温敏型佐剂及其制作方法与流程

本发明涉及一种疫苗用佐剂，特别是关于一种会随着温度改变而发生相变化的温敏型佐剂。

背景技术：

疫苗接种被公认是用来预防病毒感染动物的最有效且最具效率的做法，很多传染病控制计划的基础是用活的微生物或经灭活的微生物或其产物制成疫苗并对动物接种来诱导专一性免疫。有效的疫苗接种程序可以在动物中形成针对专一抗原的免疫记忆能力，从而在日后与抗原接触时在动物中引起快速且强烈的免疫反应。然而，至今仍有许多病毒性或细菌性疾病尚无可利用的疫苗，或还未有能达到足够免疫作用的疫苗。此外，许多疫苗因为其抗原效能太低、使用劣质佐剂、会产生严重副作用、稳定性低或是价格昂贵而不适用。因此，亟需研发出更有效的疫苗或相关佐剂产品。

将抗原与称为佐剂的物质混合后，一起注射于动物体内可增强免疫系统对抗原的免疫抗性，所述称为佐剂的物质通过直接作用于免疫系统或通过修改抗原的药物动力学特征来增强动物体对野外病毒的抵御反应，且藉此增加抗原与免疫系统的相互作用时间。举例来说，灭活抗原单独免疫动物时不足于产生免疫原性，特别是免疫原性低、分子量小的抗原，因此需要用不同种类的佐剂来增强抗原所诱导的免疫应答。然而，国内外兽用疫苗生产商推广应用的油质疫苗含有大量的矿物质油，在为养禽业保驾护航的同时也带来了不少的食品安全问题，例如，肉鸡屠体的疫苗残留问题已经引起越来越多人的担忧。

油包水(w/o)型油质疫苗是由抗原液、界面活性剂及矿物质油混合后，在高剪切力作用下制备而成。其免疫机理是在接种部位贮存一段时间后，局部产生肉芽肿和炎症反应，吸引巨噬细胞、淋巴细胞等聚集以识别抗原，产生抗体。同时，缓慢扩散的油质佐剂使抗原输送到二级淋巴器官的时间延长，不断刺激机体的免疫系统，从而产生续期长、抗体水准高的免疫效力。虽然国内外疫苗生产厂家的生产工艺不断改进，用油品质也不断提高，但由于这种制剂的连续油相在注射部位有驻留的倾向，在不少的情形中，这种w/o型油质疫苗在接种部位附近产生大量肉芽肿，保护性抗体产生速度慢、易对动物屠体品质造成不良影响，并且在接种期间可能引起剧烈的疼痛。

另外，水包油(o/w)型佐剂疫苗具有注射部位显现局部反应小且稳定性高的优势，然而包含或者暴露在连续相中的抗原很快在注射部位分散和被体液酶分解，难以提供长期的保护性抗体，常常需要特殊的免疫刺激剂和多次加强免疫，制备成本高，不被广泛使用。

因此，近年来市面上已出现一种缓释疫苗，其是利用能够随着温度改变而发生相变化的温敏型原位凝胶作为疫苗的佐剂。原位凝胶在动物体外往往呈现为可供注射的流动性溶液态，抗原或佐剂均匀分布在其中；当将疫苗注入动物体内后，溶液态会受到动物体温影响而在注射部位发生相转变成为流动性差的凝胶态或固体状态，此时抗原分布在半固体凝胶中形成缓慢释放的药物储库，此时抗原分布在半固体凝胶中形成缓慢释放的药物储库，此类温敏型佐剂具备了油包水(w/o)型油质疫苗及水包油(o/w)型佐剂疫苗的优点，除了能够减少给药次数、提高患者依从性、增强并延长体液免疫应答、提高细胞免疫应答强度、以及有利于免疫记忆性反应的产生以外，更不会引起严重的炎症反应。

