一种磷脂酶Dα活性的测定方法
【专利摘要】本发明提供了一种磷脂酶Dα活性的测定方法，是使用酶联比色法测定磷脂酶Dα活性的方法。其技术方案是以磷脂酰胆碱为底物，磷脂酶Dα催化水解其末端的磷酸二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶的催化作用下生成甜菜碱和H2O2，生成的H2O2在过氧化物酶催化下将4-氨基安替匹林和重蒸酚氧化成粉红色物质，测定该粉红物质的吸光度值，并根据事先制作的胆碱标准曲线，来确定相应的胆碱含量，并以此推算出磷脂酶Dα的活性。在200ul磷脂酶Dα的反应体系中，蛋白含量和Ca2+浓度在10ug和10mM为宜。本发明是一种高效便捷，灵敏度高，危害低，结果稳定，适于同时测定大量样品的磷脂酶Dα活性检测方法。
【专利说明】一种磷脂酶Da活性的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种测定磷脂酶Da活性的方法，具体涉及用酶联比色法测定磷 脂酶Da的活性以及涉及测定过程中关键参数的选择。
【背景技术】
[0002] 磷脂酶D (PLD)，即磷脂酰胆碱磷脂水解酶（EC3. 1. 4. 4)，是催化磷酸二酯键水解 和碱基交换反应的一类酶的总称。最先由Hanahan和Chaikoff从胡萝卜根和菠菜叶的提 取物中得到磷脂酶D。磷脂酶D广泛存在于从原核细菌到高等动植物在内的多种生物中，是 植物中主要的磷脂酶，主要存在于细胞膜上，细胞质中也存在少量。研究表明，在植物中磷 脂酶D具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成和抗逆境胁迫等生理功能。而磷脂酶 D α是植物体内最主要的磷脂酶D，它具有可催化自然的或人工合成的磷脂类的水解作用， 人们通过直接或间接测定水解作用生成物的量来表示磷脂酶Da的活性。目前PLDa活性 测定方法主要有，薄板层析法、放射性同位素标记法。薄板层析法检测结果准确，但操作费 时，易受外源性磷脂的干扰。放射性同位素标记法测定灵敏度高，误差小，重复性好，但易对 操作人员身体造成伤害，对实验设备要求较高很难普及。
[0003] 本发明选用磷脂酰胆碱为磷脂酶D a的水解底物，以4-氨基安替匹林和重蒸酚为 显色剂来制作的胆碱含量与测得的相应的红色物质吸光度值之间的标准关系曲线，以此推 算出待测物中磷脂酶Da的活力。该方法易于操作，灵敏度高，可快速测定磷脂酶Da的活 性。
【发明内容】
[0004] 针对已有技术的不足，本发明的目的是提供了一种磷脂酶Da活性的测定方法， 该方法采用酶联比色法来测定磷脂酶Da的活性。
[0005] 本发明一种磷脂酶Da活性的测定方法，其特征在于具有以下的过程和步骤:A， 制作用酶联比色法测得的红色产物的吸光度值与其相应的胆碱含量标准关系曲线；B，用酶 联比色法检测待测磷脂酶D a催化水解磷脂酰胆碱一系列反应后产生的红色物质的吸光 度值，根据上一步骤制作的胆碱含量与测得的相应的红色物质吸光度值之间的标准关系曲 线，确定生成胆碱的含量，以此推算出待测磷脂酶Da的活性。
[0006] 上述步骤A的具体步骤是；取50%磷脂酰胆碱水溶液按照梯度系列稀释成11组不 同浓度的胆碱水溶液，编号，分别加入显色液〇. 8mL(含45mmol/L的pH8. 0 Tris-HCL〈三 羟甲基氨基甲烷-盐酸混合溶液〉、〇. 8单位胆碱氧化酶、2. 