一种雷公藤甲素‑叶酸靶向纳米药物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，是一种雷公藤甲素-叶酸靶向纳米药物及其制备方法和应用。

背景技术：

中药雷公藤是卫矛科植物雷公藤tripterygiumwilfordiihook.f.的根或根的木质部。具有祛风除湿，活血通络，消肿止痛，杀虫解毒的功效。现代药理学研究显示其具有明显的抗炎，免疫抑制，抗肿瘤及抗雄性生育等生物活性药理作用，在临床多用于治疗湿疹，痒疹，类风湿性关节炎等疾病。然而，临床常用的雷公藤及其口服制剂，具有诸多不良反应，如消化不良、肝肾毒性，抑制血液系统以及皮肤粘膜损害等，特别是其生殖毒性，严重影响了在育龄期患者中的使用，极大的限制了其在临床的广泛运用。

叶酸是一种小分子维生素，它可与叶酸受体发生特异性结合，叶酸分子中的α羧基通过共价键与多种外源分子偶联，并且在叶酸偶联复合物中，叶酸分子保留了与叶酸受体之间高亲和力结合的性质。有研究显示，银屑病等高度增殖性疾病皮损处表现出叶酸受体高的特点，而正常皮肤不表达(或者低表达)，基于叶酸受体表达差异可实现叶酸-偶联物的主动靶向输送。与单克隆抗体靶向系统相比，叶酸小分子穿透力强，到达靶点时间短、稳定、价格低，可携带靶向药物通过细胞受体介导的内吞作用进入细胞内部，具有靶向性且应用范围广的优点。雷公藤甲素是雷公藤提取物中的主要活性成分之一，也是雷公藤多苷片的重要成份，但雷公藤甲素具有一定的毒性导致其无法直接使用，因此如何将雷公藤甲素制备成靶向纳米材料，使雷公藤甲素直接发挥药理作用的同时，降低其对正常细胞的毒副作用是其中难点。中国专利2014100393814公开了一种叶酸-纳米tio2复合光催化剂及制备方法和应用，它是表面修饰叶酸的tio2/sio2纳米粒子，其结构式是fa-conh-tio2/sio2，将纳米tio2/sio2复合材料与叶酸通过氨基化偶联增加复合物的稳定性，同时增强其靶向性，在纳米tio2表面包覆sio2提高纳米光催化效率及热稳定性，杀伤效率高且靶向性强。然而现有技术中，关于本发明雷公藤甲素-叶酸靶向药物，目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种雷公藤甲素-叶酸靶向纳米药物制备方法。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供由如上所述方法制备得到的雷公藤甲素-叶酸靶向纳米药物。

本发明的第三个目的是针对现有技术中的不足，提供如上所述雷公藤甲素-叶酸靶向纳米药物的用途。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种雷公藤甲素-叶酸靶向纳米药物制备方法，所述雷公藤甲素-叶酸靶向纳米药物制备方法如下：

(1)mal-peg-plga溶解在溶剂中，配置a液；

(2)巯基叶酸溶解在溶剂中，配置b液；

(3)将上述a液和b液混合，反应后除去多余的巯基叶酸，得fa-peg-plga；

(4)将fa-peg-plga溶解在溶剂中，配置c液；

(5)雷公藤甲素溶解在溶剂中，配置d液；

(6)将c液和d液混合作为有机相，以去离子水作为水相，将有机相和水相置于微流控中进行反应，收集反应液，透析，既得。

作为本发明的一个优选实施方案，所述mal-peg-plga中peg的分子量为5000-20000da，所述mal-peg-plga中plga的分子量为5000-20000da。

作为本发明的一个优选实施方案，所述mal-peg-plga中peg的分子量为5000da，所述mal-peg-plga中plga的分子量为20000da。

作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤3中巯基叶酸与mal-peg-plga质量比为2：1。

作为本发明的一个优选实施方案，所述fa-peg-plga与雷公藤甲素质量比为8-30：3。

作为本发明的一个优选实施方案，所述fa-peg-plga与雷公藤甲素质量比为20：3。

作为本发明的一个优选实施方案，所述步骤1和步骤4的溶剂为乙腈，所述步骤2的溶剂为乙腈水溶液，所述步骤5的溶剂为甲醇。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

如上任一所述制备方法制备获得的雷公藤甲素-叶酸靶向纳米药物。

作为本发明的一个优选实施方案，所述药物还包括药学上允许的辅料，所述药学上允许的辅料包括但不限于：甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素c、edta二钠、edta钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、红糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：

