离体BITE激活的T细胞的制作方法

过继细胞疗法(act)是涉及从患者收集免疫细胞，扩增细胞以及将细胞重新引入同一患者或不同患者的过程。例如，供体来源的离体扩增的人细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的act已经成为治疗癌症的有希望的方法。act的实例包括培养的肿瘤浸润淋巴细胞(til)，分离和扩增的t细胞克隆，以及表达常规t细胞受体或嵌合抗原受体的基因工程化淋巴细胞(例如t细胞)。基因工程化淋巴细胞被设计用于消除表达特定抗原的癌细胞并扩增并递送给患者。act的另一个例子是在施用癌症疫苗后从患者的血液中分离和使用t细胞。act可以提供肿瘤特异性淋巴细胞(例如，t细胞)，其导致患者中肿瘤细胞的减少。

然而，act的限制可包括例如t细胞的脱靶激活和/或关于选择最不可能靶向非癌组织的抗原的担心。仍然需要一种选择适当的t细胞亚群(例如，ctl)以提供有效治疗同时使不良副作用最小化的方法。

发明概述

本公开至少部分地特征在于产生激活的免疫效应细胞(例如，激活的t细胞)的优化方法，所述免疫效应细胞选择性地和有效地靶向患病组织(例如，癌症)。

在一个实施方案中，激活的免疫细胞(例如，激活的t细胞)诱导靶细胞(例如癌细胞)的杀伤。激活的t细胞在本文中通常称为“癌症杀伤t细胞”，该术语包括激活的肿瘤抗原特异性t细胞，包括但不限于效应记忆t细胞，细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，辅助t细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(til)和胞啃t细胞(trogocytotictcell)。本公开至少部分地基于以下出人意料的发现：通过例如优化靶标(例如，癌症)细胞和免疫效应细胞之间的接近度(proximity)，可以增强在靶细胞杀伤活性方面高度有效的免疫效应细胞(例如，t细胞)的产生和鉴定。

本文所述的癌症杀伤t细胞可以为多种癌症类型(例如实体癌症，血液癌症及其转移形式)提供高效治疗。使用本文公开的癌症杀伤t细胞的疗法也适用于治疗通常不在受试者中引起强烈免疫应答的癌症，例如除黑素瘤之外的癌症。在实施方案中，本文公开的癌症疗法可以例如通过产生选择性且有效地靶向受试者癌症的癌症杀伤t细胞(例如，自体癌症杀伤t细胞)针对给定受试者定制或个性化。

因此，本文提供了产生具有增强的靶细胞杀伤活性的免疫效应细胞(例如，癌症杀伤t细胞)的方法；包含此类免疫细胞的组合物；使用所述细胞的方法(例如，治疗方法)；选择用于增强靶细胞杀伤活性(例如，通过增强靶细胞和免疫细胞(例如t细胞)之间的接近度，例如空间接近度)的最佳试剂的方法；选择优化的(例如，最高活性级分/克隆)免疫细胞例如t细胞的方法；以及使用该方法评估患者对其他癌症治疗的应答性的方法。

产生癌症杀伤t细胞的方法

在一个方面，本文提供了产生(例如，制备/提供)癌症杀伤t细胞的方法。所述方法包括：

(a)提供来自患有癌症(例如，血液癌症，实体癌症，转移性癌症或其组合)的受试者的t细胞；

(b)提供例如来自所述受试者的癌细胞；

(c)例如在足以激活t细胞(例如，通过使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物)的条件下(例如持续一段时间)，形成离体反应混合物，所述离体反应混合物包含t细胞，癌细胞和邻近免疫辅导因子(proximityimmuno-coachingfactor，picf)。在一些实施方案中，激活的t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物，例如，变成胞啃t细胞。

在一些实施方案中，癌细胞和t细胞存在于样品中，例如来自患有癌症的受试者的样品。在一个实施方案中，癌细胞和t细胞存在于相同的样品中，例如单个样品(例如，如本文所述的样品)。在其他实施方案中，癌细胞和t细胞存在于不同的样品中，例如，来自例如患有癌症的受试者的一个或多个样品(例如，如本文所述的一个或多个样品)。

在实施方案中，该方法(例如，产生方法)的步骤(a)和步骤(b)包括提供包含癌细胞和t细胞两者的一个样品。

在实施方案中，该方法(例如，产生方法)的步骤(a)和步骤(b)包括提供两个样品，其中所述两个样品中的一个包含癌细胞，并且另一个样品包含t细胞。

在实施例中，该方法还包括以下之一，两个，三个或全部：

i)扩增来自(c)的癌症杀伤t细胞；

ii)选择来自(c)的癌症杀伤t细胞；

iii)富集来自(c)的癌症杀伤t细胞；或

iv)纯化来自(c)的癌症杀伤t细胞。

另一方面，本文还提供了产生(例如，制备/提供)癌症杀伤t细胞的方法。所述方法包括：

(a)提供包含癌细胞和t细胞(例如来自患有癌症(例如，血液癌症，实体癌症，转移性癌症或其组合)的受试者)的样品(“癌细胞和t细胞样品”)；

(b)例如在足以激活t细胞(例如，通过使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物)的条件下(例如持续一段时间)，使所述样品与邻近免疫辅导因子(picf)接触(在实施方案中，形成产生癌症杀伤t细胞的离体反应混合物)；

(c)富集所述癌症杀伤t细胞，例如激活的t细胞(例如，已经从癌细胞获得细胞表面标志物的t细胞)。

在另一方面，本文的特征在于产生(例如，制备/提供)癌症杀伤t细胞的方法。所述方法包括：

(a)提供癌症样品，例如包含癌细胞(例如来自血液癌症，实体癌症，转移性癌症的癌细胞(例如，循环肿瘤细胞(ctc)或其组合)的样品，所述样品例如来自患有癌症的受试者；

(b)提供t细胞样品，例如包含t细胞的样品(例如，血液样品(例如，外周血样品)，骨髓样品，淋巴结样品，脾样品，包含细胞毒性t淋巴细胞(ctl)和/或肿瘤浸润淋巴细胞(til)的肿瘤样品或其组合)，所述样品例如来自患有癌症的受试者；

(c)例如在足以激活t细胞(例如，使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物)的条件下(例如持续一段时间)，使来自步骤(a)的样品与来自步骤(b)的样品和邻近免疫辅导因子(picf)接触(在实施方案中，形成产生癌症杀伤t细胞的离体反应混合物)；和

(d)富集所述癌症杀伤t细胞，例如激活的t细胞(例如，已经从癌细胞获得细胞表面标志物的t细胞)。

在本文公开的任何方法和组合物的一些实施方案中，样品是选自血液癌症，实体癌症，转移性癌症(例如，ctc，原发性，继发性或其他转移性癌症)或其组合的癌症样品。

在本文公开的任何方法和组合物的另一个实施方案中，样品是选自血液样品(例如外周血样品)，骨髓样品，淋巴结样品，脾样品，包含ctl，til的肿瘤样品或其组合的t细胞样品。

在本文公开的任何方法和组合物的实施方案中，基本上没有组分(例如细胞)从样品中除去或分离。

在本文公开的任何方法和组合物的实施方案中，样品基本上保持来自原始组织的微环境，例如，基本上维持肿瘤或免疫微环境的结构。

在本文公开的任何方法和组合物的实施方案中，样品包含肿瘤抗原特异性t细胞(例如，ctl或til)。不受理论束缚，肿瘤抗原特异性t细胞可以是免疫抑制的，例如，当存在于肿瘤微环境中时是免疫抑制的。在一个实施方案中，免疫抑制的肿瘤抗原特异性t细胞在本文所述的条件下激活，例如在与癌细胞和picf接触后激活。

在本文公开的任何方法和组合物的一些实施方案中，样品包含癌细胞和t细胞。例如，样品可以来自包括t细胞(例如，肿瘤抗原特异性ctl)的血液癌症(例如，骨髓，淋巴结源性癌症)。血液样品也可包含癌细胞，例如白血病或淋巴瘤母细胞(例如，表达一种或多种选自cd19，cd123，cd20或其他标志物的母细胞)。在实施方案中，向样品中添加picf促进t细胞和激活t细胞(例如，激活肿瘤抗原特异性ctl)的癌细胞之间的相互作用。在一些实施方案中，激活的t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物，例如，变成胞啃t细胞。

在本文公开的任何方法和组合物的其他实施方案中，癌症是实体瘤。样品可包含如本文所述的肿瘤抗原特异性t细胞(例如，ctl或til)和癌细胞。在实施方案中，向样品中添加picf促进t细胞和激活t细胞(例如，激活肿瘤抗原特异性ctl或til)的癌细胞之间的相互作用。在一些实施方案中，激活的t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物，例如，变成胞啃t细胞。

在本文公开的任何方法和组合物的其他实施方案中，样品包含转移性样品，例如来源于患有转移性癌症的受试者的样品。在一个实施方案中，转移性样品包含ctc。在实施方案中，ctc是在患有癌症(例如实体瘤)的受试者的外周血中发现的肿瘤细胞。可以形成包含转移性癌症细胞和t细胞的离体反应混合物。在实施方案中，t细胞可以从转移性癌症样品(例如，原发肿瘤样品或继发性肿瘤样品，或其组合)获得。在一些实施方案中，离体反应混合物包含靶向转移性样品(例如，靶向ctc，原发性肿瘤样品或继发性肿瘤样品或其组合)的肿瘤抗原特异性t细胞(例如，ctl或til)。在实施方案中，肿瘤抗原特异性t细胞在picf和转移性样品(例如，ctc，原发肿瘤样品或继发性肿瘤样品或其组合)的存在下被激活。例如，在转移性癌症中，肿瘤生长可以发生在不同于原发肿瘤部位的组织中，例如，在本文中称为继发性肿瘤。来自原发肿瘤的癌细胞可以与继发性或其他转移部位不同。例如，骨髓肿瘤浸润可发生在实体瘤中。作为另一个例子，在骨髓中生长的来自实体癌症(例如胰腺或乳腺癌)的转移性肿瘤细胞可以在生物学上与原发肿瘤中的肿瘤细胞不同。在这样的实施方案中，在picf存在下t细胞的激活可以在受试者中受肿瘤细胞影响的每个组织中重复。在此类实施方案中，激活的t细胞(例如，激活的肿瘤抗原特异性t细胞)能够对受试者中存在的原发性和继发性肿瘤具有选择性。

在一个实施方案中，样品包含ctc。可以利用含有ctc的样品与来自受试者中存在的原发性和继发性肿瘤的样品形成离体反应混合物，从而产生对所述受试者的ctc，原发性和继发性肿瘤具有选择性的激活的t细胞(例如，激活的肿瘤抗原特异性t细胞)。

