一种肿瘤疫苗治疗方法与流程
本发明涉及医疗技术领域，具体为一种肿瘤疫苗治疗方法。
背景技术：
所谓肿瘤疫苗治疗,实际上是生物治疗的一种重要手段,可通过激活机体自身的免疫而达到主动识别并有效杀死恶性肿瘤细胞的目的,具有高度特异性。肿瘤疫苗还可诱发免疫记忆细胞,产生长效免疫效应,防止肿瘤的转移和复发,因此肿瘤治疗性疫苗是一种理想的特异性主动免疫治疗手段。肿瘤疫苗以肿瘤抗原为基础,通过合适的抗原递送系统和疫苗佐剂,激活机体特异性免疫应答,包括体液免疫和细胞免疫,尤其是cd8+t细胞(杀伤性t细胞,ctls),产生抗肿瘤免疫应答"肿瘤疫苗的抗肿瘤免疫活性不仅在动物实验中已得到证实,目前多种肿瘤疫苗已进入临床试验阶段,传统的肿瘤治疗手段一般是手术或者是化疗，给患者带来不同程度的副作用，治疗效果也不是十分理想。
技术实现要素：
本发明提供一种肿瘤疫苗治疗方法，npc不仅来源广泛，获取方便；增殖能力强，具有较强的细胞活性；具有良好的分化调控性；具备多向分化潜能；可作为基因治疗的良好载体；同时通过本方法进行试验，可以看出在治疗4周后患儿的粗大运动功能中卧位与翻身、坐位、行走与主动抓握及手眼协调能力均得到明显改善，所以本发明可以直接阻止脑损伤进程或促进损伤神经的再生，可以有效解决上述背景技术中的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：包括如下步骤：
1.1受试者的准备
1.1.1纳入排除标准
(1)纳入标准：
a,符合结直肠癌手术适应征者；
b,白细胞(wbc)及血小板(pl)计数正常，血红蛋白(hb)>10g/l；
c,肝肾功能正常。
(2)排除标准：
a,脑转移者；
b,复用其它具有免疫抑制作用的抗癌药物；
c,伴随自身免疫疾病者。
1.1.2术前检查
(1)血液学检查：如生化、血常规、乙肝五项、性病三项等，心电图、b超检查；
(2)腹部平片：检查是否属于富于血运的肿瘤；
(3)医师心理辅导，使患者从心理上消除紧张、恐惧，增强信心。
1.1.3知情同意
受试者自愿接受肿瘤疫苗治疗，并已充分了解肿瘤疫苗治疗的风险及可能出现的并发症。
1.2肿瘤组织的切除
1.2.1体位的选择：根据患者肿瘤的部位选择使用的体位；
1.2.2切口的选择：根据拍摄片子中肿瘤位置确定切口位置；
1.2.3麻醉：采用丙泊酚、氯胺酮、咪达唑仑、利多卡因基础麻醉，术中常规吸氧并监测生命体征，出现紧急情况参照应急预案处理；
1.2.4肿瘤切除：在手术显微镜的辅助下进行肿瘤切除。
1.3术后处理
1.3.1术后心电监护6小时；
1.3.2骶前闭式引流，引流液正常者术后4－5天拔除，有异常情况者对症处理，尿管术后5－6天拔除；
1.3.3加强护理，由护士第2－3给予流质饮食，逐渐增加量和过渡到普通饮食；
1.3.42天内预防感染，术后开始抗生素静脉点滴7天；
1.3.5功能训练：术后48小时后在相关科室附设的康复中心接受相应的综合康复训练；
1.3.6术后定期复查：血常规，腹部ct每月1次，如有复发则立即停止gp96–多肽复合物免疫治疗，结合病情安排常规化疗或再手术等其他治疗。
1.4gp96–多肽复合物纯化：
1.4.1肿瘤组织破碎
(1)将手术所取肿瘤组织研碎后，过滤一次，用300目网筛；
(2)按固体物体积比1/10，加入低渗裂解液，4摄氏度浸10分钟后再粉碎；
(3)将低渗裂解液浸泡物放入超声粉碎机，破碎三次，每次4秒，在冰水中进行，再离心，1小时，取上清液。
1.4.2肿瘤组织中scm流式分选并体外扩增