然而，目前市面上的温敏型佐剂大多是以聚乙烯醇作为主要成分，其制作过程繁复且生产成本高昂，因此仅应用于适用对象为人类的疫苗，而无法广泛使用于动物疾病用的疫苗；另外亦有由壳聚糖为主成分所制得的温敏型佐剂，但所述类佐剂多以壳聚糖/甘油磷酸钠盐配方为主，其所形成的凝胶机械性能较差，凝胶成形状态不稳定，导致对于病毒抗原液的包覆率不佳，同时也造成后续在生物体内的药品释放速度不稳定。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种温敏型佐剂，该温敏型佐剂以壳聚糖为主要成分并改良常规的壳聚糖/甘油磷酸钠盐配方，具有良好的生物相容性及体内可降解性，并且所述温敏型佐剂的制作方式简单，且成本低廉，能够广泛使用于动物疾病用的疫苗。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种温敏型佐剂，其包括：20wt％至60wt％的壳聚糖或壳聚糖衍生物；10wt％至40wt％的交联剂；1.0wt％至5.0wt％的胶质萃取物；1.0wt％至5wt％的增塑剂；以及其余为稀释剂；所述温敏型佐剂可以提高病毒抗原在生物体内的免疫原性，对免疫系统刺激的时间增加，进而可以增加动物的记忆性免疫效果。

根据本发明的一观点，在本发明的温敏型佐剂中，为了提高防止病毒的感染或增加疫苗稳定性及效能而达到防疫的效果，可以使产品达到良好的功效，在实际施用时，所述温敏型佐剂(adj)与病毒抗原液(vat)的掺混比(adg：vat)为1：4(v/v)～1：1(v/v)。例如，在本发明的所述温敏型佐剂(adj)与病毒抗原液(vat)的掺混比的比例可以是1：4(v/v)～1：1(v/v)；在某些具体实施例中，较佳为1：4(v/v)～2：3(v/v)；更佳为1：4(v/v)～3：7(v/v)；最佳为1：4(v/v)。

根据本发明的观点，所述壳聚糖或壳聚糖衍生物相对于所述交联剂的重量比可以是1：10～10：1，较佳为1：10～6：1，更加为1：10～2：1；最佳为1：10～1：3。

依据本发明的一观点，可使用于本发明的温敏型佐剂的所述缓冲剂并未特别加以限定，举例来说，所述壳聚糖的脱乙酰程度一般为50％至100％；较佳为60％至100％；更佳为70％至100％；最佳为80％至100％。另外，所述壳聚糖的分子量一般为5万～200万；较佳为10万～200万；更佳为50万～200万；最佳为100万～200万。

依据本发明的一观点，可使用于本发明的温敏型佐剂的所述壳聚糖衍生物并未特别加以限定；举例来说，所述壳聚糖衍生物选自羧甲基壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖乳酸盐、壳聚糖醋酸盐、壳聚糖硫酸脂、壳聚糖季胺盐、壳聚寡糖或甲壳素。

依据本发明的一观点，可使用于本发明的温敏型佐剂的所述交联剂并未特别加以限定；举例来说，所述交联剂选自纤维素、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和聚丙烯酰胺中的至少一种；较佳是选自聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸和聚丙烯酰胺中的至少一种；最佳为聚丙烯酸。

依据本发明的一观点，可使用于本发明的温敏型佐剂的所述增塑剂并未特别加以限定；举例来说，所述增塑剂可以是甘油、丙二醇、乙二醇、二乙二醇单乙基醚、甘油酯和聚乙二醇脂肪酸酯中的至少一种；较佳为甘油、丙二醇、乙二醇和甘油酯中的至少一种；更佳为甘油、乙二醇和甘油酯中的至少一种；最佳为甘油。

依据本发明的一观点，可使用于本发明的温敏形佐剂的胶质萃取物包含有β-葡聚糖。

依据本发明的一观点，上述β-葡聚糖的黏度一般为4.0至7.0mm²/s；較佳为为4.5至7.0mm²/s的范围；更佳为在4.5至6.0mm²/s的范围；最佳为在5.0至6.0mm²/s的范围。

依据本发明的一观点，上述β-葡聚糖的平均分子量一般为在16000至20000的范围；較佳为17000至20000；更佳为17500至20000；最佳为18000至20000。