组合物和反应混合物

为了本说明书的目的，术语“组合物”包括癌症杀伤t细胞，该术语包括激活的肿瘤抗原特异性t细胞，包括但不限于效应记忆t细胞，细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，辅助t细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(til)和胞啃t细胞，及其药物组合物。

在一个方面，本文特征还在于包含t细胞，癌细胞和邻近免疫辅导因子(picf)的离体反应混合物，其中t细胞和癌细胞处于样品中，例如，血液样品(例如全血，外周血)；来自血液癌症的样品；来自骨髓的样品，来自淋巴结的样品；或来自脾的样品，来自实体瘤的样品；来自转移性癌症的样品(例如ctc)；其中基本上没有组分(例如细胞)从样品中除去或分离。

在实施方案中，样品来自患有癌症(例如血液癌症，实体癌症或转移性癌症)的受试者。

在实施方案中，样品基本上保持微环境，例如，基本上保持肿瘤微环境的结构。

在实施方案中，样品包含肿瘤抗原特异性t细胞(例如，ctl或til)。不受理论束缚，肿瘤抗原特异性t细胞可以是免疫抑制的，例如，当存在于肿瘤微环境中时。在一个实施方案中，免疫抑制的肿瘤抗原特异性t细胞可以在本文所述的条件下激活，例如在与癌细胞和picf接触后。

另一方面，本文提供组合物，例如药物组合物，其包含通过本文所述方法产生的癌症杀伤细胞和药学上可接受的载体，例如gmp可接受的载体。

在另一方面，本发明的特征在于组合物(例如，纯化的制剂)。所述组合物包含：

(1)癌症杀伤细胞，其：(i)对癌细胞具有细胞毒性活性，并且(ii)包含来自癌细胞的细胞表面标志物，数量为例如一种或多种癌细胞表面标志物中的细胞表面标志物的90-500个拷贝(例如，至少90，100，200，300，400或500个拷贝)；和

(任选地)(2)邻近免疫辅导因子(picf)，例如可检测(例如，痕量)量的picf。

在实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体，例如gmp可接受的载体。

在一个实施方案中，反应混合物中总t细胞的约2％至75％(例如，约2％至70％，2％至60％，2％至50％，或2％至40％)表达一种或多种癌细胞表面标记物(例如，一种或多种白血病细胞癌)。

在实施方案中，富集或纯化癌症杀伤细胞。在一些实施方案中，富集的或纯化的癌症杀伤细胞群包含至少80％，90％，95％，99％或100％的癌症杀伤细胞，其中癌症杀伤细胞包含一种或多种癌细胞表面标志物。

治疗方法

在另一个方面，本公开的特征在于治疗患有癌症(例如，如本文所述的血液癌症，实体癌症或转移性癌症)的受试者的方法。该方法包括提供包含通过本文所述的方法制备的癌症杀伤t细胞的制剂；并将制剂施用给受试者。

在另一方面，本公开提供了治疗患有癌症的受试者(例如，如本文所述的血液癌症，实体癌症或转移性癌症)的方法。所述方法包括：

(a)提供来自受试者的样品，其中所述样品包含t细胞和癌细胞(例如，如本文所述的样品)；

(b)在产生癌症杀伤t细胞的条件(例如，持续一段时间)下，使所述样品与邻近免疫辅导因子(picf)接触；

(c)(任选地)富集或扩增已从癌细胞获得细胞表面标志物的癌症杀伤t细胞；

(d)将癌症杀伤t细胞施用给受试者，从而治疗受试者。

在另一方面，本文提供了治疗患有癌症(例如，血液癌症或实体癌症或转移性癌症)的受试者的方法，其包括：

(a)提供如本文所述的例如来自受试者的癌症样品；

(b)提供如本文所述的例如来自受试者的t细胞样品；

(c)在产生癌症杀伤t细胞的条件(例如，持续一段时间)下，使癌症样品与t细胞样品和邻近免疫辅导因子(picf)接触；

(d)(任选地)富集或扩增已从癌细胞获得细胞表面标志物的癌症杀伤t细胞；

(e)将癌症杀伤t细胞施用给受试者，从而治疗受试者。

在一些实施方案中，在不显著扩增的情况下施用癌症杀伤t细胞。在其他实施方案中，癌症杀伤t细胞在细胞扩增后施用，例如在个体细胞扩增后施用。

在任何上述方法的一些实施方案中，例如在施用于受试者的样品中的激活的(例如，癌症杀伤)t细胞的数量为至少5-10,000(例如，5，10，100，1000，10,000或更多)。

评估受试者的测定和方法

另一方面，本文提供了评估受试者产生癌症杀伤t细胞(例如，激活的t细胞，包括胞啃t细胞)的能力的方法或测定。所述方法或测定包括：

(a)提供来自患有癌症的受试者的t细胞(例如，如本文所述的t细胞)；

(b)提供来自受试者的癌细胞(例如，如本文所述的癌细胞)；

(c)形成包含t细胞，癌细胞和picf的离体反应混合物，例如在足以激活t细胞(例如，使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物)的条件下(例如持续一段时间)形成离体反应混合物，从而形成癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)；

(d)任选地，鉴定离体反应混合物中的癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)；和

(e)确定，例如，量化离体反应混合物中癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)的水平或活性。

另一方面，本发明的特征在于评估受试者的方法，例如，鉴定或选择对治疗(例如免疫调节剂和/或癌症疗法)有应答的受试者，所述方法包括：

(a)提供来自患有癌症的受试者的t细胞(例如，如本文所述的t细胞或t细胞样品)；

(b)提供例如来自受试者的癌细胞(例如，如本文所述的癌细胞或癌细胞样品)；

(c)形成离体反应混合物，其包含t细胞，癌细胞和免疫调节剂和/或癌症治疗剂(therapy)；

(d)确定步骤(c)的反应混合物的细胞杀伤活性，

其中，相对于参考值(例如，不存在治疗剂)，在治疗基存在下反应混合物的细胞杀伤活性的增加表明对治疗剂的更高应答性。

在实施方案中，步骤(c)包括形成癌症杀伤t细胞或其制剂与靶细胞(例如癌细胞)的离体混合物。在实施方案中，癌细胞是选自血液癌症，实体癌症，转移性癌症，ctc或其组合的细胞。在实施方案中，癌细胞是白血病或淋巴瘤母细胞(例如，表达一种或多种选自cd19，cd123，cd20或其他标志物的母细胞)。在实施方案中，t细胞是选自血液样品(例如外周血样品)，骨髓样品，淋巴结样品，包含ctl和/或til的肿瘤样品或其组合的细胞。在实施方案中，t细胞表达cd8和/或cd25(例如，它是cd8+cd25+t细胞)。在实施方案中，t细胞表达cd4和/或cd25(例如，它是cd4+cd25+t细胞)。

在实施方案中，步骤(e)使用自动化平台进行，例如基于荧光的自动流式细胞平台，例如本文所述的exvitech平台。在此类实施方案中，评估经可检测(荧光)标记的癌症杀伤t细胞的水平。

在一个实施方案中，检测癌症杀伤t细胞上肿瘤抗原的水平和/或存在(例如，检测胞啃t细胞的数量或活性)。

在实施方案中，通过检测ctl或til的数量或活性来确定癌症杀伤t细胞的水平。在其他实施方案中，检测表达cd8和/或cd25(例如，cd8+cd25+t细胞)的t细胞的数量或活性。在其他实施方案中，检测表达cd4和/或cd25(例如，cd4+cd25+t细胞)的t细胞的数量或活性。

在实施方案中，离体反应混合物中升高水平的癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)(例如，与参考水平相比)表明受试者能够产生癌症杀伤t细胞(例如，是高生产者)。在实施方案中，所述受试者被鉴定为可能应答本文公开的方法和组合物。

在其他实施方案中，离体反应混合物中低水平的癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)(例如，与取决于每个样品中的特定效应物与靶标比率的参考水平相比)表明受试者不太能够产生癌症杀伤t细胞。在实施方案中，所述受试者被鉴定为不太可能应答本文公开的方法和组合物。

在实施方案中，所述方法或测定还包括基于产生癌症杀伤t细胞的能力鉴定或选择受试者，例如，鉴定受试者是癌症杀伤t细胞的高或低生产者。

在实施方案中，参考水平包括在t细胞，癌细胞或picf和/或免疫调节剂中一种或多种不存在的情况下在类似的离体反应混合物中产生的激活的t细胞(例如，癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞))的数量或活性。在一个实施方案中，通过检测癌症杀伤t细胞上肿瘤抗原的水平和/或存在来确定参考水平。在其他实施方案中，通过检测ctl或til的数量或活性来确定参考水平。在一个实施方案中，参考水平包括表达cd8和/或cd25的t细胞(例如，cd8+cd25+t细胞)的数量或活性。在一个实施方案中，参考水平包括表达cd4和/或cd25的t细胞(例如，cd4+cd25+t细胞)的数量或活性。

在其他实施方案中，评估在离体反应混合物中产生的癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)的活性。在一些实施方案中，在发生癌症杀伤细胞的条件下在存在癌细胞(例如，表达一种或多种选自cd19，cd123，cd20或其他标志物的母细胞)的情况下孵育来自步骤(c)的离体反应混合物。在离体反应混合物存在下检测癌细胞杀伤的水平或量表明反应混合物中癌症杀伤t细胞的活性。在实施方案中，癌细胞的水平或量例如相对于参考水平的降低表明癌细胞杀伤增加。在其他实施方案中，癌细胞的水平或量例如相对于参考水平的小变化或基本上没有变化表明癌细胞杀伤减少。

在实施方案中，所述方法还包括将癌症杀伤t细胞施用给受试者，例如如本文所述的患有癌症的受试者。在实施方案中，受试者被鉴定为可能对本文公开的方法和组合物有应答，例如，在反应混合物中显示更多数量(例如，与参考水平相比)的癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)。

评估e∶t比率的测定和方法

另一方面，本文提供了评估癌症杀伤t细胞或其制剂的效力的方法或测定。所述方法或测定包括：

(a)提供例如根据本文所述的方法例如从受试者(例如，如本文所述的患有癌症的受试者)产生的癌症杀伤t细胞或其制剂；

(b)提供靶细胞(例如癌细胞)，例如，其中癌细胞来自受试者；

(c)在足以使癌症杀伤t细胞杀伤癌细胞的条件(例如，持续一段时间)下使癌症杀伤t细胞或其制剂与靶细胞(例如，癌细胞)接触(在实施方案中，接触步骤还包括添加例如不同剂量(例如，增加剂量)的如本文所述的picf和/或免疫调节剂；