如上所述雷公藤甲素-叶酸靶向纳米药物在制备治疗银屑病的药物中的应用。

本发明优点在于：

1、本发明将雷公藤甲素制备成靶向纳米材料，通过叶酸-叶酸受体系统将雷公藤甲素介导进入银屑病特殊皮损部位，发挥其药理作用的同时降低雷公藤的毒副作用，可直接外用治疗银屑病皮损。

2、本发明通过实验筛选对制备方法进行优化，所制备的雷公藤甲素-叶酸靶向纳米药物对正常的人源化hacat细胞毒性显著降低，而对叶酸受体高表达的hacat细胞杀伤率显著增强。

附图说明

附图1为本发明靶向纳米颗粒紫外吸收谱图。

附图2为非靶向纳米颗粒透射电镜图片。

附图3为靶向纳米颗粒透射电镜图片。

附图4为雷公藤纳米靶向作用原理示意图。

附图5为银屑病皮损与皮损旁组织处叶酸受体的免疫荧光与mrna分析。

附图6为咪喹莫特诱导的小鼠银屑病动物模型表皮叶酸受体表达增强。

附图7为银屑病模型小鼠用药前后的皮肤组织化学分析。

附图8为质粒转染过表达叶酸受体，显示细胞分泌叶酸受体蛋白增高(nc：正常；oe：过表达)。

附图9为雷公藤纳米靶向干预体外细胞情况。

附图10为不同hacat细胞模型对波长450nm的光吸收率随时间变化曲线。以od450反映具有活力的细胞的数量。其中oe是叶酸受体过表达，sgrna是叶酸受体敲出。实验结果表明，oe叶酸受体过表达hacat细胞的生长与正常hacat细胞相比增殖更旺盛。

附图11为fa-peg-plga的靶向性验证实验。以ce6为疏水模型药物，结果显示：在与细胞孵育24h后，靶向组细胞的平均荧光强度是非靶向组与靶向抑制组的2.5倍，是分子药物组(ce6)的7倍。在12h时，靶向组是非靶向组的1.5-2倍。上述结果表明经过叶酸孵育后，在加入靶向性雷公藤甲素，其效能下降，也说明依赖叶酸受体的靶向性的正确性。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1雷公藤甲素-叶酸靶向药物的制备(一)

一、原料及设备

1.1原料

mal-peg-plga：(分子量：peg：plga＝5000:20000)(sigma，aldrich-900339,100mg)纯度：99％。

peg-plga：(分子量：peg：plga＝5000:20000)(sigma)纯度：99％。

巯基叶酸：委托上海吉尔生化合成。

雷公藤甲素：上海同田生物技术股份有限公司。

乙腈：分析纯，购自sigma。

甲醇：分析纯，购自sigma。

1.2设备

microfluidics、紫外/可见分光光度计(cry50，varian)，激光粒度仪-zeta电位计(nano-zs90，malvern)，高效液相色谱hplc(lc-2030)，透析袋(基星生物)，透射电镜(hitachih7100)

二、纳米药物的合成

2.1非靶向纳米药物的合成

1)称量20mgpeg-plga，溶解在2ml乙腈中，配置成10mg/ml溶液；

2)称量3mg雷公藤甲素，溶解在1ml甲醇中，配置成3mg/ml溶液；

3)将以上两种溶液均匀混合于25ml玻璃瓶中，作为有机相；另取一25ml玻璃瓶，倒入20ml去离子水，作为水相。

4)将有机相和水相分别置于微流控的两个气泵中，调节气泵压力，使有机相与水相流速比为40:320(单位：μl/min)

5)反应完成后，收集反应溶液液，粒径仪检测粒径大小、表面电位

6)用8000-14000分子量透析袋透析48h，冻干。

7)称量一定质量冻干品，溶解在乙腈中，hplc检测其载药率。

2.2靶向纳米药物的合成

1)称量20mgmal-peg-plga，溶解在2ml乙腈中，配置成10mg/ml，记为溶液a；

2)称量3.52mg巯基叶酸，溶解在1ml乙腈/水(v％:v％＝1:1)混合液里，配置成3.52mg/ml，记为溶液b。

3)取2)配置好的溶液b200μl，滴加到a中(反应比例mfa:mpeg-plga＝2：1)，室温反应12h，用3000分子量透析袋透析48h以除去未反应的巯基叶酸，用紫外分光光度计定性叶酸是否与mal基团连接，定量计算叶酸浓度。