依据本发明的一观点，上述β-葡聚糖的ph值一般为5至8；較佳为5.5至8；更佳为5.5至7；最佳为5.5至6。

依据本发明的一观点，可使用于本发明的温敏型佐剂的所述胶质萃取物可以进一步包含有芦荟萃取物、五加皮萃取物、马齿苋萃取物、葡萄柚萃取物、柿子叶萃取物、桑黄蘑萃取物、冬虫夏草萃取物及其衍生物中的至少一种；较佳使用来源为芦荟萃取物、五加皮萃取物、马齿苋萃取物、葡萄柚萃取物、柿子叶萃取物、桑黄蘑萃取物和冬虫夏草萃取物中的至少一种；更佳使用来源为芦荟萃取物、五加皮萃取物、马齿苋萃取物和葡萄柚萃取物中的至少一种；最佳使用来源为芦荟萃取物和五加皮萃取物中的至少一种。

依据本发明的一观点，可使用于本发明的温敏型佐剂的所述缓冲剂并未特别加以限定，举例来说，所述缓冲剂来源可以是磷酸盐缓冲剂、tris-hcl缓冲剂、柠檬酸钠-磷酸盐缓冲剂、两性离子缓冲剂、hepes缓冲剂、马来酸盐缓冲剂及其衍生物中的至少一种；适用于本发明的缓冲剂较佳使用来源为磷酸盐缓冲剂、tris-hcl缓冲剂、柠檬酸钠-磷酸盐缓冲剂、两性离子缓冲剂、hepes缓冲剂或马来酸盐缓冲剂；更佳使用来源为磷酸盐缓冲剂、tris-hcl缓冲剂、柠檬酸钠-磷酸盐缓冲剂或两性离子缓冲剂；最佳使用来源为磷酸盐缓冲剂。

依据本发明的一观点，可使用于本发明的温敏型佐剂的所述佐剂配合使用的抗原液并未特别加以限定，举例来说，例如可以是活毒抗原、灭活抗原、死毒抗原、次单位抗原或核酸抗原；适用于本发明的抗原液较佳使用来源为活毒抗原或灭活抗原；更佳使用来源为灭活抗原。

另外，根据本发明的一观点还可以提供一种温敏型佐剂的制备方法，其是包括以下步骤:将20wt％至60wt％的壳聚糖或壳聚糖衍生物、及1.0wt％重量份至5wt％重量份的增塑剂，以第一操作条件予以充分混合，接着加入10wt％至40wt％的交联剂持续搅拌7小时以上而形成组成物a；然后将1.0wt％至5.0wt％的胶质萃取物与稀释剂于第二操作条件下充分混合而得到组成物b；以及将上述(b)所得的组成物b缓慢滴入上述(a)所得的组成物a中，并在第三操作条件下充分混合而得到温敏型佐剂。

根据本发明的一观点，所述组成物b的黏度为10²mpa·s～10⁸mpa·s，若组成物b的黏度低于10²mpa·s会使得所述温敏形佐剂在相转换形成凝胶时结构不稳定，无法有效包覆抗原液，若组成物b的黏度高于10⁸mpa·s会因黏度过高而无法在生物体内有效释放抗原。又，所述组成物b的黏度较佳为10³mpa·s～10⁸mpa·s；更佳为10⁴mpa·s～10⁸mpa·s；更佳为10⁵mpa·s～10⁸mpa·s。

