一种靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及肿瘤诊疗试剂领域，具体而言，涉及一种靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂及其制备方法和应用。

背景技术：

近年来，肿瘤光学治疗因其具有非侵入和肿瘤靶向的优势特征而逐渐成为癌症治疗的研究热点。肿瘤光学治疗主要包括光动力治疗(pdt)和光热治疗(ptt)。其中，光动力治疗基于光、光敏剂(ps)和氧气三者之间的协同作用，利用激光的组织穿透性，使富集于肿瘤组织中的光敏剂吸收激光能量后将氧气转化为活性氧簇(ros)，从而诱导肿瘤细胞凋亡或坏死。与传统治疗方法相比，光动力治疗利用光源的靶向性来选择性地消除肿瘤，避免对正常组织的损伤；还能激活机体免疫功能，减少肿瘤的转移和复发；另外，该方法适用于多种类型的肿瘤治疗，应用广泛。同时，光动力治疗也因其非侵入、靶向、安全的巨大优势而被美国fda正式批准应用于肿瘤的局部治疗。

尽管人们可通过对光、光敏剂和氧气三种元素进行设计和调控，从而实现时空可控的光动力治疗，但是，传统的光动力治疗还存在着局限性和技术瓶颈而限制其在临床中的应用。

近年来，纳米技术的发展为肿瘤的精确定位和早期诊断、靶向、长效和联合治疗提供了重要的研发平台，并为克服传统光敏剂所面临的缺乏靶向、光漂白、光毒性、治疗深度不足、氧气依赖等瓶颈问题提供了解决的可能。发展靶向、安全、高效和肿瘤缺氧微环境调控型的纳米光敏剂已成为现今光动力治疗领域的重要研究方向。

首先，纳米光敏剂可以通过靶向配体及借助于肿瘤组织的高通透性和滞留性效应(epr)和纳米载体表面的靶向分子，以实现主动、被动或集成靶向，从而提高光敏剂在肿瘤组织中的富集效率，增强光动力疗效；还可以通过可控释放策略降低光敏剂的光毒性，避免光敏剂发生光漂白而降低光动力疗效。其次，与紫外光和可见光相比，近红外光(nir，波长范围700～1300nm)能避免体内干扰而具有较高的组织穿透深度(10～15mm)。

例如，现有技术中，han等人合成了具有nir吸收的咔唑-氟硼吡咯光敏剂，并利用可降解的聚乳酸-聚乙二醇-叶酸(pla-peg-fa)聚合物进行包覆，从而提高了光敏剂的水溶性、肿瘤靶向能力和单线氧产率，实现了超低nir功率密度的光动力治疗。同时，陈华兵等人则利用铂的重原子效应和d-d过渡态诱导氟硼吡咯产生超低辐射跃迁，显著地提高了光敏剂的单线氧产率和光热转换效率，实现nir触发的光动力/光热协同治疗。

肿瘤缺氧微环境不仅促使肿瘤生长、转移，还大幅降低光动力治疗的有效性。因而，调控肿瘤缺氧微环境也成为肿瘤光动力治疗的新策略。现有技术中，施剑林等人制备的负载ucnps的二氧化锰(mno2)纳米片实现了肿瘤微环境响应的上转换发光成像引导的氧增强光动力治疗、放疗协同治疗，其作用机理是mno2纳米片在存在h2o2的肿瘤酸性微环境中产生大量氧气，从而有效地提高肿瘤缺氧区的氧分压，并显著地增强了光动力治疗和放疗对缺氧肿瘤的协同杀伤作用，从而达到抑制缺氧肿瘤生长、侵袭和转移的目的。

目前临床可使用的光敏剂主要为小分子光敏剂如酞菁类、卟吩和卟啉的衍生物。这些光敏剂普遍存在缺乏靶向性、代谢快、易光漂白、光毒性、激发波长在紫外或可见光区域而无法用于深部肿瘤治疗等问题。因此，如何特异性靶向、性能优异的光敏剂是肿瘤光动力/光热治疗领域解决的首要关键问题。另外，氧气是利用传统光敏剂进行光动力治疗过程中不可或缺的一部分。但是，肿瘤缺氧会导致光动力疗效不足，而光动力耗氧又加剧了肿瘤局部缺氧，从而进一步降低光动力治疗的效果。肿瘤缺氧微环境不仅促使肿瘤生长、转移，还大幅降低了光动力疗效，成为肿瘤难以治愈的根本原因。因此，如何调控肿瘤缺氧微环境成为高效肿瘤光动力治疗解决的另一个关键问题。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂的制备方法，所述制备方法工艺简便，且所制得的纳米光敏剂具有良好的靶向性和肿瘤治疗效果。

本发明的第二目的在于提供一种由本发明方法所制备的靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂，本发明纳米光敏剂具有良好的生物活性以及靶向作用，不仅能够改善肿瘤缺氧环境，同时还具有光热和光动力治疗效果。

本发明的第三目的在于提供一种所述的靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂的应用。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：官能化聚合物通过自组装包覆于磁性氧化锰颗粒的表面，然后与近红外染料分子反应，即得到靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂；其中，所述磁性氧化锰纳米颗粒为mno@油胺、mno@油酸、mno@十四烷基膦酸、mno@硬脂酸，或者mno@十八胺中的一种；