(d)确定步骤(c)后已经消除的靶细胞的水平例如数量(例如，相对于不添加picf或免疫调节剂的样品，例如来自相同受试者而不添加picf的样品)，和(任选地)确定步骤(c)后产生的癌症杀伤t细胞(例如，新产生的细胞)的水平例如数量(例如，相对于不添加picf的样品，例如来自相同受试者而不添加picf或免疫调节剂的样品)(在实施方案中，在步骤(c)后以一个或多个时间间隔确定靶细胞和/或癌症杀伤细胞的水平例如数量)；和

(任选地)(e)确定步骤(d)的靶细胞与癌症杀伤t细胞或癌症杀伤t细胞与靶细胞的比率。

在另一个方面，本文提供了评估候选picf和/或免疫调节剂的方法或测定。所述方法包括：

(a)提供例如根据本文所述的方法例如从受试者(例如，如本文所述的患有癌症的受试者)产生的癌症杀伤t细胞或其制剂；

(b)提供靶细胞(例如癌细胞)，例如，其中癌细胞来自受试者；

(c)在足以使癌症杀伤t细胞杀伤癌细胞的条件(例如，持续一段时间和/或存在预定浓度的候选picf和/或免疫调节剂)下，使候选picf和/或免疫调节剂(例如，一种或多种候选picf和/或免疫调节剂)与癌症杀伤t细胞或其制剂和靶细胞(例如癌细胞)接触；

(d)确定步骤(c)后已经消除的靶细胞的水平例如数量(例如，相对于不添加picf和/或免疫调节剂的另一个样品)，和任选地确定步骤(c)后新产生的癌症杀伤t细胞的水平例如数量(例如，相对于不添加picf和/或免疫调节剂的另一个样品)(在实施方案中，在步骤(c)后以一个或多个时间间隔并且在候选picf和/或免疫调节剂的一个或多个浓度确定靶细胞和/或癌症杀伤细胞的数量)；和

(任选地)(e)确定步骤(d)的靶细胞与癌症杀伤t细胞或癌症杀伤t细胞与靶细胞的比率。

在任何上述方法或测定的一些实施方案中，获得基础e∶t比率。在一个实施方案中，基础e∶t是在picf和/或免疫调节剂暴露之前细胞毒性t细胞和癌细胞之间的比率。

在任何上述方法或测定的一些实施方案中，获得有效e∶t比率。在一个实施方案中，有效e∶t比率是在picf和/或免疫调节剂暴露后所产生的癌症杀伤t细胞与杀伤的癌细胞之间的比率。

在任何上述方法或测定的一些实施方案中，可以在一种或多种预定浓度的picf下计算有效e∶t比率。在一个实施方案中，优化picf的预定浓度以计算有效e∶t比率。在一个实施方案中，当暴露于最大浓度的picf时，使用肿瘤和激活的t细胞的数量计算e∶t比率。在另一个实施方案中，当暴露于产生最大峰值的激活的t细胞数量的picf浓度时，使用肿瘤和激活的t细胞的数量计算e∶t比率。在另一个实施方案中，使用对应于相应剂量反应曲线的ec50浓度的肿瘤和激活的t细胞的数量计算e∶t比率。

在任何上述方法或测定的一些实施方案中，有效e∶t比率也可以表示为有效t∶e比率(例如，癌细胞与癌症杀伤t细胞之间的比率)。

在一些实施方案中，提供了通过本文描述的方法产生的癌症杀伤t细胞。在一些实施方案中，癌症杀伤t细胞是胞啃t细胞。在其他实施方案中，癌症杀伤t细胞是cd8+cd25+t细胞。在其他实施方案中，癌症杀伤t细胞是cd4+cd25+t细胞。尽管细胞毒性t细胞，例如cd8+t细胞和激活的cd4+t细胞也具有癌细胞杀伤活性，但认为胞啃t细胞是更有效的癌细胞杀伤剂。因此，所有激活的t细胞类型可以包括在有效e∶t比率中。

在一些实施方案中，所述方法或测定包括检测(例如计数)新产生的癌症杀伤毒性t细胞的数量，以及在相同条件下(例如在同一孔中)已杀伤的靶细胞数。这些值的比率是有效e∶t比率。

在一些实施方案中，该比率是两个减法(subtraction)之间的比率，一个减法是孵育后相对于孵育之前的靶标数量(即，测量在这种条件下杀伤的靶细胞的数量)，另一个减法是孵育后相对于孵育之前癌症杀伤t细胞的数量(即，测量在这种条件下杀伤靶细胞的细胞毒性t细胞的数量)。在一些实施方案中，在没有picf的情况下癌症杀伤t细胞是零(或不可检测)，因此减法等于癌症杀伤t细胞的总数(例如，cd8+cd25+t细胞的总数或cd4+cd25+t细胞的总数)。

在任何上述方法或测定的实施方案中，癌细胞例如相对于不添加picf和/或免疫调节剂的参考水平的水平或量的降低表明癌细胞杀伤增加。在其他实施方案中，癌细胞的水平或量例如相对于参考水平的变化减小或基本上没有变化表明癌细胞杀伤减少。

在任何上述方法或测定的实施方案中，相对于由picf和/或免疫调节剂诱导的新产生的靶标杀伤t细胞的高水平靶细胞杀伤(例如，靶细胞与癌症杀伤t细胞的高的有效比率)表明癌症杀伤t细胞或其制剂是癌细胞的有效杀伤剂。在一个实施方案中，将靶标与t细胞的比率与参考比率进行比较。例如，1(t细胞)比10，20，30，40，50，75，100，500或更高(靶细胞)的比率表明有效的t细胞杀伤活性。在优选的实施方案中，t细胞∶靶细胞的比率范围为1∶500或更高。具有有效细胞杀伤活性的t细胞的受试者可被鉴定为对picf和/或免疫调节剂强烈应答。

在一个实施例中，参考比率是两个减法之间的比率：

·没有picf的情况下的靶细胞数量减去加入picf的情况下的靶细胞数量(δt^picf)，两者共享相同的实验孵育条件，

ο其中该数量是通过减去在诱导最高靶细胞杀伤的picf剂量(或者备选地picf的最高剂量)的靶细胞数量来计算的，

ο其中最大值和最小值来自多剂量picf的剂量应答曲线的实验值的数学拟合。

·添加picf情况下的效应癌症杀伤t细胞的数量减去没有picf情况下的效应癌症杀伤t细胞的数量(δe^picf)，两者共享相同的孵育条件，

ο其中该数量是通过减去在诱导最高靶细胞杀伤的picf剂量(或者备选地最高剂量的picf)的靶细胞数量来计算的，

ο其中最大值和最小值来自多剂量picf的剂量应答曲线的实验值的数学拟合。

·这两个变量之间的比率定义为有效e∶t比率并且等于δt^picf/δe^picf。

·该有效e∶t比率测量在这种条件下被单个癌症杀伤t细胞杀伤的靶细胞的数量。对于不同孵育时间的相同样品和picf，该比率可以是相似的，因为它代表在不同时间产生的相同癌症杀伤t细胞的活性。

在一些实施方案中，有效e∶t比率表示所产生的癌症杀伤t细胞在杀伤癌症靶细胞方面的活性的估计。不希望受理论束缚，它等同于药物在杀伤癌细胞方面的活性，因为癌症杀伤t细胞确实是用于治疗受试者例如癌症患者的活性药物。有效e∶t比率可以对来自不同患者的癌症杀伤t细胞的活性进行排序，从而对那些患者进行分级。该排序或分级可以与从测量杀死癌症靶细胞的效力的标准方法得到的排序或分级非常不同。例如，如果该患者具有非常大的癌症靶细胞密度，具有1∶200有效e∶t比率的非常有效的癌症杀伤t细胞(每个所述癌症杀伤t细胞消除200个靶细胞)可能无法杀死所有癌细胞。在标准的化学疗法活性测量中，留下许多存活的癌细胞通常被认为表示癌症杀伤t细胞的活性低；在这种情况下，其将错过由picf产生的癌症杀伤t细胞的真正的高活性，问题在于一些癌细胞被免疫抑制并且对产生的其他高活性癌症杀伤t细胞具有抗性。因此，有效e∶t比率可以鉴定最具活性的癌症杀伤t细胞，例如那些更适合施用给患者的癌症杀伤t细胞。

备选地，低水平的有效e∶t比率表明t细胞杀伤活性差。在一个实施方案中，1∶5(例如，1，3或5)癌症杀伤t细胞∶靶细胞的比率表明t细胞杀伤活性差。具有降低的细胞杀伤活性的t细胞的受试者可被鉴定为对picf和/或免疫调节剂应答性差。

除了有效e∶t比率，基础e∶t比率，ec50，emax，动力学和这些变量的关联之外，还有备选方法来估计癌症杀伤t细胞的活性。使用不同的药理学操作模型，更复杂的数学计算和拟合实验数据的不同方式可以提供不同的方式来计算相对于本文提出的有效e∶t比率，癌症杀伤t细胞杀死多少癌细胞。有效e∶t比率的定义也考虑了用于计算基本上相同的概念以估计癌症杀伤t细胞的活性的那些替代方法。

在任何上述方法或测定的实施方案中，在步骤(c)后以一个或多个时间间隔测定靶细胞和/或癌症杀伤细胞的水平。在示例性实施方案中，在步骤(c)后在0时刻，在1-168小时(例如1，2，4，8，16，24，48，72，96，120，144或168小时)或数天或数周的时间确定靶细胞和/或癌症杀伤细胞的水平。

在任何上述方法或测定的实施方案中，接触步骤还包括以picf和/或免疫调节剂的不同剂量(例如，增加的剂量)添加picf和/或免疫调节剂，例如，以产生剂量-应答曲线。在一个实施方案中，测定在零剂量或对照水平(例如阈值剂量)和picf和/或免疫调节剂的饱和剂量的t细胞或癌细胞水平之间的差异。在实施方案中，确定在饱和剂量相对阈值剂量的t细胞或癌细胞水平差异。在实施方案中，本文使用的有效e∶t比率是t细胞水平差异相对于癌细胞水平差异的比率。在实施方案中，本文使用的有效e∶t比率是在其各自的ec50浓度下的t细胞和靶细胞的数量的比率。

在任何上述方法或测定的实施方案中，该方法使用自动化平台进行，例如基于自动荧光的平台，例如本文所述的exvitech平台。

在任何上述方法或测定的实施方案中，使用离体/体外测定来测定picf和/或免疫调节剂的活性以测量剂量应答曲线，其数学拟合使得定量参数(其选自ec50，有效e∶t比率，emax或动力学中的至少一个)能够估计活性。在任何上述方法或测定的实施方案中，步骤(e)评估的picf和/或免疫调节剂的活性不同于使用picf和/或免疫调节剂活性的剂量应答例如相比于标准消耗剂量应答曲线的活性评估。