依据本发明的一观点，其中(a)第一操作条件包括于40～80℃的温度环境、搅拌转速1200rpm～2400rpm且ph值为5～8的条件下反应1～5小时。

依据本发明的一观点，其中(b)第二操作条件包括在室温环境中以600rpm～1200rpm的搅拌转速持续搅拌2～3小时。

依据本发明的一观点，其中(c)第三操作条件包括于40～80℃的温度下以800rpm～1200rpm的搅拌转速持续搅拌1～3小时。

接着，结合具体实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

图1为本发明的温敏型佐剂s1至s3的粒径-温度变化图。

图2为使用本发明的温敏型佐剂s1至s3进行两相平衡系统试验的数据结果比较图。

图3a为本发明的比较例1、实施例1、实施例2、及实施例3在进行经皮吸收附着效果测试时，尚未喷洒混合液p1至p4的猪皮m1至m4表面的示意照片。

图3b为本发明的比较例1、实施例1、实施例2、及实施例3在进行经皮吸收附着效果测试时，喷洒混合液p1至p4的猪皮m1至m4表面的结果示意照片。

图3c为本发明的比较例1、实施例1、实施例2、及实施例3在进行经皮吸收附着效果测试时，喷洒混合液p1至p4的猪皮m1至m4表面经过2小时后的结果示意照片。

图4为本发明的比较例3-4、及实施例7-9进行活毒疫苗的力价验证结果比较图

图5为本发明的比较例5-6、及实施例10-12进行灭活疫苗的力价验证结果比较图

具体实施方式

以下，针对本发明的实施方式列举不同的具体实施例而更加详尽地叙述与说明，以便使本发明的精神与内容更为完备而易于了解；然而，本领域技术人员应当明了本发明当然不受限于此等实例而已，亦可利用其他相同或均等的功能与步骤顺序来达成本发明。

首先，对于本说明书中所使用的特定用语或名词进行描述性的说明；然而，下列说明仅为例示性说明，非作为限制本发明说明书及申请专利范围。除非本说明书另有定义以外，在本文中所用的科学与技术词汇的含义与本领域技术人员所理解与惯用的意义相同。

如本文中所使用，「疫苗」或「疫苗混合液」为可用于在接受者中诱发保护性免疫的组合物。因此，在受检者已接种抗原后，疫苗可预防、延缓或减轻曝露于相同或相关抗原的受检者的疾病发展的严重程度(相对于未接种疫苗的受检者)。通过疫苗所提供的保护性免疫可为体液(抗体介导)免疫和/或细胞免疫。例如，疫苗接种可消除或降低病原体或受感染细胞的负荷，或减轻任何其他可测量的感染。疫苗接种亦可降低已免疫(已接种疫苗)的受检者的肿瘤负荷。

如本文中所使用，术语「保护性免疫」是指当受检者已曝露于抗原，从而在受检者中引起免疫反应(主动/后天和/或被动/先天)时抵御抗原所获得的免疫力，从而使抗原失活及/或降低抗原负荷且形成免疫记忆(例如记忆t细胞或b细胞)。

通过疫苗接种所提供的保护性免疫可能在部分的或仅在一部分已接种疫苗的受检者中提供。因此，疫苗可在一部分免疫群体中诱发保护性免疫，因为有些个体可能无力建立强免疫反应或保护性免疫反应或(在有些情况下)任何免疫反应。此能力不够可能归因于个体的遗传背景或归因于免疫缺乏病状(后天或先天性)或免疫抑制(例如，由于经化学疗法治疗或使用免疫抑制药物以例如预防器官排斥反应或抑制自体免疫病状)。向一部分免疫群体提供保护的疫苗仍然适用且视为有效。

如本文中所使用，术语「佐剂」是指当连同抗原投与时，增强受检者对抗原的免疫反应的化合物。

本文术语的「动物」意指所有非人类动物，包括哺乳动物。

在本文中，对于用以界定本发明范围的数值与参数，本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差，因而大多是以约略的数量值来表示，然而于具体实施例中则尽可能精确呈现的相关数值。在本文中，「约」通常视本领域技术人员的考量而定，一般是指代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，例如，所述实际数值为在一特定数值或范围的±10％、±5％、±1％、或±0.5％以内。

《制备例1》

首先，将2.0kg的壳聚糖(脱乙酰程度为80％，分子量在80万)、及0.4kg的甘油一起加入调配瓶中，利用搅拌机(型号:uhm-10，厂牌:nihonseiki日本)在无菌环境中以温度45℃、搅拌转速1200rpm、ph值为6.0的条件下，进行反应2小时；确认混合均匀后再加入4.0kg的聚丙烯酸并持续搅拌8小时，进而得到组成物a1。