4)称量20mgfa-peg-plga，溶解在2ml乙腈中，配置成10mg/ml溶液；

5)称量3mg雷公藤甲素，溶解在1ml甲醇中，配置成3mg/ml溶液；

6)将步骤4、5制备的溶液均匀混合于25ml玻璃瓶中，作为有机相；另取一25ml玻璃瓶，倒入20ml去离子水，作为水相；

7)将有机相和水相分别置于微流控的两个气泵中，调节气泵压力，使有机相与水相流速比为40:320(单位：μl/min)；

8)反应完成后，收集反应溶液，粒径仪检测粒径大小、表面电位；

9)用8000-14000分子量透析袋透析48h，冻干。

10)称量一定质量冻干品，溶解在乙腈中，hplc检测其载药率。

2.3透射电镜观察纳米药物宏观形貌

将以上两种合成好的纳米药物稀释至1mg/ml。镊子夹取铜网，向通往上面滴加20-30μl材料液，铜网吸附120s后，用滤纸吸取铜网上废液，再向铜网上滴加4％醋酸铀15-20μl染色，30-60s后，滤纸吸弃多余的醋酸铀溶液。

三、实验结果

3.1非靶向纳米药物：peg-plga(负载雷公藤甲素)

表1非靶向纳米药物粒径、电位及载药率

3.2靶向纳米药物：fa-peg-plga(负载雷公藤甲素)：

表2靶向纳米药物粒径、电位及载药率

3.3fa紫外定性

如图1所示，fa-peg-plga中出现叶酸特征吸收峰(280nm)证实叶酸成功链接：

3.4纳米颗粒透射电镜照片

非靶向纳米颗粒透射电镜图片如图2所示，靶向纳米颗粒透射电镜图片如图3所示。电镜下纳米颗粒尺寸小于水合粒径，是因为纳米颗粒在干燥过程中发生了收缩所致。

图4为本发明雷公藤纳米靶向作用原理图。

实施例2组织学实验方法证明银屑病皮损中叶酸受体的高表达

1.实验对象:临床银屑病患者的活检组织；

2.试剂:folicacidreceptor(santacruzbiotechnology,sc-16387)；

3.实验方法：免疫组化，realtimepcr法；

4.实验结果：如图5-6所示，叶酸受体在咪喹莫特所诱导的银屑病动物模型小鼠皮损中亦高表达。

实施例3动物实验

1.用药前后银屑病模型小鼠与对照小鼠表型的分析

1)咪喹莫特造模：

咪喹莫特诱导银屑病样皮损小鼠模型：雌性balb/c小鼠(8-11周龄)，将背部毛发完全剔除后，涂抹5％咪喹莫特乳膏(aldara，3m公司产品)，每日剂量为3.125mg。对照组采用同等剂量的凡士林。连续7天造模。造模成功后予以糖皮质激素治疗，预防组在造模前提前3天予以三草软膏。记录用药前后皮损红斑、鳞屑、厚薄等(0-4级)，进行pasi评分记录。在第14天处死小鼠，背部皮肤取材，分别放置于福尔马林液和液氮中保存。实验过程中观察一般情况和局部皮肤炎症情况并记录。

2)评价方法：pasi评分，皮肤病理。

2.1皮损严重程度pasi评分

小鼠背部皮肤炎症严重程度评分釆用国内公认的银屑病皮损面积与严重程度指数(pasi)评分：红斑、鳞屑和皮损厚度分别单独评分，分值0-4分(0，无；1，轻度；2，中度；3，明显；4，非常明显)。累积的分数(红斑、鳞屑和皮损厚度评分相加)作为炎症严重程度的最终评分(0-12分)。

2.2皮肤病理分析

小鼠背部取材，固定于4％福尔马林溶液中。组织切片进行he染色，然后进行组织学baker评分。baker法评分：角质层中发现munro小脓肿计2.0分；过度角化计0.5分；角化不全计1.0分。表皮层中发现颗粒层变薄或消失1.0分；棘层肥厚1.0分；皮突延长、起伏，根据轻、中、重程度分别计0.5、1.0、1.5分。真皮层单一核及多形核细胞浸润，根据轻、中、重程度分别计0.5、1.0、2.0分；乳突上顶0.5分；毛细血管扩张0.5分。