在任何上述方法或测定的实施方案中，参考比率是预定比率，例如约1∶3至1∶10，例如约1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9或1∶10。在实施方案中，来自步骤(e)的t细胞与高靶细胞的比率为约1∶4-1∶500(例如1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50，1∶75，1∶100，1∶500，或更高)。

在任何上述方法或测定的实施方案中，步骤(c)包括形成癌症杀伤t细胞或其制剂与靶细胞(例如癌细胞)的离体混合物。在实施方案中，癌细胞是选自血液癌症，实体癌症，转移性癌症(例如ctc或其组合)的细胞。在实施方案中，癌细胞是白血病或淋巴瘤母细胞(例如，表达一种或多种选自cd19，cd123，cd20或其他标志物的母细胞)。在实施方案中，t细胞是选自血液样品(例如外周血样品)，骨髓样品，淋巴结样品，脾样品，包含ctl和/或til的肿瘤样品或其组合的细胞。在实施方案中，t细胞表达cd8和/或cd25(例如，其是cd8+cd25+t细胞)。在其他实施方案中，t细胞表达cd4和/或cd25(例如，其是cd4+cd25+t细胞)。

在任何上述方法或测定的实施方案中，使用包括使用picf和/或免疫调节剂(例如本文所述的picf和/或免疫调节剂)的方法产生癌症杀伤t细胞或其制剂。

在任何上述方法或测定的实施方案中，癌症杀伤t细胞或其制剂包含t细胞，例如ctl，其为cd8+和cd25+，或cd4+和cd25+，或两者。

在任何上述方法或测定的实施方案中，候选picf和/或免疫调节剂以不同剂量(例如，以增加的剂量)施用。

在任何上述方法或测定的实施方案中，在候选picf和/或免疫调节剂存在下t细胞的细胞杀伤活性的增加表明picf和/或免疫调节剂的高效力。或者，在候选picf和/或免疫调节剂存在下t细胞的细胞杀伤活性的小变化或基本不变化表明picf和/或免疫调节剂的效力低。

筛选分析

另一方面，本文提供了鉴定用于从受试者产生癌症杀伤t细胞的有效picf的方法或测定。所述方法包括：

(a)提供候选picf(例如，一个或多个候选picf)；

(b)提供包含癌细胞和t细胞的样品，例如，如本文所述的一种或多种样品；和

(c)例如在足以激活t细胞(例如，使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物)的条件下(例如持续一段时间)，形成包含候选picf和样品的离体反应混合物，从而产生癌症杀伤t细胞。

在又另一个方面，本文提供了鉴定用于从受试者产生癌症杀伤t细胞的有效免疫调节剂的方法或测定。所述方法包括：

(a)提供候选免疫调节剂(例如，本文所述的一个或多个候选免疫调节剂)；

(b)提供包含癌细胞和t细胞的样品，例如，如本文所述的一种或多种样品；和

(c)例如在足以激活t细胞(例如，使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物)的条件下(例如持续一段时间和/或在预定浓度的候选免疫调节及的存在下)，形成包含候选免疫调节剂和样品的离体反应混合物，从而产生癌症杀伤t细胞。

在实施方案中，所述方法或测定还包括：

(d)例如对于每个候选picf或候选免疫调节剂，确定选自以下的一个或多个参数：癌细胞的消耗，激活的t细胞(例如胞啃t细胞)的数量或百分比和激活的t细胞(例如胞啃t细胞)的增殖。在一些实施方案中，(i)-(iv)中的一个或多个表明候选picf或免疫调节剂是用于从受试者产生癌症杀伤t细胞的有效picf或免疫调节剂：

(i)与参考水平相比，picf或免疫调节剂导致活癌细胞数量减少，例如，其中参考水平是反应混合物中活的癌细胞的数量或在没有picf或免疫调节剂的情况下与步骤(c)产生的癌症杀伤t细胞孵育后活的癌细胞的数量；

(ii)与参考水平相比，picf或免疫调节剂导致更高数量/百分比的激活的癌症杀伤t细胞，例如，其中参考水平是缺乏picf或免疫调节剂的类似的离体反应混合物中的激活的t细胞的数量/百分比，或在持续的时间不足以使t细胞从癌细胞中获得细胞表面标志物的情况下形成的离体反应混合物中激活的t细胞的数量/百分比；

(iii)与参考水平相比，picf或免疫调节剂导致激活的癌症杀伤t细胞的更多增殖，例如，其中参考水平是尚未暴露于癌细胞的t细胞例如ctl(例如，来自非癌症受试者的t细胞，例如ctl)或未离体暴露于picf或免疫调节剂的t细胞例如ctl(例如，来自癌症或非癌症受试者)的增殖；和/或

(iv)与相同样品和孵育条件下的不同picf相比，picf或免疫调节剂导致更高的有效e∶t比率。

在本文所述的任何上述方法或测定中，所述方法或测定可进一步包括提供免疫调节剂(例如，如本文所述的免疫检查点分子的抑制剂，免疫细胞的激动剂或其他免疫调节药物或细胞疗法中的一种或多种)。可加入免疫调节剂，使得形成离体反应混合物，其包含候选picf，免疫调节剂和样品。离体反应混合物的活性可根据步骤(d)测量。

在本文所述的任何上述方法或测定中，所述方法或测定可进一步包括评估抑制免疫细胞(例如髓源性抑制细胞(mdsc)或调节t(treg)细胞中的一种或多种)的水平或活性。在一些实施方案中，评估抑制免疫细胞表型的变化。在一个实施方案中，检测treg细胞标志物的水平或表达，例如表达cd4⁺cd25^hifoxp3⁺cd127的细胞。备选地，或组合地，通过检测以下中的一种或多种来确定mdsc标志物的水平或表达：cd33⁺/cd11b⁺/hla-dr^low/neg(例如，在aml中)，idohicd14⁺hla-dr^low(例如，在cll中)或cd11b⁺/cdl4^-/hla-dr^low/neg/cd33⁺cd15⁺(例如，在mm中)。免疫抑制细胞的标志物可以例如通过自动化的荧光细胞分选(例如，使用exvitech平台)检测。

在本文所述的任何前述方法或测定的一些实施方案中，picf(例如候选picf)的作用可以作为t细胞(例如，激活的t细胞)，胞啃t细胞，treg或mdsc中一种，两种，三种或全部的水平和/或活性的函数来评估。在一些实施方案中，可以确定在存在或不存在picf的情况下一种或多种前述细胞的数量和/或比率。

在本文所述的任何前述方法或测定的一些实施方案中，可以通过检测癌症杀伤t细胞的水平或活性和/或抑制免疫细胞(例如treg细胞或mdsc)的活性水平来评估任何化合物(例如免疫调节剂，例如picf)的治疗效力。在一个实施方案中，癌症杀伤t细胞的水平或活性的增加和/或抑制免疫细胞的活性水平的降低表明化合物的治疗效力增加。或者，癌症杀伤t细胞的水平或活性的降低和/或抑制免疫细胞的活性水平的增加表明化合物的治疗效力降低。

另一方面，本文的特征在于鉴定可能有效杀伤体内癌细胞的癌症杀伤t细胞的方法或测定，其包括：

(a)提供例如通过本文所述的方法产生的对癌细胞特异的癌症杀伤t细胞群；和

(b)确定选自以下的一个或多个参数：癌症杀伤t细胞对癌细胞的细胞毒性活性，癌症杀伤t细胞的生存力，癌症杀伤t细胞的增殖和癌症杀伤t细胞上细胞表面标志物的表达。

在一些实施方案中，通过以下一种或多种评估癌症杀伤t细胞的体内有效性：

(i)例如与参考水平相比检测癌症杀伤t细胞对癌细胞的细胞毒性活性，其中癌症杀伤t细胞的较高细胞毒性活性指示体内增加的有效性(在实施方案中，通过癌症杀伤t细胞对不同类型癌细胞的细胞毒性活性或癌症杀伤t细胞对非癌细胞的细胞毒性活性检测参考水平)；

(ii)例如与参考水平相比检测癌症杀伤t细胞的增殖，例如，其中较高的增殖指示体内增加的有效性(在实施方案中，参考水平是尚未暴露于癌细胞的t细胞例如ctl(例如，来自非癌症受试者的t细胞，例如ctl)的增殖或未离体暴露于picf的t细胞例如ctl(例如，来自癌症或非癌症受试者)的增殖)；

(iii)例如与参考水平相比检测癌症杀伤t细胞的生存力，其中癌症杀伤t细胞的生存力增加指示体内增加的有效性(在实施方案中，参考水平是尚未暴露于癌细胞的t细胞例如ctl(例如，来自非癌症受试者的t细胞，例如ctl)的生存力或未离体暴露于picf的t细胞例如ctl(例如，来自癌症或非癌症受试者)的生存力；或者

(iv)例如与参考水平相比检测一种或多种癌症抗原pd-1或tim-3在癌症杀伤t细胞上的表达水平，其中较高水平的表达指示增加的体内有效性(在实施方案中，参考水平是尚未暴露于癌细胞的t细胞例如ctl(例如，来自非癌症受试者的t细胞，例如ctl)上的癌症抗原pd-1和/或tim-3的表达)。

在另一个方面，本文还特征在于鉴定(例如和选择)可能有效杀死体内癌细胞的癌症杀伤t细胞的一个或多个克隆的方法或测定，其包括：

(a)提供包含例如通过本文所述的方法产生的对癌细胞特异的癌症杀伤t细胞的多个克隆的群体；

(b)将群体分开，例如分成个体克隆；和

(c)确定选自以下的一个或多个参数：癌症杀伤t细胞对癌细胞的细胞毒性活性，癌症杀伤t细胞的生存力，癌症杀伤t细胞的增殖或癌症杀伤t细胞上细胞表面标志物的表达。在实施方案中，单独评估克隆。

在实施方案中，(i)-(v)中的一个或多个表明该克隆可能在体内有效：

(i)例如使用有效e∶t比率测量的例如与参考水平(例如，其中所述参考水平是克隆对不同类型癌细胞的细胞毒性活性或克隆对非癌细胞的细胞毒性活性)相比克隆对癌细胞的较高细胞毒性活性；

(ii)例如与参考水平(例如，其中参考水平是尚未暴露于癌细胞的t细胞例如ctl(例如，来自非癌症受试者的t细胞，例如ctl)的增殖或未离体暴露于picf的t细胞例如ctl(例如，来自癌症或非癌症受试者)的增殖)相比，克隆的更多增殖；