(1)手术所取肿瘤组织量少，预估不足以提供足够hsppc-gp96时(非坏死肿瘤组织≤5g)；将肿瘤组织制备悬液并进行结直肠癌细胞建株及传代。a,在15ml无菌离心管中准备5mlbasalmedium1+培养液；b,在无菌条件下从手术切除的新鲜肿瘤组织边缘处切取直径约2～3mm组织立即转移到5mlbasalmedium1+中；c,在生物安全柜中将组织块及培养液倒入无菌培养皿；d,将组织块切成0.5mm或更细小的碎片，转移到15ml离心管；5.5mlpbs润洗培养皿后转移到同一离心管，1500rpm5min离心；e,弃上清后10mlpbs洗涤，1500rpm5min离心，重复3次；f,从冰箱取出基质胶待其在冰上缓慢溶解；g,组织碎片最后一次离心后弃上清，向试管中加入10ml消化液和100ul，轻轻混匀后放入37℃消化60min，每隔10min震荡混合一次；h,离心，弃上清后10mlpbs洗涤2次并离心；i,用5mlpbs将消化的组织块重新悬浮，用100μl微量加样器将细小组织挑出，与300μlbasalmedium1+和300μl基质胶混合，接种到12孔板上待基质胶变硬，再加入1mlbasalmedium1+，余下的用70μm细胞滤网过滤，将>和<70μm的组织块离心后分别转入2个超低吸附培养皿添加12mlscm培养液。j,基质胶中细胞回收：对于基质胶中的细胞团，显微镜下确认细胞克隆生长良好时，将12孔板从培养箱取出吸走培养液，每孔加冰pbs，并放在冰上至少10min，基质胶慢慢溶解，其中的细胞团随之进入pbs，转移到无菌离心管，离心、弃上清、洗涤3次。k,传代：培养液颜色变黄或一周后更换培养液；
(2)再将分选肿瘤细胞放置37℃培养箱培养，加入含重组粒细胞集落刺激因子(recombinantgranulocyte-colonystimulatingfactor,rhg-csf)(美国,sciencell,ca102-02)的scm完全培养基刺激肿瘤细胞的体外扩增，收集到足够量scm细胞,提取gp96-多肽复合物；
(3)按扩增细胞每瓶t25cm2，加入低渗裂解液2ml，4℃浸10min后再粉碎；
(4)将低渗裂解液浸泡物放入超声粉碎机，破碎3次，每次4秒，在冰水中进行，再离心，1小时，取上清液。
临床治疗
gp96–多肽复合物的注射免疫
(1)术后4-6周开始，25μg；皮下注射；每周一次；共四次；
(2)首轮治疗结束8周后，2.5μg、25μg或100μg；皮内注射；每周一次；共四次(第一个疗程)；
(3)二轮治疗结束8周后，2.5μg、25μg或100μg；皮内注射；每两周一次；共四次(第二个疗程)
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：所述乙肝五项：①乙肝表面抗原(hbsag)、②乙肝表面抗体(抗-hbs)、③乙肝e抗原(hbeag)、④乙肝e抗体(抗-hbe)、⑤乙肝核心抗体(抗-hbc)。
根据上述技术方案，所述遗传代谢病筛查包括氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢筛查和酶学筛查；所述染色体分析及基因病筛查包括染色体分析和g显带分析；所述常见传染病筛查包括乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒标志物、巨细胞病毒(cmv)和eb病毒。
根据上述技术方案，成熟的gp96蛋白由4个结构域组成：n端结构域,含有atp/核苷酸药物结合区及结合抗原肽的区域；带电铰链区，位于n端结构域之后，是gp96发挥活性必需的，调节gp96构象的改变；中间结构域，含有参与蛋白-蛋白相互作用的亮氨酸拉链和keke区；c端结构域含有二聚化区,还有内质网定位信号kdel基序。gp96n端的21个氨基酸的信号肽介导gp96分子进入内质网,进入内质网后信号肽被切除,gp96分子通过c端的kdel序列与内质网中的kdel受体相互作用滞留在内质网。
根据上述技术方案，所述上清液经cona-sepharose层析柱透析浓缩后，再用快速液相蛋白系统(fplc)、过deae-52层析柱进行第二次分离，用20-500mmol/lnacl洗脱，浓缩样品按1:5比例配deae-52，经上述步骤得到的hsps可达电脉纯。