优选的，本发明所述制备方法中，所述磁性氧化锰纳米颗粒为mno@油胺。

优选的，本发明所述制备方法中，所述官能化聚合物为官能化两亲性聚合物；更优选的，所述官能化聚合物为氨基官能化两亲性聚合物。

优选的，本发明所述制备方法中，所述官能化聚合物为psma-peg-nh2；更优选的，所述peg为peg2000。

优选的，本发明所述制备方法包括如下步骤：将氨基官能化聚乙二醇与聚苯乙烯马来酸酐混合反应，纯化后得到psma-peg-nh2。

优选的，本发明所述制备方法中，所述近红外染料分子结构如下：

其中，式(i)中，r1、r2、r3、r4、r5、r6分别独立的为氢、c1～c30的直链或支链的烷基，c1～c30的直链或支链的取代烷基，c5～c30的芳基或取代芳基，c6～c30的烷基芳基或芳基烷基；r7、r8、r9分别独立的为c0～c30的直链或支链的亚烷基，c0～c30的直链或支链的取代亚烷基，c5～c30的芳基或取代亚芳基，c6～c30的亚烷基芳基、取代亚烷基芳基或亚芳基烷基、取代亚芳基烷基；x1、x2分别独立的为f、cl、br，或者i；x3、x4分别独立的为氨基、羟基，或者羧基；m、n分别独立的为0-4的整数。

优选的，本发明所述制备方法式(i)中，r1、r2、r3、r4、r5、r6分别独立的为氢、c1～c30的直链或支链的烷基，c1～c30的直链或支链的取代烷基；r7、r8、r9分别独立的为c0～c30的直链或支链的亚烷基，c0～c30的直链或支链的取代亚烷基；x1、x2分别独立的为cl、br，或者i；x3、x4分别独立的为氨基、羟基，或者羧基；m、n分别独立的为0～4的整数。

优选的，本发明所述制备方法中，所述近红外染料分子结构如下：

同时，本发明还提供了由本发明所述的制备方法得到的靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂。

进一步的，本发明也提供了所述靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂在制备肿瘤靶向治疗药物中的应用；和/或，所述的靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂在分离蛋白和/或肿瘤细胞中的应用；和/或，所述的靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂在活体和/或细胞成像中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂具有良好的生物相容性，可生物降解并通过正常的生理途径吸收或排出体外，不会产生任何毒副作用；

(2)肿瘤细胞有机阴离子转运蛋白(oatp)受体过表达，有机染料分子基团ir808具有主动靶向肿瘤细胞的功能；

(3)mno纳米颗粒既可以作为催化剂也可以作为反应剂与肿瘤微环境内源性h⁺/h2o2响应，缓解肿瘤微酸环境，改善肿瘤缺氧环境；

(4)在近红外激光的辐射下，本发明靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂能够通过产生ros以杀死肿瘤细胞，并且同时具有光热和光动力治疗效果；

(5)本发明靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂能够实现多模拟态成像；

(6)本发明制备方法工艺简便，适于推广并规模化生产。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例制备反应流程图；

图2为本发明实施例mno@oa纳米颗粒的形貌及表征图；

图3为本发明实施例psma-peg2k-nh2的结构表征图；

图4为本发明实施例ir808@mno纳米光敏剂形貌特征及性质表征图；

图5为生物对比测试实验。

其中，图2中，(a)为mno@oa透射电镜图；(b)为mno@oa能谱元素分析图；(c)为mno@oa紫外吸收光谱图；(d)为mno@oax射线衍射物相分析图；

图3中，(a)为psma和psma-peg2k-nh2傅立叶红外吸收光谱曲线图；(b)psma-peg2k-nh2核磁氢谱图；

图4中，(a)为ir808@mno透射电镜图；(b)为ir808@mno紫外吸收和荧光光谱图；(c)为ir808@mno粒径分布图(d)为ir808@mnozeta电位分布图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

有鉴于现有的光敏试剂在肿瘤诊疗过程中所存在着的缺乏靶向性以及难以调控肿瘤缺氧微环境等技术问题，本发明特提供了一种新型靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂，从而实现肿瘤的靶向光热/光动力治疗。

具体的，本发明所提供的新型靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂的制备方法可参考如下：

官能化聚合物通过自组装包覆于磁性氧化锰颗粒的表面，然后与近红外染料分子反应，即得到靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂；

其中，官能化聚合物在磁性氧化锰颗粒的自组装包覆实际上也是一种官能化聚合物与磁性氧化锰颗粒的复合反应，官能化聚合物通过自组装以粘附于磁性氧化锰纳米颗粒的表面，并对磁性氧化锰纳米颗粒进行包覆；而包覆在磁性氧化锰纳米颗粒表面的官能化聚合物的再通过其表面官能基团与近红外染料分子上对应官能基团的偶联反应，实现与近红外染料分子的化学键和；

优选的，磁性氧化锰纳米颗粒与官能化聚合物反应复合是将二者加入溶剂中，然后再向溶剂中充气(优选的为充入氮气)，以进行官能化聚合物在磁性氧化锰纳米颗粒表面的自主装复合反应，并使得官能化聚合物的非官能化的一端通过物理作用强烈粘附于磁性氧化锰纳米颗粒的表面；而在进一步的反应中，官能化聚合物的官能基团与近红外染料分子上对应的官能团发生键合反应，从而实现磁性纳米颗粒与近红外染料分子的有机结合；