(iii)例如与参考水平(例如，其中参考水平是尚未暴露于癌细胞的t细胞例如ctl(例如，来自非癌症受试者的t细胞，例如ctl)的生存力或未离体暴露于picf的t细胞例如ctl(例如，来自癌症或非癌症受试者)的生存力)相比，克隆的较高生存力；和/或

(iv)例如与参考水平(例如，其中参考水平是尚未暴露于癌细胞的t细胞例如ctl(例如，来自非癌症受试者的t细胞，例如ctl)上癌症抗原pd-1和/或tim-3的表达)相比，一种或多种癌症抗原pd-1或tim-3的较高表达。

在实施方案中，分离步骤包括以下一种或多种：有限稀释(例如，以获得克隆细胞群)，基于磁珠的富集或荧光细胞激活分选。在实施方案中，分离步骤还包括将单个细胞(例如，单个克隆)铺板到容器的单独孔中。所述方法还包括扩增每个单个细胞以产生每个克隆的群体。在一些实施方案中，施用细胞而不扩增。在其他实施方案中，细胞在细胞扩增后施用，例如在个体细胞扩增后施用。

在实施方案中，所述方法还包括扩增被鉴定为可能体内有效的克隆。

在实施方案中，该方法还包括组合两种或更多种已被鉴定为可能体内有效的克隆，并且(任选地)扩增克隆混合物。

用于鉴定应答于癌症疗法的受试者的测定和方法

在另一个方面，本文还特征在于评估受试者的方法或测定，例如，鉴定或选择对治疗(例如免疫调节和/或癌症疗法)有应答的受试者。所述方法包括：

(a)提供来自患有癌症的受试者的t细胞(例如，如本文所述的t细胞或t细胞样品)；

(b)提供例如来自受试者的癌细胞(例如，如本文所述的癌细胞或癌细胞样品)；

(c)形成离体反应混合物，其包含t细胞，癌细胞，邻近免疫辅导因子(picf)和治疗剂(例如癌症治疗剂)；

(d)确定步骤(c)的反应混合物的细胞杀伤活性，

在一些实施方案中，相对于参考值(例如，不存在治疗剂)，在治疗剂存在下反应混合物的细胞杀伤活性的增加表明对治疗的更高应答性。

在一些实施方案中，步骤(d)包括确定步骤(c)后的靶细胞水平，并且任选地确定步骤(c)后的癌症杀伤t细胞水平(在实施方案中，在步骤(c)之后以一个或多个时间间隔确定靶细胞和/或癌症杀伤细胞的水平)。在实施方案中，所述方法还包括确定例如如本文所述的靶细胞与t细胞或t细胞与靶细胞的有效e∶t比率。

在实施方案中，picf是双特异性抗体分子，例如双特异性免疫球蛋白(bsigg)，与另外的抗原结合分子可操作地连接的免疫球蛋白，双特异性抗体(bsab)片段，双特异性融合蛋白或bsab缀合物。

在实施方案中，picf是选自由以下组成的列表的双特异性抗体：bsmabcd123/cd3，bsmabcd19/cd3和epcam/cd3。

在实施方案中，所述治疗剂是免疫调节剂，例如本文所述的免疫调节剂。在一个实施方案中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂例如本文所述的免疫检查点抑制剂的抑制剂(例如以下一种或多种的抑制剂：ctla4，pd1，pdl1，pdl2，b7-h3，b7-h4，tim3，lag3，btla，cd80，cd86或hvem)。在实施方案中，免疫调节剂是t细胞的激动剂，例如本文所述的t细胞的激动剂，例如激动性抗体，例如cd137，gitr或cd40的激动性抗体或其片段。在一个实施方案中，免疫调节剂是mdsc和/或treg细胞的抑制剂。

在一个实施方案中，免疫调节剂是来那度胺(lenalidomide)。在其他实施方案中，免疫调节剂激活对肿瘤特异性抗原的免疫应答，例如，它是疫苗(例如针对靶标例如gp100，muc1或magea3的疫苗)。在其他实施方案中，免疫调节剂是细胞因子，例如选自gm-csf，il-7，il-12，il-15，il-18或il-21中的一种或多种的重组细胞因子。在其他实施方案中，免疫调节剂是自体t细胞，例如靶向肿瘤的细胞外和细胞内肿瘤特异性抗原(例如，cart细胞或tcrt细胞)。在其他实施方案中，免疫调节剂是与氨基酸分解代谢，肿瘤来源的细胞外atp的信号传导，腺苷信号传导，腺苷产生，趋化因子和趋化因子受体，外来生物的识别或激酶信号传导活性相关的组分(例如，酶或受体)的调节剂。示例性试剂包括ido，cox2，arg1，arg2，inos或磷酸二酯酶(例如pde5)的抑制剂(例如，小分子抑制剂)；tlr激动剂或趋化因子拮抗剂。免疫调节剂的其他实例进一步描述于例如，adamsjl(2015)和serafini(2008)中，其各自通过引用并入本文。

用于鉴定用于产生癌症杀伤t细胞的有效picf和/或免疫调节剂的方法或测定

在一个方面，本文的特征是鉴定用于从受试者产生癌症杀伤t细胞的有效picf和/或免疫调节剂的方法或测定，其包括：

(a)提供候选picf和/或免疫调节剂(例如，一种或多种候选picf和/或免疫调节剂)；

(b)提供包含癌细胞和t细胞的样品，例如，如本文所述的一种或多种样品；和

(c)例如在足以激活t细胞(例如，使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物)的条件下(例如持续一段时间)，形成包含候选picf和/或免疫调节剂和样品的离体反应混合物，从而产生癌症杀伤t细胞。

在实施方案中，所述方法或测定还包括：

(d)例如对于每个候选picf和/或免疫调节剂，确定选自以下的一个或多个参数：癌细胞的消耗，激活的t细胞(例如胞啃t细胞)的数量或百分比和激活的t细胞(例如胞啃t细胞)的增殖。

在实施方案中，(i)-(iii)中的一个或多个表明候选picf和/或免疫调节剂是用于从受试者产生癌症杀伤t细胞的有效picf和/或免疫调节剂：

(i)与参考水平相比，picf或免疫调节剂导致活癌细胞数量减少，例如，其中参考水平是反应混合物中活癌细胞的数量或与步骤(c)产生的癌症杀伤t细胞孵育后活癌细胞的数量；

(ii)与参考水平相比，picf和/或免疫调节剂导致更高数量/百分比的激活的t细胞，例如，其中参考水平是缺乏picf和/或免疫调节剂的类似离体反应混合物中激活的t细胞的数量/百分比，或在持续的时间不足以使t细胞从癌细胞中获得细胞表面标志物的情况下形成的离体反应混合物中激活的t细胞的数量/百分比；和/或

(iii)与参考水平相比，picf和/或免疫调节剂导致激活的t细胞的更多增殖，例如，其中参考水平是尚未暴露于癌细胞的t细胞例如ctl(例如，来自非癌症受试者的t细胞，例如ctl)的增殖或未离体暴露于picf和/或免疫调节剂的t细胞例如ctl(例如，来自癌症或非癌症受试者)的增殖。

评估(例如，筛选)候选picf和/或免疫调节剂的方法

在一些方面，筛选方法包括使用本文所述的方法(例如，其中来自患者的第一样品与picf混合)产生癌症杀伤t细胞。在实施方案中，筛选方法包括随后将来自患者的第二样品与癌症杀伤t细胞和一种或多种候选picf和/或免疫调节剂混合。在实施方案中，将t细胞与靶细胞的不同比率(e∶t比率)与固定浓度的picf和/或免疫调节剂组合。在其他实施方案中，将t细胞与靶细胞的固定比率(e∶t比率)与各种浓度的picf和/或免疫调节剂组合，例如，从而允许通过活性对picf/免疫调节剂进行排序。

因此，在一个方面，本文提供了评估候选picf和/或免疫调节剂的方法，其包括：

(a)提供例如根据本文所述的方法例如从受试者(例如，如本文所述的患有癌症的受试者)产生的癌症杀伤t细胞或其制剂；

(b)提供例如来自所述受试者的样品，其中所述样品包含靶细胞(例如癌细胞)；

(c)在足以使癌症杀伤t细胞杀伤癌细胞的条件下(例如，持续一段时间)，使候选picf和/或免疫调节剂(例如，一种或多种候选picf和/或免疫调节剂)与步骤(a)的癌症杀伤t细胞或其制剂和步骤(b)的第二样品接触；

(d)确定步骤(c)后的靶细胞水平，并且任选地确定步骤(c)后的癌症杀伤t细胞水平(在实施方案中，在步骤(c)之后以一个或多个时间间隔确定靶细胞和/或癌症杀伤细胞的水平)；和任选地(e)确定步骤(d)的靶细胞与t细胞或t细胞与靶细胞的有效比率。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞或其制剂和靶细胞(例如癌细胞)来自相同的样品。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞或其制剂和靶细胞(例如癌细胞)来自不同的样品。

在实施方案中，例如，使用例如来自相同的受试者的一个或多个另外的样品重复步骤(a)，(b)或(a)和(b)两者。

在实施方案中，步骤(e)包括使不同比率的t细胞与靶细胞和固定量的候选物接触，从而鉴定有效候选物。

在实施方案中，步骤(e)包括使固定比率的t细胞与靶细胞和不同浓度的候选物接触，从而确定候选物的活性并任选地基于活性对候选物进行排序。

在实施方案中，癌细胞的水平或量例如相对于参考水平的降低表明癌细胞杀伤增加。

在实施方案中，癌细胞的水平或量例如相对于参考水平的变化减小或基本上没有变化表明癌细胞杀伤减少。

在实施方案中，相对于癌症杀伤t细胞的高水平靶细胞(例如，靶细胞与癌症杀伤t细胞的高有效比率)表明癌症杀伤t细胞或其制剂是癌细胞的有效杀伤剂。

在实施方案中，将靶标与癌症杀伤t细胞比率与参考比率进行比较。

在实施方案中，1(癌症杀伤t细胞)比10，20，30，40，50，75，100或更高(靶细胞)的有效比率表明有效的t细胞杀伤活性。在优选的实施方案中，t细胞∶靶细胞的比率范围为1∶100或更高。在实施方案中，靶细胞与癌症杀伤t细胞的1∶100或更高的有效比率确定癌症杀伤t细胞是超级杀伤t细胞。