根据上述技术方案，层析时省去cona-sepharose层析柱步骤，而只用deae-52层析柱进行两次层析分离，细胞破碎后，直接于fplc系统上过deae-52柱，用20-500mmol/lnacl洗脱。收集各峰蛋白，行sds-page，再行western-blot，然后寻找hsps的相应蛋白峰，再行一次deae-52，以纯化，再纯度及产率，直到hsps达到电脉纯。
根据上述技术方案，所述肿瘤的血运障碍的检查诊断：
7.1临床症状
7.1.1腹痛，为阵发性绞痛；
7.1.2呕吐，早期为反射性；晚期可为频繁呕吐，高位梗阻呕吐早，低位者呕吐迟；
7.1.3腹胀，一般高位者不明显；低位或麻痹性显著且范围广；
7.1.4肛门停止排便排气，高位或梗阻早期仍可有排气，有绞窄者可排粘液血便；
7.1.5可见肠型及蠕动波，肠鸣音亢进伴气过水声，腹膜炎、压痛及反跳痛为肠绞窄表现。
7.2诊断依据
7.2.1阵发性腹绞痛为早期或不全梗阻之表现；而持续性腹痛阵发性加重则为绞窄性梗阻早期特点。剧烈的持续性腹痛为梗阻晚期表现且可出现休克症状；
7.2.2早期频繁呕吐多为高位梗阻，出现较明显腹胀后才出现呕吐多为低位梗阻；
7.2.3停止肛门排气、排便；
7.2.4腹胀伴肠型、蠕动波、肠鸣音亢进和气过水声；
7.2.5局限或广泛腹部压痛反跳痛或抽出血性腹液为肠绞窄或穿孔、腹膜炎表现；
7.2.6腹平片中显示明显扩张肠管及气液面；
7.2.7明显或严重的全身性脱水伴电解质及酸碱平衡紊乱。
与现有技术相比，本发明的有益效果：按照免疫程序,给患者皮下或皮内注射肿瘤自体gp96疫苗，gp96与抗原呈递细胞(巨噬细胞和树突状细胞等)表面的热休克蛋白受体(cd91,cd36,sr-a,lox-1,tlr2和tlr4等)相互作用,促进抗原呈递细胞的成熟和激活，抗原呈递细胞的激活和成熟是通过上调细胞表面的分子(mhci，mhcⅱ，成熟标志物cd83以及共刺激分子cd86/cd80和cd40等)和分泌细胞因子和趋化因子(tnf-a,il-1
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
在附图中：
图1为本发明的流程框图；
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：如图1所示，本发明提供一种肿瘤疫苗治疗方法，包括如下步骤：
1.术前准备
1.1受试者的准备
1.1.1纳入排除标准
(1)纳入标准：
a,符合结直肠癌手术适应征者；
b,白细胞(wbc)及血小板(pl)计数正常，血红蛋白(hb)>10g/l；
c,肝肾功能正常。
(2)排除标准：
a,脑转移者；
b,复用其它具有免疫抑制作用的抗癌药物；
c,伴随自身免疫疾病者。
1.1.2术前检查
(1)血液学检查：如生化、血常规、乙肝五项、性病三项等，心电图、b超检查；
(2)腹部平片：检查是否属于富于血运的肿瘤；
(3)医师心理辅导，使患者从心理上消除紧张、恐惧，增强信心。
1.1.3知情同意
受试者自愿接受肿瘤疫苗治疗，并已充分了解肿瘤疫苗治疗的风险及可能出现的并发症。
1.2肿瘤组织的切除
1.2.1体位的选择：根据患者肿瘤的部位选择使用的体位；
1.2.2切口的选择：根据拍摄片子中肿瘤位置确定切口位置；
1.2.3麻醉：采用丙泊酚、氯胺酮、咪达唑仑、利多卡因基础麻醉，术中常规吸氧并监测生命体征，出现紧急情况参照应急预案处理；
1.2.4肿瘤切除：在手术显微镜的辅助下进行肿瘤切除。
1.3术后处理
1.3.1术后心电监护6小时；
1.3.2骶前闭式引流，引流液正常者术后4－5天拔除，有异常情况者对症处理，尿管术后5－6天拔除；
1.3.3加强护理，由护士第2－3给予流质饮食，逐渐增加量和过渡到普通饮食；
1.3.42天内预防感染，术后开始抗生素静脉点滴7天；
1.3.5功能训练：术后48小时后在相关科室附设的康复中心接受相应的综合康复训练；