接着，如表1所示，将0.1kg的芦荟胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g芦荟，进一步可以萃取出芦荟胶质萃取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度为18.8g/ml，并含有20％以上的芦荟苷)、0.2kg的五加皮胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g五加皮，进一步可以萃取出五加皮胶质萃取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度为18.8g/ml，并含有20％以上的刺五加苷)、以及0.2kg的β-葡聚糖(黏度为6.0mm²/s、平均分子量约为1.9×10⁴、和ph值为5.5)一起加入3.45kg的磷酸盐缓冲液中，在无菌环境中于室温下以搅拌转速800rpm均匀搅拌2小时而得到组成物b1，且所述组成物b1的黏度为7.1×10⁶mpa·s。

然后，将组成物b1以滴管慢慢滴入组成物a1中，并继续利用超高速均质机以800rpm、60℃的条件均质搅拌1小时，再经由冷凝降温而得到本发明的温敏型佐剂s1。接着，使用动态光散射仪检测在25℃、37℃、50℃、及60℃时温敏型佐剂s1的粒径分布，计算出平均粒径并记录于表1中。

《制备例2》

首先，将4.0kg的壳聚糖(脱乙酰程度为80％，分子量在80万)、及0.4kg的甘油一起加入调配瓶中，利用搅拌机(型号:uhm-10，厂牌:nihonseiki日本)在无菌环境中以温度45℃、搅拌转速1500rpm、ph值为6.5的条件下，进行反应2.5小时；确认混合均匀后再加入2.5kg的聚丙烯酸并持续搅拌7小时，进而得到组成物a2。

接着，如表1所示，将0.1kg的芦荟胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g芦荟，进一步可以萃取出芦荟胶质萃取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度为18.8g/ml，并含有20％以上的芦荟苷)、以及0.3kg的β-葡聚糖(黏度为4.5mm²/s、平均分子量约为1.85×10⁴、和ph值为6.5)一起加入2.3kg的磷酸盐缓冲液中，在无菌环境中于室温下以搅拌转速600rpm均匀搅拌1.5小时而得到组成物b2，且所述组成物b2的黏度为1.2×10⁷mpa·s。

然后，将组成物b2以滴管慢慢滴入组成物a2中，并继续利用超高速均质机以900rpm、65℃的条件均质搅拌1.5小时，再经由冷凝降温而得到本发明的温敏型佐剂s2。接着，使用动态光散射仪检测在25℃、37℃、50℃、及60℃时温敏型佐剂s2的粒径分布，计算出平均粒径并记录于表1中。

《制备例3》

首先，将6.0kg的壳聚糖(脱乙酰程度为80％，分子量在80万)、及0.1kg的甘油一起加入调配瓶中，利用搅拌机(型号:uhm-10，厂牌:nihonseiki日本)在无菌环境中以温度50℃、搅拌转速1500rpm、ph值为6.5的条件下，进行反应3小时；确认混合均匀后再加入1.0kg的聚丙烯酸并持续搅拌10小时，进而得到组成物a3。

接着，如表1所示，将0.2kg的芦荟胶质萃取物(利用70％酒精来萃取1000g芦荟，进一步可以萃取出芦荟胶质萃取物的有效成分，制成酊剂的形式使用，其浓度为18.8g/ml，并含有20％以上的芦荟苷)、以及0.05kg的β-葡聚糖(黏度为4.0mm²/s、平均分子量约为1.69×10⁴、和ph值为5.5)一起加入2.65kg的磷酸盐缓冲液中，在无菌环境中于室温下以搅拌转速700rpm均匀搅拌2小时而得到组成物b3，且所述组成物b2的黏度为2.1×10⁶mpa·s。

然后，将组成物b3以滴管慢慢滴入组成物a3中，并继续利用超高速均质机以900rpm、60℃的条件均质搅拌2小时，再经由冷凝降温而得到本发明的温敏型佐剂s3。接着，使用动态光散射仪检测在25℃、37℃、50℃、及60℃时温敏型佐剂s3的粒径分布，计算出平均粒径并记录于表1中。