4单位HRP〈辣根过氧化酶〉、 0· 24mg4_ATT〈4-氨基安替匹林〉和0· 16mg重蒸酚）；30°C反应90min，色泽稳定后加 lmL Tris-HCL (含2g/L Triton X-100〈聚乙二醇辛基苯基醚〉，ρΗ8· 0);用0· 22 μ m孔径滤膜 滤去蛋白质，测吸光度值；每个浓度做三个平行样；根据胆碱的含量与所测得的吸光度值 之间的关系绘制标准关系曲线； 上述步骤B的具体步骤是；取200 μ 1磷脂酶D a反应系（做三个平行样)，其中含终浓 度为 0· lmmol/LDMG (ρΗ6· 5)，10mmol/LMgCL2,10mmol/LCaCL2, 5mmol/L 亚油酸，10 μ gPLD 粗 酶液；最后加入12mmol/L憐脂醜胆喊；封口后30 C保温反应30min，沸水浴lOmin终止反 应；冷却后加入显色液〇. 8mL (含45mmol/L的pH8. 0 Tris-HCL、0. 8单位胆碱氧化酶、2. 4单 位 HRP、0. 24mg4-ATT 和 0· 16mg 重蒸酚），30°C反应 90min，色泽稳定后加 lmL Tris-HCL(含 2g/L Triton X-100, pH8. 0);用0. 22 μ m孔径滤膜滤去蛋白质，测吸光度值；根据A步骤制 作的胆碱含量与测得的相应的红色物质吸光度值之间的标准关系曲线，确定生成胆碱的含 量，以此推算出待测磷脂酶D α的活性。
[0007] 上述200 μ 1磷脂酶D α中Ca2+浓度为10mM。
[0008] 上述200 μ 1磷脂酶Da中蛋白质含量为1〇 μ g。
[0009] 本发明的优点是本发明用酶联比色法对磷脂酶Da水解磷脂酰胆碱后所产生的 胆碱的含量进行检测以此确定磷脂酶Da的活性，因此对胆碱含量检测的灵敏度直接决定 着对磷脂酶Da活性检测的灵敏度。该方法快速，易于操作，对实验设备要求低易普及，而 且灵敏度极高。
【专利附图】
【附图说明】 图1吸光度与胆碱的物质的量的关系； 图2蛋白含量对水蜜桃果实磷脂酶Da活性的影响； 图3不同Ca2+浓度对水蜜桃果实磷脂酶Da活性的影响。
【具体实施方式】
[0010] 标准工作曲线的绘制 主要仪器：756CRT紫外可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；磷脂酰胆碱 (PC)、二甲基戊二酸（DMG)、胆碱氧化酶、辣根过氧化酶（HRP)、亚油酸购自Sigma公司；50% 胆碱水溶液，安谱科学仪器有限公司的日本进口试剂；其他常规化学试剂均为国产分析纯。 [0011] 配制11组不同浓度的胆碱水溶液，编号，分别加入显色液〇. 8mL (含45mmol/L的 ρΗ8· 0 Tris-HCL、0. 8 单位胆碱氧化酶、2. 4 单位 HRP、0. 24mg4-ATT 和 0· 16mg 重蒸酚），30°C 反应 90min，色泽稳定后加 lmL Tris-HCL(含 2g/L Triton Χ-100，ρΗ8·0)，用 0.22 μ m 孔径 滤膜滤去蛋白质，测吸光度值；每个浓度做三个平行样；以胆碱的含量为横坐标，以500nm 的吸光度值为纵坐标作图1。
[0012] 从图1可见，测胆碱的灵敏度为1. 3365nmol，线性范围为1. 3365nmol?267. 3mmol， 胆碱含量与吸光度值之间具有很好的线性相关关系，直线回归方程y=〇. 0026X+0. 1005,相 关系数 R2=〇. 9998。
[0013] 有关附加实验例 附加实验例1蛋白含量测定 在4°C下，取水蜜桃果实7g用HEPES缓冲液（pH7. 0,含0. 32mol/L蔗糖，二硫代苏糖醇、 苯甲基磺酰氟、EGTA各lmmol/L)，制成20%匀浆，12000g离心45min，上清再以105000g离 心1小时，沉淀部分为细胞膜的膜性组分，溶于100mmol/LpH6. 5的DMG，得PLD α粗酶提取 液，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。以蛋白质含量为横坐标，磷脂酶Da的活性为横坐标作 图2。
