速为6.5krp/min，迅速加入新配制的氨水(取25％的浓氨水12ml，稀释到50ml)，用ph试纸测试ph范围，保持反应ph值在10～11；液体立刻变成黑色，继续反应30min；待反应结束后利用磁铁吸附分离将磁性颗粒吸附到烧瓶底部，用去离子水超声重复洗涤3-4次，直至ph为中性，备用。
步骤2：制备fe3o4@msio2纳米微球
a.取200mg步骤1制备的fe3o4纳米微球于50ml～100ml的0.1m的稀盐酸中，超声分散10min后，4～5次水洗至ph值为中性；
b.将步骤a处理的fe3o4纳米微球加入到含有60ml水和140ml乙醇的500ml圆底烧瓶中，然后加入2ml氨水(浓度为25～28％)，接着在快速搅拌下缓慢滴加0.08ml的硅酸四乙酯(teos)，反应24h得磁流体；
c.取步骤b制得的磁流体，用3ml去离子水和3ml乙醇交替洗涤，除去多余的反应物和杂质；
d.将洗涤后的磁流体分散在含有350mg十六烷基三甲基溴化铵(ctab)的70ml去离子水和70ml乙醇的混合溶液中，然后加入1.5ml浓度为28％的浓氨水，进行超声分散10min，在室温的搅拌下缓慢滴加0.2ml硅酸四乙酯(teos)反应6h，反应结束后在外加磁场的作用下分离出磁性纳米微球子，反复3～4次用水和乙醇交替洗涤，待用；
e.取100mg步骤d制得的磁性纳米微球子，分散在50ml的硝酸铵-乙醇溶液中(浓度为10mg/ml)，经超声分散均匀后，80℃加热回流，搅拌速度控制在200rpm/min，反应6h，然后用5ml乙醇和5ml水交替洗涤3次，重复步骤e试验2次，即得fe3o4@msio2纳米微球，其红外图谱如图3中(a)所示，其紫外表征图如图11所示，其电荷图如图12所示。
步骤3：制备fe3o4@msio2-nh2纳米微球
取80mg步骤2所得fe3o4@msio2纳米微球加入到含有10ml水和150ml的乙醇溶液的圆底烧瓶中，加入2ml浓度为28％的氨水，搅拌30min，然后加入1ml3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)，机械搅拌4h，然后用3ml乙醇和3ml水交替洗涤3次，用磁铁吸附收集，即得fe3o4@msio2-nh2纳米微球，其红外图谱如图3中(c)所示，其电荷图如图12所示。
步骤4：制备fe3o4@msio2-fa纳米微球
将0.1g叶酸溶解到30ml的dmso中，然后加入0.0575g的edc.hcl和0.1151gsulfo-nhs(n-羟基硫代琥珀酰亚胺)，通入氮气，在氮气氛围下密闭室温搅拌3h，待叶酸充分活化得活化的叶酸溶液；
取25mg步骤3所得fe3o4@sio2-nh2纳米微球分散在10mldmso中，然后慢慢滴加到活化的叶酸溶液中，将混合溶液搅拌过夜(14～18h)，离心分离收集制得fe3o4@msio2-fa纳米微球，其红外图谱如图3中(b)所示，其孔径图如图6所示，其紫外表征图如图11所示，其电荷图如图12所示。
步骤5：制备fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球，即：固载道诺霉素(dnm)
取10mg步骤4所得fe3o4@msio2-fa纳米微球于试管中，加入5mldnm溶液(浓度0.65mg/ml)，放在摇床(180rp/min)固载24小时，然后离心去上清液，测出上清液的浓度，计算出固载药物的量。本实施例中固载率为12.81％；将固载后的磁流体上清液倒回回收瓶，然后用5ml蒸馏水清洗磁流体2～3遍，制得fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球，其电镜图如图4所示。
步骤6：制备fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球，即：进行caco3封堵
a分别配制8mmol/l的cacl2水溶液和8mmol/l的na2co3水溶液(称取氯化钙0.0178g、碳酸钠0.0170g，分别加入20ml水配制成20ml溶液即得)。
b.步骤5制得fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球加入5ml氯化钙溶液，放于摇床振摇均匀，至少振摇10分钟以上；
c.往步骤b试管中加入5ml的碳酸钠溶液，边手动摇匀边加入(采取每加入1～5滴摇匀一次的方式)直至完成，再将试管放于摇床继续摇匀至反应完全，至少反应1个小时；
d.反应完全后，取出试管，利用磁铁吸附静置分离，去上清液(封堵后，上清液的颜色一般情况下呈紫色)，然后用5ml蒸馏水清洗2～3遍，得fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球，直径为10～25nm，核的直径10～20nm，壳的厚度为3～10nm，其电镜图如图5所示。