3)实验结果及分析：结果如图7-8所示，雷公藤治疗组小鼠红斑，鳞屑均较模型对照组有所下降，程度减轻，提示雷公藤制剂通过抗炎减轻局部红斑水肿。病理结果显示，模型组表皮增厚，真皮层炎症细胞增多。而治疗组表皮增生减少，真皮炎症细胞减少。

实施例4细胞实验

1细胞来源：人源化hacat细胞(来源于theamericantypeculturecollection，简称atcc)，培养于新鲜改良rpmi-1640完全培养基(mem商品化基本培养液445ml，胎牛血清50ml和双抗5l混匀)，传代生长良好后用于后续实验。

2细胞构建及鉴定：分离银屑病皮损处角质形成细胞(按照实验室成熟方法),以外科美容手术的健康患者角质形成细胞为对照。术前常规75％酒精消毒，手术刀取皮损组织0.5x0.5cm大小，1×pbs反复清洗血迹，浸泡在0.25％胰蛋白酶(roche)溶液中。次日分离表真皮，弃真皮，将表皮其剪成5mm×5mm大小碎片，加入2ml0.35％胶原酶，37℃振荡消化45min，加入12.5μldnase继续振荡消化15min。尼龙网过滤细胞，高钙emem定容至10ml。800rpm，4℃离心5min，弃上清液，35ml高钙emem溶液轻轻吹打重悬细胞。300rpm，5min，4℃离心沉淀细胞。重悬细胞于2ml含有9％ficoll的高钙emem溶液中。准备15ml干净tube(含2.5ml新鲜的9％ficoll溶液)，将细胞悬液轻轻的加入，4℃，400rpm，离心5min，吸出ficoll上清液，35ml高钙emem重悬细胞，4℃，500rpm，离心5min，清洗细胞。加入cnt-07培养液(cellntec公司产品)，放置于37℃，5％co2培养箱中培养。次日更换新鲜培养液。

4.3结论：如图9a所示，雷公藤甲素及纳米雷公藤甲素分别干预正常的hacat细胞，结果显示在0.003μm浓度下，雷公藤甲素对hacat细胞没有明显毒性，细胞生长未有显著影响，但在0.01μm浓度下细胞生存率降低为40％，显示出雷公藤甲素的细胞毒性。但经纳米材料包裹的雷公藤甲素对细胞的毒性显著降低，在0.3μm浓度下正常hacat细胞存活率仍高达90％。

我们将雷公藤甲素及雷公藤甲素纳米药物分别干预正常hacat细胞(nc)及叶酸受体高表达(oe)细胞，干预时间为3h，然后再行ckk8检测细胞存活情况，结果如图9b所示：1为正常hacat细胞采用dmso溶媒干预，作为阴性对照，发现细胞生长良好；2为正常hacat细胞采用雷公藤甲素处理，细胞存活率约为65％；3为正常hacat细胞采用空白纳米载体处理，发现细胞生长不受影响，与dmso干预无显著差异。4为正常hacat细胞采用纳米靶向雷公藤制剂处理，发现细胞存活率约80％，细胞受到一定程度抑制。5为过表达叶酸受体的hacat细胞，采用纳米靶向雷公藤制剂处理，结果显示在这种细胞中，其存活率显著降低，约为50％。

附图10为不同hacat细胞模型对波长450nm的光吸收率随时间变化曲线。以od450反映具有活力的细胞的数量。其中oe是叶酸受体过表达，sgrna是叶酸受体敲出。实验结果表明，oe叶酸受体过表达hacat细胞的生长与正常hacat细胞相比增殖更旺盛。

附图11为fa-peg-plga的靶向性验证实验。以ce6为疏水模型药物，结果显示：在与细胞孵育24h后，靶向组细胞的平均荧光强度是非靶向组与靶向抑制组的2.5倍，是分子药物组(ce6)的7倍。在12h时，靶向组是非靶向组的1.5-2倍。上述结果表明经过叶酸孵育后，在加入靶向性雷公藤甲素，其效能下降，也说明依赖叶酸受体的靶向性的正确性。

实施例5雷公藤甲素-叶酸靶向药物的制备(二)

1)取mal-peg-plga(分子量：peg：plga＝20000:20000)，溶解在乙腈中，配置成10mg/ml，记为溶液a；

2)取巯基叶酸，溶解在乙腈/水(v％:v％＝1:1)混合液里，配置成3.52mg/ml，记为溶液b；

3)取2)配置好的溶液b200μl，滴加到a中(反应比例mfa:mpeg-plga＝3：1)，室温反应12h，用3000分子量透析袋透析48h以除去未反应的巯基叶酸；