表1

图1为温敏型佐剂s1、s2及s3的平均粒径随温度变化的趋势图。由图2可知，当温度升高时，温敏型佐剂s1、s2及s3的粒径大小也会随的增加，表示本发明的温敏型佐剂s1、s2及s3的型态会随着温度变化而改变。

《两相平衡系统试验》

将上述制备例1至3所得到的温敏型佐剂s1至s3分别与磷酸盐缓冲液(pbs)以如表2所示的体积比例混合并进行加温，观察不同比例的混合液由液体转变为凝胶的过程，并将相变温度记录于表2中。

表2

接着，将上述表2的数据资料绘制成图2。由表2及图2的结果可知，当温敏型佐剂在s1至s3在混合液中的重量比为15％时，其由液体转变为胶体的相变温度为分别在43℃、42.5℃、45℃；当温敏型佐剂在s1至s3在混合液中的重量比为20％时，其由液体转变为胶体的相变温度为分别在37℃、36℃、37.5℃；当温敏型佐剂在s1至s3在混合液中的重量比为25％时，其由液体转变为胶体的相变温度为分别在30℃、32.5℃、31℃；当温敏型佐剂在s1至s3在混合液中的重量比为30％时，其由液体转变为胶体的相变温度为分别在26℃、27℃、26℃；当温敏型佐剂在s1至s3在混合液中的重量比为35％时，其由液体转变为胶体的相变温度为分别在23℃、22℃、24℃；当温敏型佐剂在s1至s3在混合液中的重量比为40％时，其由液体转变为胶体的相变温度为分别在21℃、20℃、22.5℃；当温敏型佐剂在s1至s3在混合液中的重量比为35％时，其由液体转变为胶体的相变温度为分别在23℃、22℃、24℃；当温敏型佐剂在s1至s3在混合液中的重量比为40％时，其由液体转变为胶体的相变温度为分别在21℃、20℃、22.5℃；当温敏型佐剂在s1至s3在混合液中的重量比为45％时，其由液体转变为胶体的相变温度为分别在19℃、20℃、19℃；当温敏型佐剂在s1至s3在混合液中的重量比为50％时，其由液体转变为胶体的相变温度为分别在17℃、18℃、16℃。

由于一般家禽的体温大约在37～40℃左右，考虑到疫苗的保存方式及家禽的正常体温，因此本发明的所述温敏型佐剂(adj)与病毒抗原液(vat)的掺混比的比例可以是约1：4(v/v)～1：1(v/v)；在某些具体实施例中，较佳为约1：4(v/v)～2：3(v/v)；更佳为约1：4(v/v)～3：7(v/v)；最佳为约1：4(v/v)。

《经皮吸收附着效果测试》

首先，取4cmx4cm大小的新鲜猪皮共四片，分别为猪皮m1至m4，再将猪皮上的猪毛剃除，并以清水冲洗除去皮下组织；然后以紫外光手电筒进行照射并拍照纪录，所得照片如图3a所示。

接着，将磷酸盐缓冲液(pbs)、红色萤光蛋白、用pbs稀释两倍的温敏型佐剂s1(2x)、用pbs稀释五倍的温敏型佐剂s1(5x)以及温敏型佐剂s1的原液以如表3所示的比例混合均匀，得到混合液p1至p4，并将混合液p1至p4分别以装入喷雾罐中均匀喷洒至猪皮m1至m4的表面上；然后以紫外光手电筒进行照射观察红色萤光蛋白附着于猪皮m1至m4表面的情形并拍照纪录，所得照片如图3b所示。