实施例2固载道诺霉素(dnm)的量的实验
取10mg实施例1步骤4所得的fe3o4@msio2-fa纳米微球于试管中，加入5mldnm溶液，所述dnm溶液浓度分别为0.14、0.33、0.49、0.65、0.86mg/ml，放在摇床(180rp/min)固载24小时，然后离心去上清液，测出上清液的浓度，计算固载率，找出最佳固载浓度。具体的实验结果如图10所示。
从图10可以看出，随着dnm溶液浓度的增加，固载率也相应的增加，且在浓度0.86mg/ml时固载率增加速度已经趋向平行，后续采取在dnm溶液浓度为0.65mg/ml时进行固载。
实施例3缓释实验
将fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球和fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球分别置于盛有10ml的pbs缓冲溶液的试管中，所述pbs缓冲溶液的ph分别为5.6和7.4；将试管放入37℃恒温摇床上持续振荡(180rmp/min)，在特定的时间(1、2、4、6h…..)内取出3ml释放液，再分别加入3ml新鲜的pbs缓冲溶液，测定在ph＝5.6和ph＝7.4的pbs缓冲溶液条件下的累计释放量。具体结果如图7所示。
从图7可知，fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球和fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球在ph＝5.6的pbs缓冲溶液条件下累计释放量比ph＝7.4的pbs缓冲溶液条件下多；在相同的pbs缓冲溶液条件下，fe3o4@msio2-fa-dnm纳米微球的累计释放量比fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球多，可见caco3的封堵效果。
实施例4细胞生物相容性实验
fe3o4@msio2-caco3纳米微球和fe3o4@msio2-fa-caco3纳米微球的制备过程参考实施例1的制备过程。
fe3o4@msio2-caco3纳米微球和fe3o4@msio2-fa-caco3纳米微球的细胞毒性通过体外mtt实验检测，具体实验过程如下：首先将hela细胞和a549细胞以5000个/孔的密度接种于96孔培养板中，使用含10％胎牛血清(fbs)的dmem培养基在co2培养箱中37℃培养24h，然后移除培养基，再加入200μg/ml分别含fe3o4@msio2-caco3纳米微球和fe3o4@msio2-fa-caco3纳米微球的培养基。不同浓度的纳米微球溶液通过用dmem培养基连续稀释制备，浓度为12.5、25、50、100、200μg/ml。将细胞与纳米微球培养48h后，通过mtt法在490nm下检测细胞存活率。具体实验结果如图8所示。
从图8可以看出，fe3o4@msio2-caco3纳米微球溶液浓度达到200ug/ml时，对细胞没有表现出毒性，fe3o4@msio2-fa-caco3纳米微球浓度达到200ug/ml时，hela细胞存活率达到了78％，表现较高的细胞存活率，而a549细胞的存活率更是达到了95％以上，说明纳米微球对hela细胞和a549细胞的生物相容性好。
实施例5溶血试验
取新鲜抗凝人血4ml，加入5ml生理盐水进行稀释，待测样品分为实验组、阳性对照组、和阴性对照组，其中阳性对照组用去离子水，阴性对照组用生理盐水，每组设三个平行实验，将1ml新制浓度为0.125mg/ml和0.25mg/ml的fe3o4@msio2-fa的纳米微球悬浮液放入37℃水浴锅中30min，再取1m稀释血液加入到纳米微球悬浮液中并震荡下放入37℃水浴锅中60min，1000*g离心5min，然后去上清液，在545nm处测紫外吸光度，计算材料的溶血，结果如表1所示。
表1fe3o4@msio2-fa纳米微球溶血实验结果
根据公式溶血率(％)＝(待测样品吸光度均值-阴性对照吸光度)/(阳性对照吸光度均值-阴性对照组)*100％，计算的0.125mg/m、0.25mg/mfe3o4@msio2-fa纳米微球的溶血率分别为1.97％、4.21％，符合溶血率<5％的要求，符合医用材料的溶血率<5％的要求。
实施例6细胞摄取实验
