本发明涉及中药领域，尤其涉及一种野木瓜注射液的制备方法及其检测方法。
背景技术：
：野木瓜注射液收载于卫生部药品标准中药成方制剂第二十册，它是由野木瓜经提取制成的灭菌水溶液，具有祛风止痛、舒筋活络的功效，用于风邪阻络型三叉神经痛、坐骨神经痛。野木瓜注射液标准(WS3-B-4003-98)中收载的制法为：取野木瓜2500g，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500nl；用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，冷藏，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.0～7.5，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g，搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得。野木瓜富含三萜皂苷、多糖、黄酮、SOD等活性物质，梁桂娟等采用分光光度法，以齐墩果酸为标准品，测得每克干木瓜粉中的总皂苷含量为0.01765克，而皂苷的水溶液大多能破坏红细胞，产生溶血现象。野木瓜注射液标准中检查项下溶血试验规定观察半小时不得有溶血现象，但《中国药典》2015年版一部附录XⅢH溶血与凝聚检查法中已经要求观察3小时，申请人在对野木瓜注射液进行溶血试验时发现，3小时后有溶血发生，因此有必要对野木瓜注射液的制备方法进行改进，以提高其安全性。由于野木瓜注射液溶血作用主要是由皂苷引起的，因此建立野木瓜注射液中总皂苷的含量测定方法，对控制其安全性具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种野木瓜注射液的制备方法，采用该方法制备得到的野木瓜注射液总黄酮含量变化小，但总皂苷含量明显下降，提高了产品的安全性。本发明的目的还在于提供一种野木瓜注射液中总皂苷的含量测定方法，有利于对野木瓜注射液安全性的控制。本发明中所述的野木瓜注射液是由野木瓜经提取制成的灭菌水溶液。本发明提供的野木瓜注射液的制备方法，包括第一次醇沉浓缩液调酸后，先经过60℃～100℃加热再冷藏的步骤。本发明提供的野木瓜注射液的制备方法优选如下：取野木瓜药材，加水提取，合并提取液，滤过，滤液浓缩，醇沉，冷藏，滤过，滤液浓缩至每毫升溶液相当于含生药材不少于5.0g，加水至每毫升溶液相当于含生药材不少于5.0g，调pH值至1-3，60℃～100℃条件下加热，冷藏，滤过，滤液调pH值至中性，浓缩，醇沉，冷藏，滤过，滤液浓缩回收乙醇，加水，调pH值至6.5-8.0，加吐温80和苯甲醇，加水至每毫升溶液相当于含生药材2.5g，加活性炭，搅拌、滤过、灌封，灭菌，即得。本发明提供的野木瓜注射液的制备方法更优选如下：取野木瓜药材，加水提取2～3次，合并提取液，滤过，滤液浓缩每毫升溶液相当于含生药材2.0～3.0g，加乙醇至含醇量达75％～85％，冷藏12～48小时，滤过，滤液浓缩至每毫升溶液相当于含生药材不少于10.0g，加水至每毫升溶液相当于含生药材不少于5.0g，调pH值至1-3，60℃～100℃条件下加热，冷藏12～72小时，滤过，滤液调pH值至中性，浓缩成稠膏状，加乙醇至含醇量达85％～95％，冷藏12～48小时，滤过，滤液浓缩回收乙醇，加水至每毫升溶液相当于含生药材2.6～3.5g，调pH值至6.5-8.0，加2～10g吐温80和2～10ml苯甲醇，加水至每毫升溶液相当于含生药材2.5g，加活性炭，搅拌、滤过、灌封，灭菌，即得。本发明提供的野木瓜注射液总皂苷的含量测定方法如下：采用分光光度法，以5％香草醛一冰乙酸溶液和高氯酸为显色剂，在545nm处测定吸光度，计算野木瓜注射液中总皂苷的含量。野木瓜中的皂苷类成分主要是以齐墩果酸、熊果酸、桦木酸为皂苷元的三萜皂苷，因此本发明提供的总皂苷含量测定方法，可以选用上述皂苷元作为对照品，优选齐墩果酸作为对照品，对照品用甲醇或无水乙醇溶解并定容至规定浓度，即得对照品溶液。供试品溶液制备方法如下：取野木瓜注射液，加正丁醇萃取，合并正丁醇萃取液，浓缩至干，残渣用0～30％乙醇溶液溶解，再经已经预处理好的大孔吸附树脂吸附，然后依次用纯水、50％～100％乙醇溶液洗脱，收集醇洗脱液，浓缩至干，残渣用甲醇或无水乙醇溶解并定容至规定体积，即得。上述供试品溶液制备方法中，野木瓜注射液经大孔吸附树脂吸附后，除可先用纯水洗脱去除杂质外，也可用0～30％乙醇溶液洗脱去除杂质，再用50％～100％乙醇溶液洗脱。比色测定方法优选：取对照品溶液或供试品溶液置具塞试管中，挥干溶剂，加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，再加入0.8ml高氯酸溶液，置70℃水浴中加热15分钟，取出，立即用冷水或冰水冷却，再加入5ml冰醋酸，混匀，在545nm下测定吸光度。上述比色测定方法中，显色剂的用量、水浴加热的温度、以及冰醋酸的用量可以根据测定的需要进行适当的调整。比如水浴加热的温度可以根据测定的需要调整为60℃。本发明的创新之处在于：在不影响野木瓜注射液中总黄酮含量的前提下，有效的降低了总皂苷含量，提高了产品的安全性；本发明提供的总皂苷含量测定方法，样品溶液与标准品溶液显色后的最大吸收波长一致，检测方法更加专属、灵敏。下面将通过实验例对本发明作进一步说明。实验例1野木瓜总皂苷含量测定方法研究分光光度法简便灵敏，适用范围广泛，是目前测定总皂苷含量的常用方法，分光光度法是利用皂苷元的母核与显色剂反应能产生颜色变化，在最大吸收波长处测定其吸光度，从而计算出总皂苷含量.梁桂娟等人(参见《食品工业科技》2006年第27卷第11期)采用分光光度法测定野木瓜总皂苷的含量，测得每克干木瓜粉中总皂苷的含量为0.01765g，方法稳定性及重现性良好.梁桂娟等人采用的测定方法中，样品溶液与标准品溶液显色后最大吸收波长不一致，本发明对样品的处理方法进行改进.方法1：取野木瓜注射液(中间体)，加入正丁醇进行萃取，合并正丁醇萃取液，减压浓缩至干，用无水乙醇溶解，即得.方法2：取野木瓜注射液(中间体)，加入正丁醇进行萃取，合并正丁醇萃取液，减压浓缩至干，加水溶解，用已经预处理好的D101大孔吸附树脂吸附，再依次用纯水、10％、30％、50％、70％、95％乙醇溶液洗脱，分别收集洗脱液，减压浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解，即得.