将猪皮m1至m4静置于室温2个小时后，再以紫外光手电筒进行照射观察红色萤光蛋白附着于猪皮m1至m4表面的情形并拍照纪录，所得照片如图3c所示。

表3

由图3b的照片可确认混合液p1至p4皆经由喷雾瓶喷洒至猪皮m1至m4的表面上，但经过两个小时后，由图3c的照片可观察到猪皮m1的表面上已无红色萤光蛋白的反应，显示红色萤光蛋白已完全被猪皮m1所吸收；而猪皮m2至m4皆仍能够观察到红色萤光蛋白的反应，而且随着温敏型佐剂的浓度越高，红色萤光蛋白的反应越强烈，显示本发明的温敏型佐剂能够有效延长药物释放的时间，具有缓释的作用。

将20ml的温敏型佐剂s1至s3分别放入烧杯中，并使用均质机以3000rpm的转速进行搅拌，然后缓缓加入80ml的1mg/ml牛血清蛋白溶液(牛血清蛋白重量为80mg)，当全部加完的后再将转速调成5000rpm持续搅拌10分钟。

接着，将搅拌完成的混合液加热至38℃，使其凝固成胶体，并将胶体放入10ml的pbs(ph7.4,10mm,38℃)中轻微摇晃，使残留在胶体表面没有包覆进去的牛血清蛋白完全溶解在pbs中，并将澄清液分离出来后置入uv分光光度计中，测量在280nm下的吸收值，并以牛血清蛋白溶液的标准曲线换算出牛血清蛋白的浓度，因澄清液的总体积为10ml，将总体积成上浓度即为澄清液中所含的牛血清蛋白重量，而包覆率的计算公式如下：

计算而得的包覆率如表4所示。

另外，在比较例1中使用制备例2中所得的的组合物a1，其余操作条件于前述相同，并计算组合物a1的包覆率。

表4

由上述表4的结果可知，在比较例2中仅使用组合物a1时对于牛血清蛋白的包覆率仅有85.1％，而在实施例4至6中所使用的温敏型佐剂s1、s2、及s3对于牛血清蛋白的包覆率分别为99.5％、98.1％、及97.4％，皆优于比较例2的结果，显示在添加胶质萃取物后的本发明的温敏型佐剂具有良好的包覆率，能将有效将抗原包覆其中，减少原料损耗。

《活毒疫苗的力价验证》

首先，将磷酸盐缓冲液(pbs)、制备例1至3中所得的温敏型佐剂s1至s3以如表4所示的比例分别放入2000毫升的烧杯中，并将均质机放入烧杯中，让烧杯中的溶液覆盖于均质机的搅拌棒达2/3(约15公分)后，转动均质机(型号:t.t-s.m-s，厂牌:台湾大鼎机械)的高速剪切力至3000rpm，再缓缓将如表4所示的比例的vii基因型新城病活毒抗原液(10^6.5tcid50/ml)加入转动中的溶液中；最后，当抗原液都加完时可将转速调成5000rpm，再进行最后搅拌时间五至十分钟，制成活毒疫苗v1至v5。

接着，将上述所得到的活毒疫苗v1至v5分别以皮下注射方式施打于免疫1日龄鸡只，每一实施例施打6只，每只鸡施打的疫苗剂量为0.2ml，并于1周、2周及3周后采血分离待测血清。

其次，进行血球凝集(hemagglutination；ha)试验，即在96孔u型盘上的每一排加入25μl的0.85％生理盐水，再于第1排加入25μl的待测血清。

接下来利用微量吸管充分混合后，取第2排的待测血清25μl加入第二孔，以再取25μl加入第3排，以此顺序稀释至第10排，抗原呈现2倍至1024倍稀释，第11排中的25μl混合液不使用。每排并以3孔相同样本重复进行测试。

然后，以hi缓冲剂稀释vii基因型新城病抗原液至每25μl稀释液中含有8hau的vii基因型新城病抗原液，并且于每一孔中加入25μl稀释液并静置15分钟。

接着，再于每孔加入50μl0.96％红血球悬浮液，经室温下静置60分钟后判读血球是否有凝集作用，而仍具有血球凝集作用的最高抗原稀释倍数为抗体力价，然后将各实施例及比较例每组6只鸡只试验结果的抗体力价的平均值分别记录于表4并绘制成图4。