实验步骤：采用流式细胞技术观察载药纳米微球的细胞摄取情况。取对数生长期的子宫癌细胞(hela)和肺癌细胞(a549)，用含edta的胰酶消化后，取出edta的胰酶，加入含血清的培养基吹打分散均匀，制成细胞悬浮液(1.0×105个/ml)，取1.5ml接种于6孔板细胞培养板中。培养板置于含5％co2的37℃的培养箱中孵育24h，使细胞贴壁生长。去除细胞液，分别加入游离的dnm溶液、fe3o4@msio2-dnm-caco3纳米微球、fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球溶液，dnm的终浓度为0.5ug/ml，孵育4h后，将培养基吸出，加入pbs溶液洗涤三次，以除去游离的药物分子和纳米微球。每个孔加入0.5ml的胰酶，消化1min后加入1ml含血清培养基终止消化，吹打均匀后，将细胞悬浮液在2000rmp下离心3min，除去上清液，加入pbs清洗3遍，再离心分离成细胞悬浮液，至于流式管中测定，细胞计数为1000个。
实验分析：如图13～14所示，采用流式细胞技术观察dnm被摄取的情况进行分析。经对fe3o4@msio2-dnm-caco3纳米微球、fe3o4@msio2-dnm-fa-caco3纳米微球负载的dnm分析，可知经叶酸修饰的fe3o4@msio2-dnm-fa-caco3纳米微球在叶酸受体阳性表达的hela细胞中dnm的摄取量明显高于没有叶酸修饰的fe3o4@msio2-dnm-caco3纳米微球；而相应地，fe3o4@msio2-dnm-fa-caco3纳米微球和fe3o4@msio2-dnm-caco3纳米微球在叶酸受体阴性表达的a549细胞中dnm的摄取量没有很明显的差别，这说明fe3o4@msio2-dnm-fa-caco3纳米微球对阳性受体的hela细胞具有靶向性。
实施例7细胞存活率的测定
通过mtt实验测定游离dnm、fe3o4@msio2-dnm-caco3纳米微球和fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球对hela细胞的抗增殖效力，为了检测叶酸修饰的纳米微球对hela细胞的靶向性，设置了含1mmol/l叶酸培养基和不含叶酸培养基进行培养。作用机理如图2所示，具体实验过程如下：首先hela细胞以5000个/孔的密度接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的dmem培养基于37℃，5％co2条件下培养24h，然后每孔中加入不同浓度的游离dnm、fe3o4-msio2-dnm-caco3纳米微球和fe3o4-msio2-fa-dnm-caco3纳米微球，dnm的终浓度分别为0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.06μg/ml、0.03μg/ml，培养24h，每个浓度设置5个对照孔。药物处理结束后，细胞与mtt(5mg/ml)培养4h，形成的甲瓒(formazan)沉淀后溶解于150μldmso，最后用酶标仪在490nm波长下测定其吸光度值。具体结果如图9a～9c所示。
从图9a可以看出，随着dnm的浓度的增加，fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球相比于fe3o4@msio2-dnm-caco3纳米微球和游离的dnm表现出更强的肿瘤抑制效果，说明fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球具有靶向效果。
为了进一步证明叶酸的靶向效果，在含有1mmol叶酸培养基和无叶酸培养基的条件下，对fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球的抗肿瘤活性进行调差，图9b可以看出在不含叶酸的培养基条件下fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球的抗肿瘤活性比含有叶酸的抗肿瘤活性更显著，因为含有叶酸的培养基hela细胞上面叶酸受体具有竞争性，说明fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球具有叶酸靶向性和更好的抗肿瘤的效果。
游离的dnm、fe3o4@msio2-dnm-caco3纳米微球、fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球(不含叶酸的培养基条件下)、fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球(含叶酸的培养基条件下)在mtt实验的ic50值如图9c所示，可见在不含有叶酸的培养基中fe3o4@msio2-fa-dnm-caco3纳米微球的ic50值更小，具有更好的抗肿瘤效果。
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