优选的，近红外染料分子的键合反应是在活化剂作用下进行的，例如，当官能化聚合的官能基团为氨基或羧基，而近红外染料分子上的官能基团为对应的羧基或氨基时，可以以edc和/或nhs为活化剂，从而促进酰胺键的形成，并使得反应条件更加温和；而当官能化聚合的官能基团为羟基或羧基，而近红外染料分子上的官能基团为对应的羧基或羟基时，则可以以edc和/或dmap为活化剂，从而促进酯键的形成，并使得反应条件更加温和。

而由如上方法所制备的靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂中，官能化聚合物是通过自组装包裹于磁性氧化锰纳米颗粒的表面，具体的，其一端粘附于磁性氧化锰纳米颗粒的表面，形成复合结构，其另一端通过官能团反应，与近红外染料分子对应的官能基团键合。

即，本发明所提供的靶向特异性响应肿瘤微环境纳米光敏剂，是一种以官能化聚合物为连接基团，将磁性氧化锰颗粒与近红外染料分子结合所形成的复合结构颗粒材料纳米光敏剂。

而上述光敏剂中，磁性氧化锰纳米颗粒结构部分可以对于肿瘤微环境h⁺/h2o2产生特异性响应，并催化产生氧气；具有光敏活性的近红外染料分子结构部分利用激光组织的穿透性，在吸收激光能量后，将产生的氧气转化为活性氧簇，从而诱导肿瘤细胞凋亡或坏死，从而起到肿瘤诊疗的治疗的效果，同时，由于近红外染料分子也具有良好的肿瘤细胞靶向性作用，而这些都使得本发明光敏剂不仅具有良好的靶向性性能，同时还能够起到改善肿瘤缺氧微环境的作用，起到高效的肿瘤光动力治疗效果。

其中，所述磁性氧化锰纳米颗粒为mno@油胺、mno@油酸、mno@十四烷基膦酸、mno@硬脂酸，或者mno@十八胺中的一种；优选的，所述磁性氧化锰纳米颗粒为mno@油胺；

而mno@油胺的制备可参考现有技术，其步骤可优选的参考如下：

将二价锰盐(优选的为mn(oac)2)、油胺(oleyamine,oa)，以及溶剂(优选的为二苯醚)混合溶解，然后优选的在氮气保护条件下，进行加热反应；反应中，油胺作为还原剂配体和还原剂，将mn(oac)2反应分解为mno@油胺；

加热反应优选的可以按照如下方法进行：在氮气保护条件下，将二价锰盐、油胺以及溶剂的混合物以120℃电热套加热0.5h，除去水分；然后以10℃/min的速度升温至280℃，并搅拌1h后停止加热，溶液冷却至室温；

加热反应所得产物还需进一步进行后处理，从而得到mno@油胺纳米颗粒，后处理的步骤可优选的参考如下：向加热反应后体系中加入乙醇，从而将合成的纳米颗粒进行沉淀，然后离心过滤，得到mno@油胺纳米颗粒，其粒径为20nm左右；

优选的，所得mno@油胺纳米颗粒还要进一步溶于有机溶剂(优选的为氯仿)中，得到有机相mno@油胺纳米颗粒，并以其为原料进行后续的合成反应。

其中，所述官能化聚合物为氨基、羟基或羧基官能化聚合物；优选的，所述官能化聚合物为官能化两亲性(包括疏水基和亲水基)聚合物；更优选的，所述官能化两亲性聚合物的官能团在亲水基的一端；进一步优选的，所述官能化聚合物为氨基官能化两亲性聚合物；更进一步优选的，所述官能化聚合物为psma-peg-nh2，优选的，所述peg为peg2000。

而当所述官能化聚合物为优选的官能团在亲水基的两亲性聚合物时，磁性氧化锰纳米颗粒与官能化聚合物复合反应可参考如下：

将官能化聚合物在有机溶液中溶解，然后加入分散于有机溶液中磁性氧化锰纳米颗粒，并加入水(优选的为超纯水)，然后将此混合溶液充入氮气进行复合反应，反应过程中，官能化聚合物的疏水端会强烈粘附在磁性氧化锰纳米颗粒的表面，即通过自主装对磁性氧化锰纳米颗粒进行配体包裹，而官能化聚合物的亲水端会分散水相溶液中,而由这种方法所制备的水相磁性氧化锰纳米颗粒具有良好的分散性，且均一性好，不易发生聚沉。为了提高原料纯度，还可以将产物进行纯化，然后再将纯化后的产物作为原料与近红外染料分子进行键合反应。

同时，最优选的官能化聚合物psma-peg-nh2的制备方法可优选的参考如下：将氨基官能化聚乙二醇与聚苯乙烯马来酸酐混合反应，纯化后得到psma-peg-nh2。

如上所述反应中，原料氨基官能化聚乙二醇优选的为nh2-peg-nh-r，其中r基为氨基保护剂，例如可以为cbz(苄氧羰基)、boc(叔丁基氧羰基)、fmoc(芴甲氧羰基)、alloc(烯丙氧羰基)、teoc(三甲基硅乙氧羰基)、pht(邻苯二甲酰基)、tos(对苯磺酰基)、tfa(三氟乙酰基)、ns(邻(对)硝基苯磺酰基)、trt(三苯甲基)、dmb(2,4-二甲氧基苄基)、pmb(对甲氧基苄基)，或者bn(苄基)等中的一种；优选的，所述r基为boc；

