一种具肿瘤靶向性的纳米复合物Apt-PAMAM/ERL/SUV及其制备和应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种具有肿瘤靶向的适配体修饰药物基因共输送纳米粒的制备方法及其在egfr突变型肺癌中的作用。

背景技术：

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。肺癌分为小细胞肺癌（sclc）和非小细胞肺癌（nsclc），其中nsclc约占所有肺癌的85%，且表皮生长因子受体（egfr）突变率高达40%（ettingerds,beplerg,buenor,changa,changjy,chirieaclr,etal.non-smallcelllungcancerclinicalpracticeguidelinesinoncology.journalofthenationalcomprehensivecancernetwork:jnccn.2006;4:548-82）。随着分子遗传学研究的不断进展，利用肿瘤细胞与正常细胞之间分子生物学上的差异，多种分子靶向药物被成功研发。egfr酪氨酸酶抑制剂（egfr-tki）使中晚期nsclc的治疗从标准含铂双药的化疗时代进入靶向治疗时代，以吉非替尼和erl为代表的第一代egfr-tki已成为egfr敏感突变阳性患者的一线首选治疗药物，然而遗憾的是所有接受tki治疗的患者最终会出现耐药（pic,zhangyc,xucr,zhouq.precisiontreatmentafterresistancetofirst-generationegfr-tkiinpatientswithnon-smallcelllungcancer.chinesejournalofoncology.2017;39:94-7）。

现有研究表明，凋亡基因的突变会衰减egfr-tki的作用。抑制原癌基因依赖性通路和其旁路，可以有效地改善egfr-tki的耐药性（santarpiam,giln,rosellr.strategiestoovercomeresistancetotyrosinekinaseinhibitorsinnon-small-celllungcancer.expertreviewofclinicalpharmacology.2015;8:461-77）。生存素（survivin）是凋亡抑制基因家族中分子量最小，抗凋亡作用最强的成员，在各种恶性肿瘤中高度表达。survivin在肿瘤组织中的特异性表达和功能，使其成为肿瘤研究的新靶点（okamotok,okamotoi,okamotow,tanakak,takezawak,kuwatak,etal.roleofsurvivininegfrinhibitor-inducedapoptosisinnon-smallcelllungcancerspositiveforegfrmutations.cancerresearch.2010;70:10402-10）。目前有很多改善egfr-tki获得性耐药的方法如紫杉醇联合参一胶囊与egfr-tkis（cn104306386a）、双胍类药物与egfr-tki的复合物（cn103316344a）等都被开发出来。但还没有通过联合egfr-tkis和抑制凋亡基因survivin的表达来逆转egfr-tki获得性耐药。

基因治疗技术是一种新的治疗手段，要求能在不同组织高效传递基因，并且不具有致病性，因此载体的安全性和有效性是治疗成功的关键。聚酰胺-胺型树枝状高分子（polyamidoamine，pamam）是作为一种新型聚合物，是目前研究最为广泛的非病毒类基因载体之一，因其表面富含丰富的氨基可与带负电的核酸结合，内部的空腔可以包载化疗药物，是一种较为理想的基因输送载体（esfandr,tomaliada.poly(amidoamine)(pamam)dendrimers:frombiomimicrytodrugdeliveryandbiomedicalapplications.drugdiscoverytoday.2001;6:427-36）。寡核苷酸适配体（aptamer）是一类具有特殊分子结构的rna适配体，可以与肿瘤细胞表面特异性抗原结合，实现将药物递送至肿瘤细胞的目的。现有研究表明，适配体（5’-cooh-tgaatgttgttttttctcttttctatagta-3’）可以靶向egfr过表达的细胞（tany,shiys,wuxd,lianghy,gaoyb,lisj,etal.dnaaptamersthattargethumanglioblastomamultiformecellsoverexpressingepidermalgrowthfactorreceptorvariantiiiinvitro.actapharmacologicasinica.2013;34:1491-8）。

为了克服现有技术的不足，本发明制备了具有肿瘤靶向的apt-pamam/erl/suv纳米复合物，既克服了erl水溶性差的缺陷，同时利用apt和erl双重靶向egfr突变肿瘤，主动靶向作用选择性地浓集于肿瘤细胞，从而有效地提高了药物的生物利用度。通过基因治疗和化疗联用逆转egfr-tki获得性耐药，提升其临床应用价值。检索国内外相关文献和专利结果表明：具有肿瘤靶向性的apt-pamam/erl/suv纳米复合物及其制备方法，尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种具有肿瘤靶向的适配体修饰载药纳米粒介导基因输送在egfr突变型肺癌中的作用及其制备方法，通过基因治疗和化疗联合有效地逆转了厄洛替尼的耐药性的问题，同时利用纳米载体表面的特异性适配体和erl双重靶向egfr突变肿瘤，选择性地浓集于肺癌细胞，从而有效地提高了药物的生物利用度，提升其临床应用价值。