1.3.6术后定期复查：血常规，腹部ct每月1次，如有复发则立即停止gp96–多肽复合物免疫治疗，结合病情安排常规化疗或再手术等其他治疗。
1.4gp96–多肽复合物纯化：
1.4.1肿瘤组织破碎
(1)将手术所取肿瘤组织研碎后，过滤一次，用300目网筛；
(2)按固体物体积比1/10，加入低渗裂解液，4摄氏度浸10分钟后再粉碎；
(3)将低渗裂解液浸泡物放入超声粉碎机，破碎三次，每次4秒，在冰水中进行，再离心，1小时，取上清液。
1.4.2肿瘤组织中scm流式分选并体外扩增
(1)手术所取肿瘤组织量少，预估不足以提供足够hsppc-gp96时(非坏死肿瘤组织≤5g)；将肿瘤组织制备悬液并进行结直肠癌细胞建株及传代。a,在15ml无菌离心管中准备5mlbasalmedium1+培养液；b,在无菌条件下从手术切除的新鲜肿瘤组织边缘处切取直径约2～3mm组织立即转移到5mlbasalmedium1+中；c,在生物安全柜中将组织块及培养液倒入无菌培养皿；d,将组织块切成0.5mm或更细小的碎片，转移到15ml离心管；5.5mlpbs润洗培养皿后转移到同一离心管，1500rpm5min离心；e,弃上清后10mlpbs洗涤，1500rpm5min离心，重复3次；f,从冰箱取出基质胶待其在冰上缓慢溶解；g,组织碎片最后一次离心后弃上清，向试管中加入10ml消化液和100ul，轻轻混匀后放入37℃消化60min，每隔10min震荡混合一次；h,离心，弃上清后10mlpbs洗涤2次并离心；i,用5mlpbs将消化的组织块重新悬浮，用100μl微量加样器将细小组织挑出，与300μlbasalmedium1+和300μl基质胶混合，接种到12孔板上待基质胶变硬，再加入1mlbasalmedium1+，余下的用70μm细胞滤网过滤，将>和<70μm的组织块离心后分别转入2个超低吸附培养皿添加12mlscm培养液。j,基质胶中细胞回收：对于基质胶中的细胞团，显微镜下确认细胞克隆生长良好时，将12孔板从培养箱取出吸走培养液，每孔加冰pbs，并放在冰上至少10min，基质胶慢慢溶解，其中的细胞团随之进入pbs，转移到无菌离心管，离心、弃上清、洗涤3次。k,传代：培养液颜色变黄或一周后更换培养液；
(2)再将分选肿瘤细胞放置37℃培养箱培养，加入含重组粒细胞集落刺激因子(recombinantgranulocyte-colonystimulatingfactor,rhg-csf)(美国,sciencell,ca102-02)的scm完全培养基刺激肿瘤细胞的体外扩增，收集到足够量scm细胞,提取gp96-多肽复合物；
(3)按扩增细胞每瓶t25cm2，加入低渗裂解液2ml，4℃浸10min后再粉碎；
(4)将低渗裂解液浸泡物放入超声粉碎机，破碎3次，每次4秒，在冰水中进行，再离心，1小时，取上清液。
1.5临床治疗
gp96–多肽复合物的注射免疫：
(1)术后4-6周开始，25μg；皮下注射；每周一次；共四次；
(2)首轮治疗结束8周后，2.5μg、25μg或100μg；皮内注射；每周一次；共四次(第一个疗程)；
(3)二轮治疗结束8周后，2.5μg、25μg或100μg；皮内注射；每两周一次；共四次(第二个疗程)。
1.6治疗效果
29名接受源于自体肿瘤的gp96多肽复合物治疗受试的结直肠癌病人,tnm分期iii期-ⅳ期，15名病人产生ⅰ类hla限制性t细胞介导的抗结肠癌应答；未见有相关的毒副作用；产生免疫应答的病人其临床表现明显优于未产生应答的病人(p<0.05)，2年期总生存率分别为100％和50％,无症状生存率分别为51％和8％。
2.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：所述乙肝五项：①乙肝表面抗原(hbsag)、②乙肝表面抗体(抗-hbs)、③乙肝e抗原(hbeag)、④乙肝e抗体(抗-hbe)、⑤乙肝核心抗体(抗-hbc)。