同时，nh2-peg-nh-r中所述peg优选的为peg2000；

而以氨基官能化聚乙二醇nh2-peg-nh-r为原料的上述制备反应优选的可以进一步包括如下步骤：

将nh2-peg-nh-r与pmsa(聚苯乙烯马来酸酐)溶解(优选的以dmso为溶液进行溶解)，然后反应；

pmsa具有多个环形马来酸酐结构，因而能够与带氨基分子进行开环反应，形成酰胺键，而且反应效率近乎100％；同时，由于pmsa具有良好的生物相容性，因而是一种优良的聚合骨架；

优选的，为了提高反应速率，反应是在加热并加入催化剂的条件下进行的，其中，加热的温度优选的为60℃，反应的时间优选的为过夜反应，所加入的催化剂优选的为dmap(四二氨基吡啶)；

反应后纯化，得到psma-peg-nh-r；

优选的，所述纯化为将产物体系装入透析袋中(透析袋的分子量优选的为3.5kda)，用水(优选的为超纯水)透析纯化，期间还优选的换水2-3次，透析后将透析袋内溶液冻干，即为psma-peg-nh-r；

然后，将psma-peg-nh-r脱保护，优选的，是以二甲氨基吡啶为脱保护试剂，将boc进行脱除，使得氨基暴露出来；

脱保护后还优选的进一步包括将脱保护产物进行纯化，从而得到高纯度psma-peg-nh2的步骤，而该步骤纯化的方法可参考如下：将脱保护后所得粉末产物溶解(优选的以二氯甲烷和tfa(三氟乙酸)混合溶液进行溶剂)，溶解后搅拌(优选的搅拌1h)，然后蒸发除去二氯甲烷，将所得混合溶液再次透析纯化后冻干，得到psma-peg-nh2。

所述近红外染料分子为ir808及其衍生物中的一种；优选的，所述近红外染料分子的结构如下：

其中，式(i)中，r1、r2、r3、r4分别独立的为氢、c1～c30的直链或支链的烷基，c1～c30的直链或支链的取代烷基，c5～c30的芳基或取代芳基，c6～c30的烷基芳基或芳基烷基；优选的，r1、r2、r3、r4、r5、r6分别独立的为氢、c1～c30的直链或支链的烷基，c1～c30的直链或支链的取代烷基；更优选的，r1、r2、r3、r4分别独立的为c1～c12的直链或支链的烷基，c1～c12的直链或支链的取代烷基；更进一步优选的，r1、r2、r3、r4分别独立的为c1～c6的直链或支链的烷基，c1～c6的直链或支链的取代烷基，例如可以为，但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基等；

r5、r6分别独立的为氢、c1～c30的直链或支链的烷基，c1～c30的直链或支链的取代烷基，c5～c30的芳基或取代芳基，c6～c30的烷基芳基或芳基烷基；优选的，r5、r6分别独立的为氢，c1～c30的直链或支链的烷基，c1～c30的直链或支链的取代烷基；更优选的，r5、r6分别独立的为氢，c1～c12的直链或支链的烷基，c1～c12的直链或支链的取代烷基；更进一步优选的，r5、r6分别独立的为氢，c1～c6的直链或支链的烷基，c1～c6的直链或支链的取代烷基，例如可以为，但不限于氢、甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基等；

r7、r8分别独立的为c0～c30的直链或支链的亚烷基，c0～c30的直链或支链的取代亚烷基，c5～c30的芳基或取代亚芳基，c6～c30的亚烷基芳基、取代亚烷基芳基或亚芳基烷基、取代亚芳基烷基；优选的，r7、r8、r9分别独立的为c0～c30的直链或支链的亚烷基，c0～c30的直链或支链的取代亚烷基；更优选的，r7、r8分别独立的为c1～c12的直链或支链的亚烷基，c1～c12的直链或支链的取代亚烷基；进一步优选的，r7、r8分别独立的为c1～c6的直链或支链的亚烷基，c1～c6的直链或支链的取代亚烷基，例如可以为，但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚异丙基、亚丁基、亚异丁基、亚叔丁基、亚戊基、亚异戊基、亚新戊基、亚己基等；

r9为c0～c30的直链或支链的亚烷基，c0～c30的直链或支链的取代亚烷基，c5～c30的芳基或取代亚芳基，c6～c30的亚烷基芳基、取代亚烷基芳基或亚芳基烷基、取代亚芳基烷基；优选的，r7、r8、r9分别独立的为c0～c30的直链或支链的亚烷基，c0～c30的直链或支链的取代亚烷基；

x1、x2分别独立的为f、cl、br，或者i；优选的，x1、x2分别独立的为cl、br，或者i；

x3、x4分别独立的为氨基、羟基，或者羧基；优选的，x3、x4均为羧基；

m、n分别独立的为0-4的整数，例如m、n分别独立的可以为1、2、3，或者4。

更优选的，所述近红外染料分子的结构如下：

即本发明所述制备方法中，最优选的原料近红外染料分子为ir808。

进一步的，当以mno@油胺、psma-peg-nh2，以及ir808为最优选的原料以制备本发明光敏剂时，本发明的制备方法可优选的参考如下：

将psma-peg-nh2溶于有机溶剂(优选的为氯仿)，然后，加入分散于有机溶剂(优选的为氯仿)中的mno@油胺，并加入水(优选的为超纯水)，形成有机相/水相分层体系；