精密吸取上述样品溶液及齐墩果酸对照溶液0.2ml，分别置具塞比色管中，水浴挥干溶剂后，各精密加入0.4ml5％香草醛-冰醋酸溶液和0.6ml高氯酸，置60℃水浴加热15分钟，然后迅速放至冰水浴中冷却2分钟，再各精密加入5ml冰醋酸，混匀，使用紫外-可见光分光光度计在400-800nm波长范围进行扫描，结果齐墩果酸对照溶液和方法2中30％、50％、70％乙醇溶液洗脱夜制得的样品溶液在545nm处有最大吸收，方法1制得的样品溶液在533nm处有最大吸收，方法2中10％、30％、50％、70％、95％乙醇溶液洗脱夜制得的样品溶液在545nm处测得的吸光度值分别为0.08、0.11、1.36、0.09、0.09。实验例2野木瓜注射液制备方法研究野木瓜富含皂苷类成分，皂苷的水溶液大多能破坏红细胞，产生溶血现象。野木瓜注射液现行标准中溶血试验的观察时间为30分钟，如果依《中国药典》2015年版一部附录XⅢH法检查，有溶血发生，因此为了进一步提高野木瓜注射液的安全性，有必要适当降低野木瓜注射液中总皂苷的浓度.样品1：取野木瓜2500g，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml，用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，冷藏，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.3，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.测定结果：总黄酮含量为1.79mg/ml；总皂苷含量为1.69mg/ml.样品2：取野木瓜2500g，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml，用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，反复冷藏过滤至底部不再析出沉淀，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.3，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.测定结果：总黄酮含量为0.93mg/ml；总皂苷含量为0.91mg/ml.样品3～11：取野木瓜2500g，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml，用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，分别按表1条件进行加热处理，冷藏，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.3，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得。总黄酮和总皂苷含量测定结果见表1.表1不同加热条件制得的样品中总黄酮和总皂苷含量情况由表1可知，与实验例1样品1相比，样品3-11中总黄酮含量相当，总皂苷含量下降较多。实验例3溶血试验实验例2中样品1和样品3，分别按《中国药典》2015年版一部附录XⅢH溶血与凝聚检查法操作，并于0.5h、1.0h、2.0h、3.0h后观察是否有溶血现象，检查结果见表2.表2溶血试验结果样品名称观察0.5h观察1.0h观察2.0h观察3.0h样品1没有溶血没有溶血有溶血有溶血样品3没有溶血没有溶血没有溶血有溶血由表2可知，样品3发生溶血时间延后,安全性相对较高。具体实施方式下述实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1、野木瓜注射液取野木瓜2500g，加水煎煮三次。每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml；用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，置80℃水浴中加热4小时，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.【含量测定】总黄酮对照品溶液的制备精密称取在120减压干燥至恒重的芦丁对照品100mg，至100ml量瓶中，加60％乙醇70ml，置水浴上微热使溶解，防冷，用60％乙醇稀释至刻度，摇匀，精密量取10ml，置50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得.标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0与6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，照分光光度法(附录VB)，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线.测定法精密量取本品5ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“各加水至6ml”起，依法测定吸光度，以本品5ml加水至25ml作空白，依法测定吸光度，从标准曲线上读出本品中芦丁的含量，计算，即得.【含量测定】总皂苷对照品溶液的制备取齐墩果酸对照品适量，加无水乙醇制成每1ml含300ug的溶液，即得.标准曲线的制备精密吸取对照品溶液0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml，分别置具塞比色管中，挥干溶剂，先加入5％香草醛-冰醋酸溶液0.2ml，再加入0.8ml高氯酸溶液，置60℃水浴加热15分钟，然后迅速放至冰水浴中冷却2分钟，再加入5ml冰醋酸，混匀，在545nm处测定吸光度值，以吸光度值A为纵坐标，浓度C为横坐标，绘制标准曲线.测定法精密吸取本品5ml，加入正丁醇进行萃取，反复萃取至正丁醇无色，合并正丁醇层，真空浓缩至干，残渣用10ml水溶解，经已经预处理好的D101大孔吸附树脂吸附，先用纯水洗脱，弃去水洗液，再用75％乙醇溶液洗脱，收集醇洗液，减压浓缩至干，残渣用无水乙醇溶解定容至25ml，精密吸取0.2ml置具塞比色管中，照标准曲线制备项下的方法，自“挥干溶剂”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出齐墩果酸的含量，计算，即得.