在实施方案中，在候选picf存在下t细胞的细胞杀伤活性的增加和/或靶细胞与癌症杀伤t细胞的高有效比率表明picf的高效力。

在实施方案中，相对于癌症杀伤t细胞的低水平靶细胞(例如，靶细胞与癌症杀伤t细胞的低有效比率)表明t细胞杀伤活性差。

在实施方案中，将靶标与癌症杀伤t细胞比率与参考比率进行比较。

在实施方案中，1(t细胞)比1，3或5(靶细胞)的有效比率表明t细胞杀伤活性差。

在实施方案中，在候选picf存在下t细胞的细胞杀伤活性的小变化或基本上无变化和/或靶细胞与t细胞的低有效比率表明picf的低效力。

在实施方案中，在步骤(c)后与一个或多个时间间隔测定靶细胞和/或癌症杀伤细胞的水平。

在实施方案中，在步骤(c)后在0时刻，在1-75小时(例如1，2，4，8，16，24，36或72小时)或数天的时间确定靶细胞和/或癌症杀伤细胞的水平。

在实施方案中，接触步骤还包括以picf的不同剂量(例如，增加的剂量)添加picf，例如以产生剂量应答曲线。

在实施方案中，该方法还包括确定零剂量或对照水平(例如阈值剂量)的picf与饱和剂量的picf的t细胞或癌细胞水平之间的差异。

在实施方案中，所述方法包括确定饱和剂量相比于阈值剂量的t细胞或癌细胞水平的差异。

在实施方案中，靶细胞(例如，癌细胞)与癌症杀伤t细胞的有效比率(例如，在步骤(e)中)是癌症杀伤t细胞水平的差异相对于癌细胞水平的差异的比率。

在实施方案中，所述方法使用自动化平台进行，例如基于荧光的细胞平台，例如本文所述的exvitech平台。

在实施方案中，使用离体/体外测定来测定picf和/或免疫调节剂的活性以测量剂量应答曲线，其数学拟合使得定量参数(选自ec50，有效e∶t比率，emax或动力学中的至少一个)能够估计活性。在实施方案中，步骤(e)评估的picf的活性不同于使用picf活性的剂量应答例如相比于标准的消耗剂量应答曲线的活性评估。

在实施方案中，参考比率是预定比率，例如约1∶3至1∶10，例如约1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9或1∶10。

在实施方案中，靶细胞与癌症杀伤t细胞的高有效比率为约1∶4至1∶100(例如，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50，1∶75，1∶100或更高)在实施方案中，靶细胞与癌症杀伤t细胞的1∶100或更高的有效比率确定癌症杀伤t细胞是超级杀伤t细胞。

在实施方案中，步骤(c)包括形成癌症杀伤t细胞或其制剂与靶细胞(例如癌细胞)的离体混合物。

在实施方案中，癌细胞是选自血液癌症，实体癌症，转移性癌症(例如ctc或其组合)的细胞。

在实施方案中，癌细胞是白血病或淋巴瘤母细胞(例如，表达一种或多种选自cd19，cd123，cd20或其他标志物的肿瘤细胞)。

在实施方案中，t细胞是选自血液样品(例如外周血样品)，骨髓样品，淋巴结样品，包含ctl和/或til的肿瘤样品或其组合的细胞。

在实施方案中，t细胞表达cd8和/或cd25(例如，它是cd8+cd25+t细胞)。

在实施方案中，使用包括使用picf(例如本文所述的picf)的方法产生癌症杀伤t细胞或其制剂。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞或其制剂包含t细胞，例如ctl，其为cd8+和cd25+。

在实施方案中，候选picf以不同剂量(例如，以增加的剂量)添加。

本文描述的任何方法和组合物的其他特征或实施方案包括以下一种或多种：

在任何上述方法或组合物的实施方案中，癌症杀伤细胞：(i)对癌细胞具有细胞毒性活性，和(ii)包含来自癌细胞的细胞表面标志物，例如至少90-500个拷贝的细胞表面标志物(例如，90，100，200，300，400或500，例如一种或多种癌细胞表面标志物)；和

在任何上述方法或组合物的实施方案中，反应混合物中总t细胞的约2％至75％(例如，约2％至70％，2％至60％，2％至50％，或2％至40％)表达一种或多种癌细胞表面标记物(例如，一种或多种白血病细胞癌)。

在实施方案中，富集或纯化癌症杀伤细胞。在一些实施方案中，富集或纯化的癌症杀伤细胞群包含至少80％的癌症杀伤t细胞(例如，80％，90％，95％，99％或100％)，其中所述癌症杀伤细胞包含一种或多种癌细胞表面标志物。

在本文所述的任何方法和组合物的一些实施方案中，picf具有提供针对t细胞的亲和力(例如，第一结合特异性)的第一元件和具有针对癌细胞的亲和力(例如，第二结合特异性)的第二元件。在实施方案中，第一和第二元件中的每一个包含一个，两个或三个，四个，五个或六个cdr。在实施方案中，第一和第二元件中的每一个不是fc区。

在实施方案中，第一和第二元件中的每一个对于其靶标具有1μm或更小例如约1pm或更小的解离常数(kd)。

在实施方案中，第一元件结合t细胞并且不结合实质数量(substantialnumber)的癌细胞(例如，第一元件结合t细胞的亲和力比结合癌细胞的亲和力高至少10-10000倍(例如，10，100，1000，10000倍或更高))；并且第二元件与癌细胞结合并且不结合实质数量的t细胞(例如，第二元件与癌细胞结合的亲和力比与t细胞结合的亲和力高至少10-10000倍(例如，10，100，1000，10000倍(或更高))。

在实施方案中，第二元件结合(例如，特异性结合)以下一种或多种：cd20，cd30，cd33，cd52，epcam，cea，gpa33，黏蛋白，tag-72，碳酸酐酶ix，psma，叶酸结合蛋白，神经节苷脂(例如，gd2，gd3，或gm2)，lewis-y2，vegf，vegfr，αvβ3，α5β1，erbb1/egfr，erbb2/her2，erbb3，c-met，igf1r，epha3，trail-r1，trail-r2，rankl，fap，生腱蛋白，cd123，c19，cd19，bcma或其他癌细胞抗原。

在实施方案中，第一元件结合(例如，特异性结合)t细胞，例如细胞毒性t细胞，例如包含以下一种或多种的t细胞：cd8，cd3，α/βt细胞受体(tcr)，γδtcr，cd45ro和/或cd45ra。

在实施方案中，picf包含双特异性抗体分子，例如双特异性免疫球蛋白(bsigg)，与另外的抗原结合分子可操作地连接的免疫球蛋白，双特异性抗体(bsab)片段，双特异性融合蛋白或bsab缀合物，例如如spiess等.(2015)mol.immunol.67：95-106中所描述(参见例如，图1，通过引用并入本文)。

在实施方案中，bsab片段包含例如通过接头例如双亲和性重靶向(dart)抗体片段或双特异性t细胞衔接子(bite)可操作地连接的两个或更多个scfv片段(例如双抗体)。在实施方案中，bsab片段包含例如通过接头可操作地连接的两个或更多个单结构域抗体片段(dab)。在实施方案中，bsab片段不包含fc区。

在实施方案中，picf是选自由以下组成的列表的双特异性抗体：bsmabcd123/cd3，bsmabcd19/cd3和epcam/cd3。

在实施方案中，picf包含cdr-移植的支架结构域，例如纤连蛋白支架结构域。

在其他实施方案中，抗体分子与固体表面(例如珠或聚合物)连接(例如缀合)。

在本文所述的任何上述方法或测定中，所述方法或测定可进一步包括提供免疫调节剂(例如，如本文所述的免疫检查点分子的抑制剂，免疫细胞的激动剂或其他免疫调节药物中的一种或多种)。在一些实施方案中，可以将免疫调节剂加入如本文所述的离体反应混合物中，从而形成包含候选picf，免疫调节剂和样品的离体反应混合物。在其他实施方案中，将免疫调节剂施用给受试者(例如接受如本文所述的癌症杀伤t细胞的受试者)作为组合治疗方案的一部分。

在一个实施方案中，免疫调节剂是免疫检查点抑制剂例如本文所述的免疫检查点抑制剂的抑制剂，例如以下一种或多种的抑制剂：ctla4，pd1，pdl1，pdl2，b7-h3，b7-h4，tim3，lag3，btla，cd80，cd86或hvem。在实施方案中，免疫调节剂是t细胞的激动剂，例如本文所述的t细胞的激动剂，例如激动性抗体，例如cd137，gitr或cd40的激动性抗体或其片段。在一个实施方案中，免疫调节剂是mdsc和/或treg细胞的抑制剂。

在一个实施方案中，免疫调节剂是来那度胺。在其他实施方案中，免疫调节剂激活对肿瘤特异性抗原的免疫应答，例如，其是疫苗(例如针对靶标例如gp100，muc1或magea3的疫苗)。在其他实施方案中，免疫调节剂是细胞因子，例如选自gm-csf，il-7，il-12，il-15，il-18或il-21中的一种或多种的重组细胞因子。在其他实施方案中，免疫调节剂是自体t细胞，例如靶向肿瘤的细胞外和细胞内肿瘤特异性抗原(例如，cart细胞或tcrt细胞)。在其他实施方案中，免疫调节剂是与氨基酸分解代谢，肿瘤来源的细胞外atp的信号传导，腺苷信号传导，腺苷产生，趋化因子和趋化因子受体，外来生物的识别或激酶信号传导活性相关的组分(例如，酶或受体)的调节剂。示例性试剂包括ido，cox2，arg1，arg2，inos或磷酸二酯酶(例如pde5)的抑制剂(例如，小分子抑制剂)；tlr激动剂或趋化因子拮抗剂。免疫调节剂的其他实例进一步描述于例如，adamsjl(2015)和serafinip(2008)中。

产生癌症杀伤t细胞的方法的进一步实施方案

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)还包括产生癌症杀伤t细胞制剂，例如药物制剂。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)还包括检测癌症杀伤t细胞的存在。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)还包括从icf中纯化癌症杀伤t细胞。

在实施方案中，picf例如在制剂中以按重量计小于10％，例如小于10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.05％，0.01％，0.005或更低(例如但不低于0.001％)的浓度存在。在优选的实施方案中，picf在制剂中以按重量计0.005％-10％的浓度存在。

在实施方案中，反应混合物含有按体积计加入到超过50微升(例如，约60微升)的细胞悬浮液中的若干纳升(例如，小于10nl，约1至5纳升)的picf。

在实施方案中，制剂包含picf，例如可通过免疫测定检测的picf水平。

在实施方案中，选择和/或富集步骤(例如，以上制备方法中的步骤ii)-iii)或(d))包括使用经荧光标记的分子(例如，细胞表面标记，例如经荧光标记的抗体或其片段，或细胞跟踪染料)，所述经荧光标记的分子扩散到癌细胞膜中或结合i)一种或多种癌抗原或ii)激活的t细胞的一种或多种标志物，或i)和ii)两者。在实施方案中，选择和/或富集步骤包括使用荧光激活细胞分选(facs)。