然后，向该混合体系中充气(优选的为充入氮气，充气的时间优选的为15min)，psma-peg-nh2的疏水端(即psma结构部分)会强烈粘附与氧化锰颗粒表面，而亲水端(即peg-nh2结构部分)会分散在水相中；

而有机相/水相分层体系中的有机相会随着通气和复合反应而慢慢挥发，溶液也会由澄清变为浑浊，然后再次澄清，待溶液完全澄清后，将溶液过滤纯化，得到mno@oa-pmsa-peg-nh2，即得到一种水相磁性氧化锰纳米颗粒；

向分散于溶剂(优选的为超纯水或者pbs缓冲液)的水相磁性氧化锰纳米颗粒中，加入edc和nhs，然后加入溶于有机溶剂(优选的为dmso)的ir808，混合反应，反应结束后纯化洗涤，即得到本发明优选结构的光敏剂材料颗粒，记为ir808@mno纳米光敏剂；

而该优选结构的ir808@mno纳米光敏剂中，ir808通过其羧基官能团与mno@oa-pmsa-peg-nh2上的氨基键和，从而实现了近红外染料分子ir808与磁性氧化锰纳米颗粒的有机复合。而该纳米光敏剂具有良好的生物相容性以及生物可降解性，同时稳定性好、单分散性能优良，水溶性好，且具有良好的肿瘤细胞靶向性。

而由本发明上述方法所制备的各种具有不同特征结构的纳米光敏剂不仅能够用于肿瘤细胞的靶向光热/光动力治疗，同时还能够作为荧光探针而用于活体细胞成像，而且还能够进一步作为磁性功能颗粒用于蛋白和肿瘤细胞的分离。

实施例1

实施例1方法流程可参考图1，具体操作步骤可参考如下：

(a)mno@oa纳米颗粒制备

将2gmn(oac)2、25ml二苯醚以及25ml油胺(oleyamine,oa)混合溶解于100ml三颈烧瓶中，混合物在氮气的保护下进行反应；首先以电加热套120℃加热0.5h除去反应中多余的水分，然后按照10℃/min的速度升温至280℃，并搅拌反应1h后停止加热，溶液冷却至室温。

向溶液中加入100ml乙醇以将所生成的mno纳米颗粒沉淀出，然后按照8000rpm的速度离心10min，得到约20nm左右大小mno@oa颗粒，分散于氯仿中待用，浓度约20mg/ml。

步骤(a)中所制备的mno@oa纳米颗粒的形貌及表征请参考图2，其中，图2中，(a)为mno@oa透射电镜图；(b)为mno@oa能谱元素分析图；(c)为mno@oa紫外吸收光谱图；(d)为mno@oax射线衍射物相分析图。

由图2(a)所示的透射电镜图可知，本发明中所制备的mno@oa纳米颗粒大约22nm左右，尺寸均一，分散性好；

由图2(b)所示的能谱元素分析图可知，本发明中所制得的mno@oa无任何杂质元素；

同时，由图2(c)所示的紫外吸收光谱图可知，mno@oa纳米颗粒在250-400nm处有强烈的紫外吸收，证明mno的存在；

进一步的，由图2(d)所示的射线衍射物相分析图可知，本发明mno@oa纳米颗粒与标准的mno晶体的x射线粉末衍射物相分析峰完全相同，由此可见，本发明所制备的mno@oa纳米颗粒的晶体构型和价态与mno晶体一致。

(b)psma-peg2k-nh2制备

将nh2-peg2k-nh-boc135.3mg和pmsa190mg溶解在5mldmso溶液中，并将溶液置于圆底烧瓶；然后向烧瓶中加入20mgdmap作为催化剂，加热到60℃，并过夜反应。

反应结束后,将反应产物装入分子量3.5kda的透析袋，用超纯水透析三天，中途换水2-3次，纯化产物，去除剩余的反应物。透析完毕后将透析袋中的溶液冷冻干燥，白色粉末即为psma-peg2k-nh-boc。然后，以二甲基氨基吡啶为脱保护试剂，进行脱保护反应，将所得粉末状产物溶解于9ml二氯甲烷和1mltfa中混合溶液中，搅拌1h后用旋蒸仪旋蒸多余的二氯甲烷溶液。最后，将混合溶液透析纯化冻干，即得psma-peg2k-nh2。

psma-peg2k-nh2的结构表征请参考图3，其中，图3中，(a)为psma和psma-peg2k-nh2傅立叶红外吸收光谱曲线图；(b)psma-peg2k-nh2核磁氢谱图；

由图3(a)的红外对照检测结果可知，产物psma-peg2k-nh2在3000cm^-1处有明显的甲基峰，同时在1710cm^-1处有明显的羰基峰，而这也说明产物的结构为目标结构；

同时，由图3(b)的核磁图谱可知，在3.5ppm处有明显的peg上的甲基氢，而在7ppm处也出现了明显的psma苯环氢的峰，而这也能够进一步证明目标产物的成功制备。

(c)mno@oa-psma-peg-nh2制备

将1ml步骤(a)中所制备的有机相纳米氧化锰mno@oa以5ml氯仿稀释，得到mno@oa氯仿稀释液；

取一个50ml离心管，并加入20mgpsma-peg-nh2配体聚合物，然后加入500μl的氯仿，搅拌溶剂，接着加入mno@oa氯仿稀释液，并加入3ml超纯水，形成有机相/水相体系；

