PD-1抑制剂与PP2A磷酸酶抑制剂在膀胱癌治疗药物中的应用的制作方法

本发明仅涉及用pd-1抗体与pp2a磷酸酶抑制剂lb100的联合作用来抑制小鼠肿瘤的生长，从而达到治疗膀胱癌的目的，属于医疗技术领域。

背景技术：

近几年，免疫疗法已经成为治疗癌症的有效疗法。pd-1/pd-l1免疫疗法是当前备受瞩目的新一类抗癌免疫疗法，旨在利用人体自身的免疫系统抵御癌症，通过阻断pd-1/pd-l1信号通路使癌细胞死亡，具有治疗多种类型肿瘤的潜力。

pd1全称是程序性死亡因子-1，是重要的免疫抑制受体，主要表达于活化的t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、单核细胞以及间充质干细胞。pd-l1(程序性死亡配体-1)和pd-l2(程序性死亡配体-2)是pd1的配体，是免疫反应中重要的负性调控因子。pd-l1蛋白主要表达于抗原提呈细胞、活化的t细胞、b细胞、巨噬细胞、胎盘滋养层细胞、心脏内皮细胞和胸腺皮质上皮细胞。

pd-l1、pd-1是膀胱癌治疗的重要靶点。位于肿瘤细胞表面的pd-l1能够与活化的b细胞、t细胞和巨噬细胞表面的pd-1相互结合，导致免疫逃避，从而使得肿瘤细胞得以生存。目前，针对pd-1/pd-l1的抑制药物在不同的肿瘤治疗中取得了很好的结果。

pp2a(蛋白磷酸酶2a)是一种普遍存在的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶，可以通过atm/atr依赖的和非依赖的方式调控多种蛋白的磷酸化。之前的报道表明pp2a的抑制可使癌细胞对dna损伤应答敏感，从而导致细胞周期异常，dna修复抑制和细胞凋亡。另外，有研究表明，pp2a的表达对treg细胞的功能有重要调节作用，抑制pp2a活性能抑制treg细胞作用，引起自身免疫增强。

lb100是pp2a的抑制剂，在黑色素瘤，转移性嗜铬细胞瘤和胰腺癌治疗中，lb100能够分别增强替莫唑胺，多柔比星和放射治疗的细胞毒性。

技术实现要素：

本发明涉及pd-1单克隆抗体和pp2a磷酸酶抑制剂lb100的联合用药治疗膀胱癌的新方法。

实验结果表明，pd-1单克隆抗体协同pp2a磷酸酶抑制剂lb100，能够增强免疫细胞对膀胱癌肿瘤细胞的杀伤活性，有效抑制肿瘤生长。

所述药物混合物，包括pd-1单克隆抗体和蛋白磷酸酶pp2a抑制剂lb100。

所述pd-1单克隆抗体和蛋白磷酸酶pp2a抑制剂lb100的质量比为60：1～65：1，优选为62.5：1。

所述药物混合物应用在制备治疗膀胱癌药物中。

所述药物为注射药物，pd-1单克隆抗体注射药物浓度为0.15～0.25mg/匹，优选为0.2mg/匹；lb100注射药物浓度0.15～0.18mg/kg，优选为0.16mg/kg。

附图说明

图1为细胞pd-l1蛋白western检测图。收取nih3t3、mbt-2、mb49细胞蛋白。利用westernblot实验检测各个细胞pd-l1蛋白表达水平。图2为肿瘤的体积生长曲线。mb49(a)和mbt-2(b)细胞进行扩大培养，用基质胶固定，进行小鼠背部两侧种瘤。细胞接种后第三天，随机将小鼠分为四组，每组分5只，一组作为对照，另外三组分别用pd-1单克隆抗体和lb100单独处理以及两个药物联合处理。

具体实施方式

现结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。

实施例1pp2a蛋白磷酸酶抑制剂lb100和pd-1单克隆抗体的溶液制备。

lb100用ddh2o溶解制备成储存液浓度为5mg/ml。将上述lb100储存液加5％葡萄糖稀释至0.16mg/kg作为动物实验注射浓度。pd-1单克隆抗体加5％葡萄糖稀释至0.2mg/匹作为动物实验注射浓度。

实施例2小鼠膀胱癌细胞mbt-2、mb49细胞pd-l1蛋白表达水平检测。

选取mbt-2、mb49细胞作为研究对象，nih3t3细胞为对照，按照文献“targetingkdm1aattenuateswnt/β-cateninsignalingpathwaytoeliminatesorafenib-resistantstem-likecellsinhepatocellularcarcinoma”的条件检测细胞pd-l1蛋白表达水平。将mbt-2、mb49细胞铺到10cm皿中，于co2(5％)培养箱中培养24小时后，按照文献“targetingkdm1aattenuateswnt/β-cateninsignalingpathwaytoeliminatesorafenib-resistantstem-likecellsinhepatocellularcarcinoma”条件收取细胞蛋白。利用westernblot实验检测pd-l1蛋白表达水平。最终结果如图1所示。

实施例3pd-1单克隆抗体和pp2a磷酸酶抑制剂lb100的联合用药治疗膀胱癌。

将小鼠膀胱癌细胞mbt-2和mb49进行扩大培养，用基质胶固定，选取c57bl6老鼠建立小鼠膀胱癌移植瘤模型。每一个瘤种植5x10⁵个细胞，接种小鼠背部两侧。小鼠接种后第三天，把小鼠随机分为四组，每组分5只，一组作为对照，另外三组分别用pd-1单克隆抗体和lb100单独处理以及两个药物联合处理。注射药物浓度：pd-1单克隆抗体--0.2mg/匹，lb100--0.16mg/kg，分别用5％葡萄糖水溶解。每隔一天通过腹腔将药物注射到小鼠体内，每次测量肿瘤的体积。最终结果如图2所示。

技术特征：

技术总结
本发明公开PD‑1抑制剂PD‑1抗体和PP2A磷酸酶抑制剂LB100联合作用能够有效地抑制小鼠膀胱癌肿瘤的生长。具体采用的方法是将小鼠膀胱癌细胞种植到小鼠皮下使其成瘤，而后对小鼠进行给药处理，发现PD‑1抗体和LB100协同作用，能够增强免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤活性，有效地抑制小鼠肿瘤的生长，从而达到治疗膀胱癌的作用。

技术研发人员：刘扬;尹雅蕾
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：2017.11.28
技术公布日：2019.06.04