在实施方案中，选择和/或富集(例如，以上制备方法中的步骤ii)-iii)或(d))包括使用涂覆有抗体或其片段的珠(例如，磁珠)，所述抗体或其片段结合i)一种或多种癌症抗原或ii)激活的t细胞的一种或多种标志物，或i)和ii)两者。

在实施方案中，选择和/或富集步骤(例如，以上制备方法中的步骤ii)-iii)或(d))包括顺序添加低数量，例如，数量不足的癌细胞。在实施方案中，上述制备方法可产生细胞毒性t细胞的不同克隆。在实施方案中，通过依次添加低数量，例如，数量不足的癌细胞，可以选择对杀死癌细胞最有效或最有力的细胞毒性t细胞克隆。在实施方案中，可添加至包含癌症杀伤t细胞的反应中的低的或不足的数目或数量的癌细胞为激活的t细胞数目的50％或更少，例如30％，10％，1％，0.1％或0.01％或更少。在一个实施方案中，可将低或不足数量的癌细胞加入癌症杀伤t细胞(例如，包含癌细胞，t细胞和/或picf的反应)一次或多次，例如2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次，9次或10次。在一个实施方案中，每6小时，12小时，24小时，36小时或48小时添加低或不足数量的癌细胞。在一个实施方案中，添加的低或不足数量的癌细胞是来自患者的癌细胞。在一个实施方案中，添加的低或不足数量的癌细胞不是来自患者的癌细胞。在一个实施方案中，添加的低或不足数量的癌细胞是来自癌细胞系的癌细胞。

在实施方案中，扩增癌症杀伤t细胞。在实施方案中，癌症杀伤t细胞的扩增包括增加例如在制剂中的癌症杀伤t细胞的数量，例如，增加至少约2倍(例如，至少约3-，4-，5-，6-，7-，8-，9-，10-，15-，20-，50-，100-，1000-，10⁴-，10⁵-，10⁶-倍或更多)。

在其他实施方案中，癌症杀伤t细胞基本上不扩增。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含经荧光标记的分子(例如，细胞表面标记，例如经荧光标记的抗体或其片段或细胞跟踪染料)和/或picf，例如，其中经荧光标记的分子和/或picf以痕量存在(例如，按重量计小于5％，例如按重量计小于5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.25％，0.1％，0.05％，0.01％，0.005％，0.001％或更少)。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂(在纯化或扩增之前)包含癌症杀伤t细胞，其浓度为制剂中细胞总数的5％或更少。

在实施方案中，纯化或富集的癌症杀伤t细胞制剂包含浓度为制剂中细胞总数的至少50％的癌症杀伤t细胞(例如，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或更多)。

在实施方案中，纯化或富集的癌症杀伤t细胞制剂包含激活的癌症杀伤t细胞，例如浓度为制剂中细胞总数的至少50％(例如，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或更高)。

在实施方案中，纯化或富集的癌症杀伤t细胞制剂包含胞啃癌症杀伤t细胞，例如浓度为制剂中细胞总数的至少50％(例如，至少50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，99％或更高)。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞或制剂包含一种或多种cd8+t细胞。在实施方案中，癌症杀伤t细胞或制剂包含一种或多种cd4+t细胞。在实施方案中，癌症杀伤t细胞或制剂包含一种或多种cd25+t细胞。在实施方案中，癌症杀伤t细胞或制剂包含一种或多种cd8+/cd25+ctl。在实施方案中，癌症杀伤t细胞或制剂包含一种或多种cd4+/cd25+t细胞。在实施方案中，癌症杀伤t细胞或制剂包含一种或多种细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，例如癌症抗原特异性ctl。在实施方案中，癌症杀伤t细胞或制剂包含一种或多种效应记忆t细胞。在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂不包含实质数量的调节性t细胞(treg)。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)还包括减少癌症杀伤t细胞制剂中treg的数量。在一个实施方案中，picf选择性地扩增癌症杀伤t细胞，从而增加癌症杀伤t细胞∶treg的有效e∶t比率。在其他实施方案中，所述方法还包括例如使用与treg细胞表面标志物连接的珠(例如，磁珠)通过物理分离除去(例如，消耗)treg。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含浓度小于制剂中细胞总数的10％(例如，小于9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1的％或更少)的treg。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂不包含实质数量的初始t细胞。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含浓度小于制剂中细胞总数的10％(例如，小于9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％或更少)的初始t细胞。

在实施方案中，初始t细胞表达cd45ra，cd62l，ccr7，cd27，cd28和/或cd57。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含癌症杀伤t细胞的超过一个克隆。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)还包括从癌症杀伤t细胞制剂中分离个体克隆。

在实施方案中，分离步骤包括单细胞的克隆扩增(例如，(i)将癌症杀伤t细胞的制剂分离成单细胞(例如，每个孔或容器中的单细胞)和(ii)将这些单细胞扩增以产生一个或多个癌症杀伤t细胞制剂，其中每个制剂包含单克隆)。

在实施方案中，分离步骤包括流式细胞术或有限稀释。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)还包括确定癌症杀伤t细胞制剂的癌症杀伤活性，和任选地，基于选自以下一个或多个的参数选择制剂：增加的癌细胞杀伤活性，降低的毒性，降低的脱靶效应，增加的存活力，增加的增殖，或对于癌细胞杀伤的有效e∶t比率。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含具有高癌症杀伤活性和/或低毒性的细胞。

包含在具有低毒性的癌症杀伤t细胞制剂中的细胞是杀伤显著较少的非病理细胞的细胞，即其更有选择性地杀伤。在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含具有低毒性的细胞，因为其在上清液和/或细胞内产生较少的细胞因子。在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含同时具有更高的癌症杀伤活性和低毒性两者的细胞，因为其在上清液和/或细胞内每单位癌细胞杀伤产生更少的细胞因子，即通过定量估计癌细胞杀伤活性(如有效e∶t比率，ec50，emax，动力学或这些因子的组合)来标准化释放的细胞因子的类型和/或水平。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含以高的靶细胞/t细胞有效杀伤癌细胞的细胞。在实施方案中，t细胞与高靶细胞比率为约1∶4至1∶100(例如，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50，1∶75，1∶100或更高)。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含由少于10个癌症杀伤t细胞克隆组成的细胞群。在实施方案中，制剂中存在10，9，8，7，6，5，4，3，2或1个癌症杀伤t细胞克隆。在一个实施方案中，制剂中存在2-4个克隆。在其他实施方案中，癌症杀伤t细胞的单个克隆。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)的t细胞或t细胞样品和所述方法(例如，制备方法)的癌细胞或癌细胞样品来自相同的受试者。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)的t细胞或t细胞样品和所述方法(例如，制备方法)的癌细胞或癌细胞样品来自不同的受试者。

在实施方案中，将癌症杀伤t细胞或制剂施用给受试者，例如，其中所述受试者是与获得t细胞(和/或癌细胞)的受试者相同的受试者。例如，癌症杀伤t细胞或制剂是自体的。

在实施方案中，将癌症杀伤t细胞或制剂施用给受试者，例如，其中所述受试者是与获得t细胞(和/或癌细胞)的受试者不同的受试者。例如，癌症杀伤t细胞或制剂是同种异体的。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)包括提供包含t细胞的样品。在实施方案中，方法(例如，制备方法)包括提供包含癌细胞的样品。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)的t细胞和癌细胞来自相同的样品。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)的t细胞和癌细胞来自不同的样品。

在实施方案中，样品来源于具有微环境的组织，例如骨髓，淋巴结，原发肿瘤或转移。

在实施方案中，样品包含受试者的血液(例如全血，外周血或骨髓)，实体肿瘤(例如，从原发肿瘤切除的样品或转移瘤)，淋巴结或脾脏。在实施方案中，样品是血液样品，例如全血，外周血或骨髓，其中基本上没有从血液样品中除去或分离组分(例如，细胞或血浆)。在实施方案中，例如在步骤(c)之前和/或过程中，用生理上相容的缓冲液或培养基稀释样品。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)包括从来自受试者的血液样品提供t细胞，例如，其中t细胞不从血液样品中的其他组分(例如细胞或血浆)中纯化。在实施方案中，血液样品是骨髓样品，外周血样品或全血样品。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)包括从来自受试者的血液样品提供癌细胞，例如，其中癌细胞不从血液样品中的其他组分(例如细胞或血浆)中纯化。在实施方案中，血液样品是骨髓样品，全血样品或外周血样品。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)的癌细胞包含例如来自受试者的血液样品例如外周血样品的循环癌细胞。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)包括从来自受试者的组织样品(例如活组织检查，例如肿瘤或转移的活组织检查)提供癌细胞。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)包括提供样品，例如血液样品(例如，骨髓，外周血或全血样品)，其包含t细胞和癌细胞。

在实施方案中，受试者是成人或儿科受试者。

在实施方案中，癌症是血液癌症，例如b细胞或t细胞恶性肿瘤。

在实施方案中，癌症是霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(例如，b细胞淋巴瘤，弥漫性大b细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，套细胞淋巴瘤，边缘区b细胞淋巴瘤，伯基特(burkitt)淋巴瘤，淋巴浆细胞淋巴瘤，毛细胞白血病)，急性髓性白血病，慢性髓性白血病，骨髓增生异常综合征，多发性骨髓瘤或急性淋巴细胞白血病。

在实施方案中，癌症是实体癌症，例如其中实体癌症包括卵巢癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，肛门区域的癌症，子宫癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，非小细胞肺癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，卡波西(kaposi)肉瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，脑干胶质瘤，垂体腺瘤，表皮样癌，宫颈鳞状细胞癌，输卵管癌，子宫内膜癌，阴道癌，软组织肉瘤，尿道癌，外阴癌，阴茎癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾盂癌，脊柱轴肿瘤，中枢神经系统肿瘤(cns)，原发性cns淋巴瘤，肿瘤血管发生，所述癌症的转移病灶，或其组合。

在实施方案中，癌症不是黑素瘤。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)不包括在使样品与picf接触之前用荧光分子标记癌细胞(例如，癌细胞膜)。

在实施方案中，受试者：

(a)未接受过在先的癌症治疗；

(b)已接受过一次或多次在先癌症治疗；或

(c)具有最小残留疾病(mrd)。

在实施方案中，时间为12至120小时(例如，12-24小时，24-48小时，48-36小时，36-60小时，60-90小时或90-120小时)或1-7天(例如，1，2，3，4，5，6或7天)。