向该体系中充入氮气，两亲性配体聚合物的疏水端会强烈粘附在有机相纳米颗粒表面，亲水端会分散水相溶液中，溶液中氯仿溶液慢慢挥发，溶液经历澄清→粘稠→澄清的过程，充气过程持续10-15分钟，待溶液完全澄清时，将溶液转移到100kda超滤管以8000rpm速度超滤5-6次，除去多余的两亲性聚合物，得到纯化后的水相氧化锰纳米颗粒mno@oa-psma-peg-nh2，并装于超纯水中待用。

(d)ir808@mno制备

将ir808溶于dmso中(浓度为1mg/ml)，取1ml先前制备好的水相氧化锰纳米颗粒置于5ml离心管中，分别称取edc60mg和nhs20mg加入到离心管中，然后加入溶解好的ir808200μl震荡摇匀，置于室温条件下反应2-3小时。

反应完成后，将纳米颗粒混合液加入到分子量3000的透析袋中，透析48小时，除去残留的有机溶剂和未连接上的ir808，然后将透析好的纳米颗粒用分子量100kda的超滤管超滤洗涤3次，洗涤完毕后即得到ir808@mno纳米光敏剂。

ir808@mno纳米光敏剂形貌特征及性质表征可参见图4，其中，(a)为ir808@mno透射电镜图；(b)为ir808@mno紫外吸收和荧光光谱图；(c)为ir808@mno粒径分布图(d)为ir808@mnozeta电位分布图。

由图4(a)所示的ir808@mno透射电镜图与图2(a)所示的mno@oa透射电镜图对比可知，通过两亲性配体聚合物包裹后，mno纳米颗粒的大小增加；同时，由ir808@mno纳米颗粒透射电镜图可知，ir808@mno颗粒大小均一，分散性好，呈经典的球形。

同时，由图4(b)所示的ir808@mno紫外吸收图谱可知，ir808@mno在250nm～400nm有强烈的吸收峰，且与有机相氧化锰纳米颗粒的吸收光谱一致，这表明产物中mno纳米颗粒的存在；而在750～850nm处有一个非常明显的吸收峰，这个吸收峰是近红外染料ir808的吸收峰，表明ir808偶联到了水相氧化锰纳米颗粒之上；

而由荧光发射峰的测试结果可知，ir808@mno纳米颗粒在780nm激发光激发，发射峰到了808nm，而游离近红外染料ir808的荧光发射峰在792nm；通过荧光发射峰的对比可知，反应后的近红外染料的荧光发射峰发生了红移，这是由于ir808与两亲性配体聚合物偶联之后，染料分子的电荷状态及电子转移发生变化引起的。

而由图4(b)的紫外吸收以及荧光发射图综合分析可知，ir808@mno纳米颗粒具有mno@oa核心，两亲性聚合物配体的外层而且聚合物末端还偶联了近红外染料ir808，所以紫外吸收光谱同时具有氧化锰和近红外染料的特征。

由图4(c)所示的粒径分布图可知，通过动态光散射dls粒度仪测得ir808@mno纳米光敏剂的平均水合粒径大约为37.3nm，

最后，由图4(d)所示的zeta电位分布图可知，ir808@mno纳米颗粒的zeta电位大约在-29mv，而较强的负zeta电位是纳米颗粒不易聚沉，保持分散和稳定的重要因素，这也能够说明本发明ir808@mno纳米颗粒具有良好的稳定性，且不易聚沉。

实施例2

(a)mno@oa纳米颗粒制备

将5gmn(oac)2、50ml二苯醚以及40ml油胺(oleyamine,oa)混合溶解于100ml三颈烧瓶中，混合物在氮气的保护下进行反应；首先以电加热套120℃加热0.5h除去反应中多余的水分，然后按照10℃/min的速度升温至280℃，并搅拌反应1h后停止加热，溶液冷却至室温。

(b)psma-peg2k-nh2制备

将nh2-peg2k-nh-boc150mg和pmsa200mg溶解在5mldmso溶液中，并将溶液置于圆底烧瓶；然后向烧瓶中加入25mgdmap作为催化剂，加热到60℃，并过夜反应。

反应结束后,将反应产物装入分子量3.5kda的透析袋，用超纯水透析三天，中途换水3次。透析完毕后将透析袋中的溶液冷冻干燥，白色粉末即为psma-peg2k-nh-boc。

然后，以二甲基氨基吡啶为脱保护试剂，进行脱保护反应，将所得粉末状产物溶解于5ml二氯甲烷和5mltfa中混合溶液中，搅拌1h后用旋蒸仪旋蒸多余的二氯甲烷溶液。最后，将混合溶液透析纯化冻干，即得psma-peg2k-nh2。

(c)mno@oa-psma-peg-nh2制备

将1ml步骤(a)中所制备的有机相纳米氧化锰mno@oa以5ml氯仿稀释，得到mno@oa氯仿稀释液；

取50ml离心管，并加入35mgpsma-peg-nh2配体聚合物，然后加入500μl的氯仿，搅拌溶剂，接着加入mno@oa氯仿稀释液，并加入3ml超纯水，形成有机相/水相体系；