测定结果：总黄酮含量为1.78mg/ml；总皂苷含量为1.30mg/ml。实施例2、野木瓜注射液取野木瓜2500g，加水煎煮三次。每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml；用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，置60℃水浴中加热4小时，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.测定结果：测定方法同实施例1，总黄酮含量为1.79mg/ml；总皂苷含量为1.52mg/ml。实施例3、野木瓜注射液取野木瓜2500g，加水煎煮三次。每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml；用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，置70℃水浴中加热4小时，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.测定结果：测定方法同实施例1，总黄酮含量为1.79mg/ml；总皂苷含量为1.27mg/ml。实施例4、野木瓜注射液取野木瓜2500g，加水煎煮三次。每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml；用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，置90℃水浴中加热4小时，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.测定结果：测定方法同实施例1，总黄酮含量为1.78mg/ml；总皂苷含量为1.28mg/ml。实施例5、野木瓜注射液取野木瓜2500g，加水煎煮三次。每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml；用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，置100℃水浴中加热4小时，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.测定结果：测定方法同实施例1，总黄酮含量为1.76mg/ml；总皂苷含量为1.17mg/ml。实施例6、野木瓜注射液取野木瓜2500g，加水煎煮三次。每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml；用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，置100℃水浴中加热4小时，冷藏72小时，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.测定结果：测定方法同实施例1，总黄酮含量为1.48mg/ml；总皂苷含量为1.04mg/ml。实施例7、野木瓜注射液取野木瓜2500g，加水煎煮三次。每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml；用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，置100℃水浴中加热4小时，冷藏72小时，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，加8g聚山梨酯80和苯甲醇4ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.测定结果：测定方法同实施例1，总黄酮含量为1.48mg/ml；总皂苷含量为1.04mg/ml。实施例8、野木瓜注射液取野木瓜2500g，加水煎煮三次。每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml；用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，置100℃水浴中加热4小时，冷藏72小时，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，加4g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.测定结果：测定方法同实施例1，总黄酮含量为1.48mg/ml；总皂苷含量为1.04mg/ml。实施例9、野木瓜注射液取野木瓜2500g，加水煎煮三次。每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至400ml；用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，置80℃水浴中加热4小时，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，加10g聚山梨酯80和苯甲醇10ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.测定结果：总黄酮含量为1.43mg/ml；总皂苷含量为1.01mg/ml。实施例10、野木瓜注射液取野木瓜2500g，加水煎煮三次。每次2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至1000ml，加乙醇5000ml，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇，加水至500ml；用6mol/L盐酸溶液调节PH值至2.0，置70℃水浴中加热4小时，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液用20％氢氧化钠调节PH值至中性，减压浓缩成稠膏状，加8倍量的乙醇，搅匀，冷藏24小时，放置使沉淀，滤过，滤液减压回收乙醇；加注射液用水500ml，用8％氢氧化钠溶液调节PH值至7.5，加8g聚山梨酯80和苯甲醇8ml，加注射用水至1000ml，加活性炭2g,搅拌，滤过，灌封，灭菌，即得.测定结果：测定方法同实施例1，总黄酮含量为1.79mg/ml；总皂苷含量为1.27mg/ml。当前第1页1 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