4)称量10mgfa-peg-plga，溶解在2ml乙腈中，配置成5mg/ml溶液；

5)称量3mg雷公藤甲素，溶解在1ml甲醇中，配置成3mg/ml溶液；

6)将步骤4、5制备的溶液均匀混合于25ml玻璃瓶中，作为有机相；另取一25ml玻璃瓶，倒入20ml去离子水，作为水相；

7)将有机相和水相分别置于微流控的两个气泵中，调节气泵压力，使有机相与水相流速比为40:320(单位：μl/min)；

8)反应完成后，收集反应溶液。

实施例6雷公藤甲素-叶酸靶向药物的制备(三)

1)取mal-peg-plga(分子量：peg：plga＝20000:5000)，溶解在乙腈中，配置成10mg/ml，记为溶液a；

2)取巯基叶酸，溶解在乙腈/水(v％:v％＝1:1)混合液里，配置成3.52mg/ml，记为溶液b；

3)取2)配置好的溶液b200μl，滴加到a中(反应比例mfa:mpeg-plga＝1：1)，室温反应12h，用3000分子量透析袋透析48h以除去未反应的巯基叶酸；

4)称量30mgfa-peg-plga，溶解在2ml乙腈中，配置成15mg/ml溶液；

5)称量3mg雷公藤甲素，溶解在1ml甲醇中，配置成3mg/ml溶液；

6)将步骤4、5制备的溶液均匀混合于25ml玻璃瓶中，作为有机相；另取一25ml玻璃瓶，倒入20ml去离子水，作为水相；

7)将有机相和水相分别置于微流控的两个气泵中，调节气泵压力，使有机相与水相流速比为40:320(单位：μl/min)；

8)反应完成后，收集反应溶液。

实施例7雷公藤甲素-叶酸靶向药物的制备(四)

1)取mal-peg-plga(分子量：peg：plga＝10000:5000)，溶解在乙腈中，配置成10mg/ml，记为溶液a；

2)取巯基叶酸，溶解在乙腈/水(v％:v％＝1:1)混合液里，配置成3.52mg/ml，记为溶液b；

3)取2)配置好的溶液b200μl，滴加到a中(反应比例mfa:mpeg-plga＝1：2)，室温反应12h，用3000分子量透析袋透析48h以除去未反应的巯基叶酸；

4)称量8mgfa-peg-plga，溶解在2ml乙腈中，配置成4mg/ml溶液；

5)称量3mg雷公藤甲素，溶解在1ml甲醇中，配置成3mg/ml溶液；

6)将步骤4、5制备的溶液均匀混合于25ml玻璃瓶中，作为有机相；另取一25ml玻璃瓶，倒入20ml去离子水，作为水相；

7)将有机相和水相分别置于微流控的两个气泵中，调节气泵压力，使有机相与水相流速比为40:320(单位：μl/min)；

8)反应完成后，收集反应溶液。

实施例8雷公藤甲素-叶酸靶向药物对hacat细胞的体外细胞毒性

细胞来源：人源化hacat细胞(来源于theamericantypeculturecollection，简称atcc)，培养于新鲜改良rpmi-1640完全培养基(mem商品化基本培养液445ml，胎牛血清50ml和双抗5l混匀)，传代生长良好后用于后续实验。

分别采用不同实施例制备的纳米雷公藤甲素干预正常的hacat细胞，结果如下表所示：

表3雷公藤甲素-叶酸靶向药物对正常hacat细胞的体外细胞毒性

分别采用不同实施例制备的纳米雷公藤甲素分别干预叶酸受体高表达(oe)细胞，干预时间为3h，然后再行ckk8检测细胞存活情况，利用公式计算药物对细胞的增殖抑制率，计算公式如下：细胞增殖抑制率＝1-a给药/a对照，其中对照组采用rpmi-1640完全培养基处理。根据细胞增殖抑制率计算细胞的半数抑制浓度(ic50)。结果显示各给药组对酸受体过表达hacat细胞毒性呈浓度依赖性，且随着纳米雷公藤甲素的浓度提高，各给药组细胞增殖抑制率提高。实施例1、实施例5、实施例6、实施例7的纳米雷公藤甲素对过表达hacat细胞ic50分别为0.47μmol/l、1.28μmol/l、1.46μmol/l、1.17μmol/l，

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。