向该体系中充入氮气，溶液由澄清→粘稠→澄清，充气过程持续15分钟，待溶液完全澄清时，将溶液转移到100kda超滤管以8000rpm速度超滤5-6次，除去多余的两亲性聚合物，得到纯化后的水相氧化锰纳米颗粒mno@oa-psma-peg-nh2，并装于超纯水中待用。

(d)ir808@mno制备

将ir808溶于dmso中(浓度为1mg/ml)，取1ml先前制备好的水相氧化锰纳米颗粒置于5ml离心管中，分别称取edc40mg和nhs60mg加入到离心管中，然后加入溶解好的ir808200μl震荡摇匀，置于室温条件下反应2小时。

反应完成后，将纳米颗粒混合液加入到分子量3000的透析袋中，透析48小时，除去残留的有机溶剂和未连接上的ir808，然后将透析好的纳米颗粒用分子量100kda的超滤管超滤洗涤3次，洗涤完毕后即得到ir808@mno纳米光敏剂。

实施例2中各中间产物以及终产物的结构和性质的检测结果与实施例1中相同。

实施例3

(a)mno@oa纳米颗粒制备

将1gmn(oac)2、20ml二苯醚以及20ml油胺(oleyamine,oa)混合溶解于100ml三颈烧瓶中，混合物在氮气的保护下进行反应；首先以电加热套120℃加热0.5h除去反应中多余的水分，然后按照10℃/min的速度升温至280℃，并搅拌反应1h后停止加热，溶液冷却至室温。

(b)psma-peg2k-nh2制备

将nh2-peg2k-nh-boc190mg和pmsa190mg溶解在5mldmso溶液中，并将溶液置于圆底烧瓶；然后向烧瓶中加入30mgdmap作为催化剂，加热到60℃，并过夜反应。

反应结束后,将反应产物装入分子量3.5kda的透析袋，用超纯水透析三天，中途换水2次。透析完毕后将透析袋中的溶液冷冻干燥，白色粉末即为psma-peg2k-nh-boc。

然后，以二甲基氨基吡啶为脱保护试剂，进行脱保护反应，将所得粉末状产物溶解于9ml二氯甲烷和1mltfa中混合溶液中，搅拌1h后用旋蒸仪旋蒸多余的二氯甲烷溶液。最后，将混合溶液透析纯化冻干，即得psma-peg2k-nh2。

(c)mno@oa-psma-peg-nh2制备

将1ml步骤(a)中所制备的有机相纳米氧化锰mno@oa以5ml氯仿稀释，得到mno@oa氯仿稀释液；

取50ml离心管，并加入15mgpsma-peg-nh2配体聚合物，然后加入500μl的氯仿，搅拌溶剂，接着加入mno@oa氯仿稀释液，并加入2ml超纯水，形成有机相/水相体系；

向该体系中充入氮气，溶液由澄清→粘稠→澄清，充气过程持续15分钟，待溶液完全澄清时，将溶液转移到100kda超滤管以8000rpm速度超滤5次，得到纯化后的水相氧化锰纳米颗粒mno@oa-psma-peg-nh2，并装于超纯水中待用。

(d)ir808@mno制备

将ir808溶于dmso中(浓度为1mg/ml)，取1ml先前制备好的水相氧化锰纳米颗粒置于5ml离心管中，分别称取edc40mg和nhs60mg加入到离心管中，然后加入溶解好的ir808200μl震荡摇匀，置于室温条件下反应3小时。

反应完成后，将纳米颗粒混合液加入到分子量3000的透析袋中，透析48小时，然后将透析好的纳米颗粒用分子量100kda的超滤管超滤洗涤3次，洗涤完毕后即得到ir808@mno纳米光敏剂。

实施例3中各中间产物以及终产物的结构和性质的检测结果与实施例1中相同。

实施例4

(a)mno@oa纳米颗粒制备

将3gmn(oac)2、25ml二苯醚以及30ml油胺(oleyamine,oa)混合溶解于100ml三颈烧瓶中，混合物在氮气的保护下进行反应；首先以电加热套120℃加热0.5h除去反应中多余的水分，然后按照10℃/min的速度升温至280℃，并搅拌反应1h后停止加热，溶液冷却至室温。

(b)psma-peg2k-nh2制备

将nh2-peg2k-nh-boc150mg和pmsa200mg溶解在5mldmso溶液中，并将溶液置于圆底烧瓶；然后向烧瓶中加入20mgdmap作为催化剂，加热到60℃，并过夜反应。

反应结束后,将反应产物装入分子量3.5kda的透析袋，用超纯水透析三天，中途换水3次，纯化产物，去除剩余的反应物。透析完毕后将透析袋中的溶液冷冻干燥，白色粉末即为psma-peg2k-nh-boc。然后，以二甲基氨基吡啶为脱保护试剂，进行脱保护反应，将所得粉末状产物溶解于5ml二氯甲烷和5mltfa中混合溶液中，搅拌1h后用旋蒸仪旋蒸多余的二氯甲烷溶液。最后，将混合溶液透析纯化冻干，即得psma-peg2k-nh2。

(c)mno@oa-psma-peg-nh2制备

将1ml步骤(a)中所制备的有机相纳米氧化锰mno@oa以5ml氯仿稀释，得到mno@oa氯仿稀释液；

取50ml离心管，并加入20mgpsma-peg-nh2配体聚合物，然后加入500μl的氯仿，搅拌溶剂，接着加入mno@oa氯仿稀释液，并加入3ml超纯水，形成有机相/水相体系；