为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案：

本发明提出的一种apt-pamam/erl/suv纳米复合物，它是erl、apt、pamam和suv反应得到的纳米药物，apt的接枝率为0.1%-0.5%，erl的包封率为10%-30%，纳米药物的n/p比为1∶1-15∶1。

一种制备如上所述的apt-pamam/erl/suv纳米复合物的方法为：先将含有氨基端的pamam与含有羧基端的apt反应，形成apt-pamam（ap）运载体，包载药物erl，形成ap/erl（ap/e），再与suv以一定的n/p比复合，形成ap/e/suv（ap/es）复合物。

所述的ap/es纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：

（1）将anti-egfr适配体（apt），n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）和1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）溶于水中，室温低速搅拌反应3小时，加入pamam的水溶液，室温低速搅拌过夜，装入透析袋中透析，冻干，得到ap聚合物；

（2）将ap聚合物和厄洛替尼erl溶于无水甲醇中，放入圆底烧瓶中，密封搅拌，旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到ap/e纳米药物。

（3）将ap/e纳米药物溶于水中，将suv水溶液高速涡旋，逐滴加入ap/e纳米药物，形成ap/es复合物。

步骤（1）中apt∶nhs∶edc的摩尔比为1∶50-100∶10-50。

步骤（1）中apt∶nhs∶edc的总浓度为1~20wt%。

步骤（1）中所采用的pamam的代数为4代，5代和6代中的一种。

步骤（2）中ap∶erl的反应时间为1~8h。

步骤（3）中ap/e和suv的反应时间为15~35min。

步骤（1）所述的透析袋截留分子量为1000~14000。

本发明的作用原理是：

第一，利用pamam在水溶液中很好的单分散性，通过包载难溶于水的erl，解决erl水溶性差的问题；

第二，由于pamam具有纳米级别的尺寸，可使纳米药物利用肿瘤组织的增强的渗透和滞留效应（epr）被动靶向到肿瘤组织中，提高erl对肿瘤组织的靶向性；

第三，利用纳米载体表面的特异性适配体和分子靶向药物erl主动靶向作用选择性地浓集于肿瘤细胞，有效地提高了药物的生物利用度；

第四，利用基因治疗沉默survivin基因的表达和化疗药物联合有效地逆转了厄洛替尼的耐药性的问题。

本发明的有益效果是：

第一，本发明选用pamam树状大分子作为药物载体，将它与能特异性识别过表达egfr的细胞的适配体共价偶联，形成ap运载体，共载药物erl和suv，形成apt-pamam/erl/suv纳米复合物。通过其表面所修饰的apt和erl双重靶向egfr突变肿瘤细胞，增加对肿瘤组织的靶向性，通过与suv复合，沉默抗凋亡基因的表达，逆转细胞对erl的耐药性；

第二，本发明的apt-pamam/erl/suv复合物的粒径小于400nm，不会形成给药栓塞，可用于患者的静脉给药或者腹腔给药，能够在肿瘤部位浓集，特异性识别并抑制肿瘤细胞，增强抗肿瘤效果。

附图说明

图1中的a图为实施例3制备的apt-g6的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，其中m为核酸电泳标记物；a为游离的适配体；b为活化的适配体；c为apt-g6聚合物；图1中的b图为实施例3中制备的apt-g6、apt-g6/erl、apt-g6/es的荧光强度检测图；