表4

由上述表3及图4的结果可知，在比较例3中，仅施打pbs的鸡只体内并未产生抗体，而在比较例4中，施打以pbs作为佐剂所制成的活毒疫苗v2的鸡只在第1周时体内的抗体力价仅爬升至64，的后第2周及第3周逐周下滑至40和20。相对地，在实施例7～实施例9中，经施打添加有本发明的温敏型佐剂的活毒疫苗v3～v4的鸡只，其体内的抗体力价在第1周即迅速爬升至128，在第2周及3周时虽有下滑，但其体内的抗体力价仍较以pbs作为佐剂所制成的活毒疫苗v2高。

《灭活疫苗的力价验证》

首先，将磷酸盐缓冲液(pbs)、制备例1至3中所得的温敏型佐剂s1至s3以如表4所示的比例分别放入2000毫升的烧杯中，并将均质机放入烧杯中，让烧杯中的溶液覆盖于均质机的搅拌棒达2/3(约15公分)后，转动均质机(型号:t.t-s.m-s，厂牌:台湾大鼎机械)的高速剪切力至3000rpm，再缓缓将如表4所示的比例vii基因型新城病灭活抗原液(10^8.5tcid50/ml)加入转动中的溶液中；最后，当抗原液都加完时可将转速调成5000rpm，在进行最后搅拌时间五至十分钟，制成灭活疫苗x1至x5。

接着，将上述所得到的灭活疫苗x1至x5分别以皮下注射方式施打于免疫一周龄鸡只，每一实施例及比较例施打6只，然后，在二周龄时施打第二次。每只鸡施打的疫苗剂量为0.2ml，并于1周、2周、3周、4周、5周及6周采血分离待测血清。

其次，进行血球凝集(hemagglutination；ha)试验，即在96孔u型盘上的每一排加入25μl的0.85％生理盐水，再来于第1排加入25μl的待测血清。

接下来利用微量吸管充分混合后，取第2排的待测血清25μl加入第二孔，以再取25μl加入第3排，以此顺序稀释至第10排，抗原呈现2倍至1024倍稀释，第11排中的25μl混合液不使用。每排并以3孔相同样本重复进行测试。

然后，以hi缓冲剂稀释vii基因型新城病抗原液至每25μl稀释液中含有8hau的vii基因型新城病抗原液，并且于每一孔中加入25μl稀释液并静置15分钟。

接着，再于每孔加入50μl0.96％红血球悬浮液，经室温下静置60分钟后判读血球是否有凝集作用，而仍具有血球凝集作用的最高抗原稀释倍数为抗体力价，然后将各实施例及比较例每组6只鸡只试验结果的抗体力价的平均值分别记录于表5并绘制成图5。

表5

由上述表5及图5的结果可知，在比较例5中，仅施打pbs的鸡只体内并未产生抗体，而在比较例6中，施打以pbs作为佐剂所制成的灭活疫苗x2的鸡只在第1周时体内的抗体力价仅爬升至64，的后第2周持续爬升至400，第3周开始下滑至200，第4周至第6周则维持在180。相对地，在实施例3～实施例5中，经施打添加有本发明的温敏型佐剂的活毒疫苗x3～x4的鸡只，其体内的抗体力价在第1周即迅速爬升至120以上，在第2周时更达到了371以上，虽然第3周后开始略有下滑，但在第4周至第6周时鸡只体内的抗体力价仍可维持在500以上。

从而，可以确认经施打使用本发明的温敏型佐剂的疫苗的动物能够增加免疫保护能力，进而具有对抗病毒感染的优异的效果。所以，本发明的温敏型佐剂能够明显地提高动物的免疫力及免疫细胞增殖，增强疫苗对动物在传染疾病上诱发保护性免疫反应。

综上所述，本发明的内容已经以如上的实施例举例说明了，然而本发明并非仅限定于此等实施方式而已。本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，可再进行各种的更动与修饰；例如，将前述实施例中所例示的各技术内容加以组合或变更而成为新的实施方式，此等实施方式也当然视为本发明所属内容。因此，本案所欲保护的范围也包括权利要求书及其所界定的范围。