向该体系中充入氮气，溶液由澄清→粘稠→澄清，充气过程持续15分钟，待溶液完全澄清时，将溶液转移到100kda超滤管，以8000rpm速度超滤5次，得到纯化后的水相氧化锰纳米颗粒mno@oa-psma-peg-nh2，并装于超纯水中待用。

(d)ir808@mno制备

将ir808溶于dmso中(浓度为1mg/ml)，取1ml先前制备好的水相氧化锰纳米颗粒置于5ml离心管中，分别称取edc50mg和nhs50mg加入到离心管中，然后加入溶解好的ir808200μl震荡摇匀，置于室温条件下反应2小时。

反应完成后，将纳米颗粒混合液加入到分子量3000的透析袋中，透析48小时，然后将透析好的纳米颗粒用分子量100kda的超滤管超滤洗涤3次，洗涤完毕后即得到ir808@mno纳米光敏剂。

实施例4中各中间产物以及终产物的结构和性质的检测结果与实施例1中相同。

实验例1

以实施例1所制得的ir808@mno纳米光敏剂为实验材料，进行生物实验对比测试，如下各组实验均在相同条件下进行，实验对照结果如下图5所示；

其中，图5(a)-(e)各图中，cy为ir808，nps为mno纳米颗粒，cy-nps为ir808@mno纳米光敏剂

具体如下：

(a)活细胞ros定量实验：

实验结果如图5(a)所示。

由图5(a)实验结果可知，在有激光照射的条件下，nps和cy-nps在微酸和h2o2环境中自身产生的ros(羟自由基·oh，和超氧阴离子o2-)差别不大；而cy组的荧光强度很低，说明产生的ros也低，对照组几乎没有；

同时，游离的cy在激光的照射下产生单线氧，而在有nps的情况下，可以催化过氧化氢产生氧气，从而在有光敏剂cy的情况下，会增加单线态氧ros的产生，所以cy-nps在有激光照射下，活细胞中ros的产生更多，ros探针荧光强度也更高。

(b)细胞生存实验

实验结果如图5(b)所示。

由图5(b)的实验结果可知，在激光照射条件下，cy-nps组细胞的生存率明显低于其他组，其对于细胞的杀灭能力最强，而这实际上也与实验(a)的结果相符。

(c)细胞杀灭实验

采用cck-8(cellcoμntingkit-8)来验证cy-nps对细胞的杀伤效果,实验结果如图5(c)所示。

由图5(c)的对照试验结果可知，在有激光的照射下，同浓度的cy-nps相较于游离的cy和nps而言，对于细胞的杀伤效果更优，因而治疗效果也更好，而该实验结果也与ros定量以及细胞凋亡实验结果一致。

(d)cy-nps靶向性实验

mcf-7移植瘤裸鼠通过尾静脉注射cy-nps，进行纳米探针的靶向性实验，实验结果如图5(d)所示；

由图5(d1)可知，尾静脉注射cy-nps肿瘤靶向纳米探针6h后，肿瘤组织区域荧光强度明显增强，说明肿瘤靶向cy-nps纳米探针对肿瘤高效特异性识别有很好的富集在肿瘤区域；而48h后，荧光强度达到最大值；120h后，正常组织和器官荧光强度低，说明cy-nps都被活体组织代谢，而肿瘤组织区域的荧光强度依然非常强，表明cy-nps纳米探针是非常好的靶向识别荧光成像探针；

而图5(d4)的荧光强度变化的趋势图曲线，也很好的印证了上述结论。

在尾静脉注射cy-nps纳米探针24小时后，摘除实验鼠的心、肝、脾、肺、肾、和肿瘤，进行荧光成像，结果如图5(d2)所示；

由图5(d2)的荧光检测结果可知，肿瘤组织相对于其他的器官组织荧光强度明显更高，说明cy-nps肿瘤靶向性特别好，是很好的肿瘤靶向纳米探针。但是肝脏和肾脏也有一定的荧光强度，这是由于纳米颗粒经肝肾代谢造成的，特别是肾脏，因为cy-nps纳米颗粒粒径非常小，大约37nm左右，一般小颗粒经肾脏代谢尿液排出，所以肾脏荧光强度高。

而图5(d3)各器官的平均荧光强度统计也进一步证明上述实验的结果的正确性。

而由上述实验结果也可以得知的是，cy-nps肿瘤靶向纳米探针在近红外活体荧光成像实验中对mcf-7移植瘤裸鼠有很好的肿瘤靶向富集效果.

(e)光热治疗实验

尾静脉注射荷mcf-7肿瘤老鼠150μl游离cy、nps、cy-nps纳米探针溶液，对照组裸鼠注射150μlpbs，以0.5w/cm²的808激光器分别垂直照射尾静脉注射四种不同的溶液肿瘤裸鼠的肿瘤。

如图5(e)的实验结果所示，10min光照结束后，游离的cy和cy-nps组的老鼠肿瘤区域的最高温度达到了49.5℃和56.5℃，均超出了肿瘤细胞所能承受的温度，造成不可逆的组织破坏；

同浓度的cy和cy-nps纳米探针(ir808与游离的ir808浓度相同)相较而言，cy-nps纳米探针在肿瘤区域升温更高；同时，由于cy-nps在体内代谢慢循环时间长，靶向富集效果比游离的cy较好，因而能够起到更优的肿瘤治疗效果。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。