[0014] 在图2中，BA表示用正丁醇浸泡处理，在4°C贮藏28天后的水蜜桃果实，CK表示 不作任何处理，在4°C贮藏28天后的水蜜桃果实。
[0015] 从图2可见，在200μ 1反应体系中，磷脂酶Da的活性随着蛋白质含量的增加而 迅速增长；当蛋白质含量达10 μ g时，不同处理的磷脂酶D a活性都表现出最大值，随后随 着蛋白质含量的增加而下降。在桃果实磷脂酶Da的活性测定反应系中以蛋白质含量在 10 μ g为宜。
[0016] 附加实验例2 Ca2+浓度的测定 在200μ 1反应体系中，分别加入的钙离子终浓度为0、0· 05mM、0. lmM、lmM、10mM、50mM， 以钙离子终浓度为横坐标，以磷脂酶D α的活性为纵坐标作图3。
[0017] 从图3可见，磷脂酶D α活性随着Ca2+浓度的增加呈现波动增长趋势，当Ca2+浓 度达到10mM时，磷脂酶Da表现出最大活性，见图3。桃果实磷脂酶Da活性测定反应系中 Ca2+浓度为10mM为宜。
【权利要求】
1. 一种检测磷脂酶Da活性的方法，其特征是；具有以下的过程和步骤： A. 制作用酶联比色法测得的红色产物的吸光度值与其相应的胆碱含量标准关系曲线； 具体步骤是；取50%磷脂酰胆碱水溶液按照梯度系列稀释成11组不同浓度的胆碱水溶液， 编号，分别加入显色液〇. 8mL(含45mmol/L的pH8. 0 Tris-HCL〈三羟甲基氨基甲烷-盐 酸混合溶液〉、〇. 8单位胆碱氧化酶、2. 4单位HRP〈辣根过氧化酶〉、0. 24mg 4-ATT〈4-氨 基安替匹林〉和〇· 16mg重蒸酚）；30°C反应90min，色泽稳定后加 lmL Tris-HCL (含2g/L Triton X-100〈聚乙二醇辛基苯基醚〉，pH8.0);用0.22 μ m孔径滤膜滤去蛋白质，测吸光 度值；每个浓度做三个平行样；根据胆碱的含量与所测得的吸光度值之间的关系绘制标准 关系曲线； B. 用酶联比色法检测待测磷脂酶D a催化水解磷脂酰胆碱一系列反应后产生的红 色物质的吸光度值，根据上一步骤制作的胆碱含量与测得的相应的红色物质吸光度值之间 的标准关系曲线，确定生成胆碱的含量，以此推算出待测磷脂酶Da的活性；具体步骤是： 取200μ1磷脂酶Da反应系(做三个平行样)，其中含终浓度为〇. lmmol/L DMG (二甲基戊 二酸，pH6. 5)，10mmol/L MgCL2,10mmol/L CaCL2, 5mmol/L 亚油酸，10 μ g PLD 粗酶液；最后 加入12mmol/L磷脂酰胆碱；封口后30°C保温反应30min，沸水浴10min终止反应；冷却后 加入显色液0. 8mL(含45mmol/L的pH8. 0 Tris-HCL、0. 8单位胆碱氧化酶、2. 4单位HRP、 0· 24mg4-ATT 和 0· 16mg 重蒸酚），30°C 反应 90min，色泽稳定后加 lmL Tris-HCL (含 2g/L Triton X-100, pH8. 0);用0. 22 μ m孔径滤膜滤去蛋白质，测吸光度值；根据A步骤制作的 胆碱含量与测得的相应的红色物质吸光度值之间的标准关系曲线，确定生成胆碱的含量， 以此推算出待测磷脂酶Da的活性。
2. 根据权利要求1所述的一种检测磷脂酶D a活性的方法，其特征是；在200 μ 1磷脂 酶Da的活性测定反应系中蛋白质含量为l〇yg。
3. 根据权利要求1所述的一种检测磷脂酶D a活性的方法，其特征是；在200 μ 1磷脂 酶Da的活性测定反应系中Ca2+浓度为10mM。
【文档编号】G01N21/78GK104155291SQ201410210646
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年5月19日 优先权日:2014年5月19日
【发明者】万嗣宝, 张宏宇, 李伟丽, 朱月莹 申请人:上海大学