3.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：所述遗传代谢病筛查包括氨基酸、有机酸、脂肪酸代谢筛查和酶学筛查；所述染色体分析及基因病筛查包括染色体分析和g显带分析；所述常见传染病筛查包括乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒标志物、巨细胞病毒(cmv)和eb病毒。
4.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：成熟的gp96蛋白由4个结构域组成：n端结构域,含有atp/核苷酸/药物结合区及结合抗原肽的区域；带电铰链区，位于n端结构域之后，是gp96发挥活性必需的，调节gp96构象的改变；中间结构域，含有参与蛋白-蛋白相互作用的亮氨酸拉链和keke区；c端结构域含有二聚化区,还有内质网定位信号kdel基序。gp96n端的21个氨基酸的信号肽介导gp96分子进入内质网,进入内质网后信号肽被切除,gp96分子通过c端的kdel序列与内质网中的kdel受体相互作用滞留在内质网。
5.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：所述上清液经cona-sepharose层析柱透析浓缩后，再用快速液相蛋白系统(fplc)、过deae-52层析柱进行第二次分离，用20-500mmol/lnacl洗脱，浓缩样品按1:5比例配deae-52，经上述步骤得到的hsps可达电脉纯。
6.根据权利要求1和3所述的分离纯化方法，其特征在于：层析时省去cona-sepharose层析柱步骤，而只用deae-52层析柱进行两次层析分离，细胞破碎后，直接于fplc系统上过deae-52柱，用20-500mmol/lnacl洗脱。收集各峰蛋白，行sds-page，再行western-blot，然后寻找hsps的相应蛋白峰，再行一次deae-52，以纯化，再纯度及产率，直到hsps达到电脉纯。
7.根据权利要求1所述的一种肿瘤疫苗治疗方法，其特征在于：所述肿瘤的血运障碍的检查诊断：
7.1临床症状
7.1.1腹痛，为阵发性绞痛；
7.1.2呕吐，早期为反射性；晚期可为频繁呕吐，高位梗阻呕吐早，低位者呕吐迟；
7.1.3腹胀，一般高位者不明显；低位或麻痹性显著且范围广；
7.1.4肛门停止排便排气，高位或梗阻早期仍可有排气，有绞窄者可排粘液血便；
7.1.5可见肠型及蠕动波，肠鸣音亢进伴气过水声，腹膜炎、压痛及反跳痛为肠绞窄表现。
7.2诊断依据
7.2.1阵发性腹绞痛为早期或不全梗阻之表现；而持续性腹痛阵发性加重则为绞窄性梗阻早期特点。剧烈的持续性腹痛为梗阻晚期表现且可出现休克症状；
7.2.2早期频繁呕吐多为高位梗阻，出现较明显腹胀后才出现呕吐多为低位梗阻；
7.2.3停止肛门排气、排便；
7.2.4腹胀伴肠型、蠕动波、肠鸣音亢进和气过水声；
7.2.5局限或广泛腹部压痛反跳痛或抽出血性腹液为肠绞窄或穿孔、腹膜炎表现；
7.2.6腹平片中显示明显扩张肠管及气液面；
7.2.7明显或严重的全身性脱水伴电解质及酸碱平衡紊乱。
基于上述，本发明的优点在于，按照免疫程序,给患者皮下或皮内注射肿瘤自体gp96疫苗，gp96与抗原呈递细胞(巨噬细胞和树突状细胞等)表面的热休克蛋白受体(cd91,cd36,sr-a,lox-1,tlr2和tlr4等)相互作用,促进抗原呈递细胞的成熟和激活，抗原呈递细胞的激活和成熟是通过上调细胞表面的分子(mhci，mhcⅱ，成熟标志物cd83以及共刺激分子cd86/cd80和cd40等)和分泌细胞因子和趋化因子(tnf-a,il-1
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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