图2为实施例3中制备的apt-g6/es纳米药物的体外释放曲线；

图3为实施例5制备的n/p比分别为5∶1和10∶1的g6/g对pc9和h1975细胞的体外转染实验；

图4为实施例4中得到的g6/es，apt-g6/suv，apt-g6/erl和apt-g6/es对pc9和h1975细胞的体外毒性实验。

具体实施方式

下面，将通过实施例，对本发明进行进一步说明，但发明并不局限于这些实施例，在本发明权利要求所阐明的范围内，可进行各种改变或等同替换。

实施例1

称取50μlanti-egfr适配体（10μm）的水溶液，加入10μgn-羟基琥珀酰亚胺（nhs）和2μg1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）的水溶液，室温低速搅拌3h。加入6mg第四代pamam（10mg/ml）的水溶液，室温低速搅拌过夜，装入透析袋中透析2天，冻干，得到apt-pamam聚合物（apt-g4）。称取100mgapt-g4、20mg厄洛替尼溶于40ml无水甲醇中，装入圆底烧瓶中，密封搅拌反应4h。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到apt-g4/erl纳米药物。称取100μlapt-g4/erl纳米药物（350μg/ml）逐滴加入到高速涡旋的100μlsurvivinshrna（400μg/ml）水溶液中，室温孵育25min。得到apt-g4/erl/survivinshrna（apt-g4/es）纳米复合物。

实施例2

称取50μlanti-egfr适配体（10μm）的水溶液，加入10μgn-羟基琥珀酰亚胺（nhs）和2μg1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）的水溶液，室温低速搅拌3h。加入6mg第五代pamam（10mg/ml）的水溶液，室温低速搅拌过夜，装入透析袋中透析2天，冻干，得到apt-pamam聚合物（apt-g5）。称取100mgapt-g5、20mg厄洛替尼溶于40ml无水甲醇中，装入圆底烧瓶中，密封搅拌反应6h。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到apt-g5/erl纳米药物。称取100μlapt-g5/erl纳米药物（350μg/ml）逐滴加入到高速涡旋的100μlsurvivinshrna（400μg/ml）水溶液中，室温孵育25min。得到apt-g5/erl/survivinshrna（apt-g5/es）纳米复合物。通过紫外谱图分析，在一定范围内，增加厄洛替尼包合步骤的反应时间，可提高厄洛替尼在apt-pamam中的包封率。

实施例3

称取100μlanti-egfr适配体（10μm）的水溶液，加入10μgn-羟基琥珀酰亚胺（nhs）和2μg1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）的水溶液，室温低速搅拌3h。加入6mg第六代pamam（10mg/ml）的水溶液，室温低速搅拌过夜，装入透析袋中透析2天，冻干，得到apt-pamam聚合物（apt-g6）。称取100mgapt-g6、20mg厄洛替尼溶于40ml无水甲醇中，装入圆底烧瓶中，密封搅拌反应6h。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到apt-g6/erl纳米药物。称取100μlapt-g6/erl纳米药物（350μg/ml）逐滴加入到高速涡旋的100μlsurvivinshrna（400μg/ml）水溶液中，室温孵育25min。得到apt-g6/erl/survivinshrna（apt-g6/es）纳米复合物。如图1所示，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳实验发现当活化后的适配体与pamam反应后，条带消失，说明适配体成功地偶联到pamam上。通过将偶联有荧光分子的适配体投料反应后，发现apt-g6也可以检测到荧光信号，再次证明适配体成功地偶联到pamam上。且通过荧光值强弱分析，在一定的比例内，增加适配体的投料比，可提高适配体在pamam表面的接枝率。

将上述apt-g6/es纳米药物在分散在ph7.4或ph5.4的含甲醇的pbs溶液中透析，实验温度37℃，水解释放的厄洛替尼采用高效液相色谱法（hplc）分析，温度为室温。色谱条件：色谱柱为thermoscientificsyncronisc18色谱柱（250×4.6mm，5μm）；检测器为waters2487uv检测器；流动相：乙腈-水（55∶45）；流速：1.0ml/min检测波长：246nm；柱温：35℃；进样量：20μl。

纳米药物的体外释放实验结果如图2所示，实验发现在ph5.4时，厄洛替尼可以顺利地从载体中释放出来，而在ph7.4时，只能检测到微量的厄洛替尼的释放。这说明由于在ph较高的环境中，pamam内部叔胺基团去质子化，树枝装聚合物加剧压缩能力，称为“背部折叠”。然而，在弱酸性ph下，pamam内部叔胺基质子化，导致电荷排斥。电荷排斥可引起树枝状大分子的溶胀以产生延伸的构象，导致被截留的药物持续和缓慢的释放。

实施例4

称取100μlanti-egfr适配体（10μm）的水溶液，加入10μgn-羟基琥珀酰亚胺（nhs）和2μg1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）的水溶液，室温低速搅拌3h。加入6mg第六代pamam（10mg/ml）的水溶液，室温低速搅拌过夜，装入透析袋中透析2天，冻干，得到apt-pamam聚合物（apt-g6）。称取100mgapt-g6、20mg厄洛替尼溶于40ml无水甲醇中，装入圆底烧瓶中，密封搅拌反应6h。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到apt-g6/erl纳米药物。称取100μlapt-g6/erl纳米药物（700μg/ml）逐滴加入到高速涡旋的100μlsurvivinshrna（400μg/ml）水溶液中，室温孵育25min。得到apt-g6/erl/survivinshrna（apt-g6/es）纳米复合物。

称取100μlapt-g6纳米药物（700μg/ml）逐滴加入到高速涡旋的100μlsurvivinshrna（400μg/ml）水溶液中，室温孵育25min。得到apt-g6/survivinshrna（apt-g6/suv）纳米复合物。

称取100mgg6、20mg厄洛替尼溶于40ml无水甲醇中，装入圆底烧瓶中，密封搅拌反应6h。旋蒸除甲醇，粘稠物用纯水溶解，离心除去沉淀物，将上清液冻干，得到g6/erl纳米药物。称取100μlg6/erl纳米药物（700μg/ml）逐滴加入到高速涡旋的100μlsurvivinshrna（400μg/ml）水溶液中，室温孵育25min。得到g6/erl/survivinshrna（g6/es）纳米复合物。

实施例5

称取100μl第六代pamam纳米药物（700μg/ml）和第六代pamam纳米药物（350μg/ml）分别逐滴加入到高速涡旋的100μlgfpshrna（400μg/ml）水溶液中，室温孵育25min。得到g6/gfpshrna（g6/g）纳米复合物，n/p比分别为为5∶1和10∶1。此处使用gfpshrna可以用于后续的细胞转染实验，便于观察基因转染效率。

实施例6

以人非小细胞肺癌细胞系pc9细胞（egfr过表达细胞，厄洛替尼敏感细胞）和人非小细胞肺癌细胞系h1975细胞（egfr过表达细胞，厄洛替尼耐药细胞）为测试细胞系（细胞购自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心）。

细胞培养方法：取出液氮中冻存的pc9细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入1.5ml离心管中，置于离心机中，1500rpm离心5min，弃去上清液，加入1mlrpmi1640完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加3mlrpmi1640完全培养液，将培养皿置于5%co2、37℃培养箱中培养。取出液氮中冻存的h1975细胞，在37℃的温水中解冻，将细胞悬液移入1.5ml离心管中，置于离心机中，1500rpm离心5min，弃去上清液，加入1mldmem完全培养液，轻轻吹打均匀，将细胞悬液加入培养皿中，补加3mldmem完全培养液，将培养皿置于5%co2、37℃培养箱中培养。

细胞转染实验：将pc9或h1975细胞以4×10⁴个细胞/孔的密度接种到24孔培养板中，培养24h后，用脂质体2000转染能表达荧光蛋白gfp的质粒进入细胞，24h后，更换培养液为不含血清的培养基，加入50μg/ml实施例5中得到的g6/g（n/p比分别为5∶1和10∶1）转染1h后，吸弃上清，加入正常完全培养基，培养24h后，通过荧光显微镜观察转染效率，如图3所示，n/p比为10∶1时转染效率显著大于n/p比为5∶1时。

细胞毒性实验：将pc9或h1975细胞以8×10³个细胞/孔的密度接种到96孔培养板中，培养24h后，更换培养液为新鲜血清培养液，加入25μg/ml实施例4中得到的g6/es，apt-g6/suv，apt-g6/erl和apt-g6/es，不加纳米药物的孔设为空白对照，孵育1h后，吸弃孔中溶液，加入正常完全培养基，继续培养48h后，吸弃孔中溶液加入新鲜培养液90μl，同时每孔加入10μlmtt溶液（5mg/ml），继续在37℃、5%co2（相对湿度90%）培养箱中培养4h后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入150μldmso，避光振荡10min使结晶物充分溶解。以酶标仪检测570nm处的吸收度（a），按照以下公式计算：细胞存活率%=（试验组平均a值/空白对照组平均a值）×100%。

纳米药物的细胞毒性结果如图4所示。从图4中可以看出，apt-g6/es对细胞的毒性显著高于g6/es，表明适配体的修饰可增加纳米药物对egfr过表达肿瘤细胞的毒性。apt-g6/es对细胞的毒性作用显著高于apt-g6/erl和apt-g6/suv，说明厄洛替尼和survivinshrna可以起到协同作用，逆转厄洛替尼的耐药性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。