在实施方案中，本文描述的方法还包括使用不同的t细胞和癌细胞样品重复以下：提供样品或细胞的步骤，离体反应形成步骤和/或富集步骤(例如，制备方法的步骤(a)-(d))，例如，其中每个步骤的重复使用不同的t细胞和癌细胞样品。在实施方案中，t细胞和癌细胞的不同样品包含来源于具有微环境的组织(例如骨髓，淋巴结，原发肿瘤或转移)的样品。

在实施方案中，将从每个重复步骤产生的癌症杀伤t细胞汇集以形成癌症杀伤t细胞的混合物。

在实施方案中，t细胞包含ctc，并且t细胞来自受试者的样品(例如，血液(例如，全血，外周血或骨髓)，淋巴结，原发肿瘤或转移)。在实施方案中，t细胞富含ctc。在实施方案中，纯化t细胞，例如，从其他类型的细胞中纯化，例如，从受试者的血液样品(例如，全血，外周血或骨髓)中纯化。

在实施方案中，所述方法还包括使用来自受试者的t细胞的不同样品重复以下：提供样品或细胞的步骤，离体反应形成步骤和/或富集步骤(例如，制备方法的步骤(a)-(d))，例如，其中每个步骤的重复使用来自受试者的t细胞的不同样品。

在实施方案中，t细胞的不同样品包含来自受试者的含癌组织(例如原发肿瘤，一种或多种转移瘤，淋巴结，淋巴样品或血液样品(例如，全血，外周血或骨髓))的样品。

在实施方案中，从提供样品或细胞的步骤，离体反应形成步骤和/或富集步骤(例如，制备方法的步骤(a)-(d))的每次重复产生的癌症杀伤t细胞被汇集以形成癌症杀伤t细胞的混合物。

在实施方案中，所述方法(例如，制备方法)还包括评估癌症杀伤t细胞的癌症杀伤活性。在实施例中，所述评估包括：

(a)在足以使癌症杀伤t细胞杀伤癌细胞的条件下(例如，持续一段时间)使癌症杀伤t细胞与靶细胞接触，其中靶细胞源自癌症(例如，其中靶细胞包含源自癌症的细胞系，例如，其中靶细胞不从受试者分离)；

(b)确定步骤(a)后的靶细胞数量，并任选地确定步骤(a)后的癌症杀伤t细胞的数量；

其中，与接触步骤之前的靶细胞数量相比，靶细胞数量的减少表明癌症杀伤t细胞有效杀伤癌细胞。在实施方案中，例如与接触步骤之前的癌症杀伤t细胞的数量相比，癌症杀伤t细胞的数量的增加表明癌症杀伤t细胞有效杀伤癌细胞。

在实施例中，所述评估包括：

(a)提供例如根据本文所述的方法例如从受试者(例如，如本文所述的患有癌症的受试者)产生的癌症杀伤t细胞或其制剂；

(b)提供靶细胞(例如癌细胞)，例如，其中癌细胞来自受试者；

(c)在足以使癌症杀伤t细胞杀伤癌细胞的条件(例如，持续一段时间)下使癌症杀伤t细胞或其制剂与靶细胞(例如，癌细胞)接触(在实施方案中，接触步骤还包括添加例如不同剂量(例如，增加剂量)的picf；

(d)确定步骤(c)之后靶细胞的水平，并且任选地确定步骤(c)之后癌症杀伤t细胞的水平(在实施方案中，在步骤(c)之后以一个或多个时间间隔确定靶细胞和/或癌症杀伤细胞的水平)；和

(任选地)(e)确定步骤(d)的靶细胞与t细胞或t细胞与靶细胞的比率(例如，确定如本文所述的有效e∶t比率)。

在实施方案中，所述评估包括使用第一患者样品(例如含有t细胞和癌细胞的样品)以例如使用本文所述的方法产生癌症杀伤t细胞。在实施方案中，癌症杀伤t细胞被纯化，分选，富集，扩增和/或选择。在实施方案中，评估包括随后将来自相同患者的第二样品与使用第一患者样品产生的癌症杀伤t细胞混合。在实施方案中，可以将各种浓度的癌症杀伤t细胞与第二样品混合，例如，其中第二样品处于固定浓度，例如，以产生剂量应答曲线。

因此，在实施方案中，评估包括：

(a)例如，根据权利要求1的方法产生癌症杀伤t细胞或其制剂，其中t细胞和癌细胞存在于患者样品中，

(b)任选地扩增，选择，富集和/或纯化来自(a)的癌症杀伤t细胞，

(c)使来自(a)或(b)的癌症杀伤t细胞与例如来自相同患者的第二样品接触，其中第二样品包含一种或多种癌细胞，并且其中癌症杀伤t细胞与癌细胞接触，和

(d)确定如本文所述的剂量应答和/或药效学参数。

在实施方案中，通过有效e∶t比率，ec50，emax，动力学或这些因子的组合测量离体混合物中癌症杀伤t细胞(例如，胞啃细胞)的活性水平。

在实施方案中，步骤(c)包括以多种比率例如有效e∶t比率使癌细胞与癌症杀伤t细胞接触。

在实施方案中，步骤(c)包括将不同量的癌症杀伤t细胞与固定量的癌细胞混合。

在任何上述方法的一些实施方案中，获得有效e∶t比率。在一个实施方案中，有效e∶t是picf暴露后癌症杀伤t细胞和癌细胞之间的比率。

在任何上述方法的实施方案中，癌细胞的水平或量例如相对于参考水平的降低表明癌细胞杀伤增加。在其他实施方案中，癌细胞的水平或量例如相对于参考水平的变化减小或基本上没有变化表明癌细胞杀伤减少。

在任何上述方法的实施方案中，相对于t细胞的高水平靶细胞(例如，靶细胞与癌症杀伤t细胞的高的有效e∶t比率)表明癌症杀伤t细胞或其制剂是癌细胞的有效杀伤剂。在一个实施方案中，将靶标与t细胞比率与参考比率进行比较。例如，有效e∶t比率为1(癌症杀伤t细胞)比100(例如，10，20，30，40，50，75，100或更高)(靶细胞)表明有效的t细胞杀伤活性。具有有效细胞杀伤活性的t细胞的受试者可被鉴定为对picf强烈应答。

备选地，相对于t细胞的低水平靶细胞(例如，靶细胞与癌症杀伤t细胞的低有效e∶t比率)表明t细胞杀伤活性差。在一个实施方案中，将靶标与t细胞比率与参考比率进行比较。在一个实施方案中，1(癌症杀伤t细胞)比5(靶细胞)(例如，1，3或5)的有效e∶t比率表明t细胞杀伤活性差。具有降低的细胞杀伤活性的t细胞的受试者可被鉴定为对picf应答性差。

在任何上述方法的实施方案中，在步骤(c)后以一个或多个时间间隔测定靶细胞和/或癌症杀伤t细胞的水平。在示例性实施方案中，在步骤(c)后在时间0，在时间1-75小时(例如1，2，4，8，16，24，36或72小时)或数天确定靶细胞和/或癌症杀伤细胞的水平。

在任何上述方法的实施方案中，接触步骤还包括以picf的不同剂量(例如，增加的剂量)添加picf，例如以产生剂量应答曲线。在一个实施方案中，测定剂量为零或对照水平(例如阈值剂量)与饱和剂量的picf的癌症杀伤t细胞或癌细胞水平之间的差异。在实施方案中，确定饱和剂量相比阈值剂量的癌症杀伤t细胞或癌细胞水平差异。在实施方案中，本文使用的有效e∶t比率是癌症杀伤t细胞水平差异相对于癌细胞水平差异的比率。

在任何上述方法的实施方案中，该方法使用自动化平台进行，例如基于自动荧光的平台，例如本文所述的exvitech平台。

在任何上述方法或测定的实施方案中，使用离体/体外测定来测定picf和/或免疫调节剂的活性以测量剂量应答曲线，其数学拟合使得定量参数(其选自ec50，有效e∶t比率，emax或动力学中的至少一个)能够估计活性。在任何上述方法的实施方案中，步骤(e)评估的picf的活性不同于使用picf活性的剂量应答例如相比于标准的消耗剂量应答曲线的活性评估。

在任何上述方法的实施方案中，参考比率是预定比率，例如约1∶3至1∶10，例如约1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9或1∶10。在实施方案中，来自步骤(e)的高的靶细胞与t细胞比率为约1∶4至1∶100(例如，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50，1∶75，1∶100或更高)。

在任何上述方法的实施方案中，步骤(c)包括形成癌症杀伤t细胞或其制剂与靶细胞(例如癌细胞)的离体混合物。在实施方案中，癌细胞是选自血液癌症，实体癌症，转移性癌症(例如ctc或其组合)的细胞。在实施方案中，癌细胞是白血病或淋巴瘤母细胞(例如，表达一种或多种选自cd19，cd123，cd20或其他标志物的母细胞)。在实施方案中，t细胞是选自血液样品(例如外周血样品)，骨髓样品，淋巴结样品，包含ctl和/或til的肿瘤样品或其组合的细胞。在实施方案中，t细胞表达cd8和/或cd25(例如，它是cd8+cd25+t细胞)。

在任何上述方法的实施方案中，使用包括使用picf(例如本文所述的picf)的方法产生癌症杀伤t细胞或其制剂。

在任何上述方法的实施方案中，癌症杀伤t细胞或其制剂包含t细胞，例如ctl，其为cd8+和cd25+。在一些实施方案中，癌症杀伤t细胞是胞啃t细胞。在其他实施方案中，癌症杀伤t细胞是cd28+cd25+t细胞。

在任何上述方法的实施方案中，癌症杀伤细胞：(i)对癌细胞具有细胞毒性活性，和(ii)包含来自癌细胞的细胞表面标志物，例如90-500个拷贝的细胞表面标志物(例如，至少90，100，200，300，400或500个拷贝，例如一种或多种癌细胞表面标志物)。

在任何上述方法的实施方案中，反应混合物中总t细胞的约2％至75％(例如，约2％至70％，2％至60％，2％至50％，或2％至40％)表达一种或多种癌细胞表面标记物(例如，一种或多种白血病细胞癌)。

在实施方案中，富集或纯化癌症杀伤细胞。在一些实施方案中，富集或纯化的癌症杀伤细胞群包含至少80％-100％的癌症杀伤t细胞(例如，80％，90％，95％，99％或100％)，其中所述癌症杀伤细胞包含一种或多种癌细胞表面标志物。

在实施方案中，离体反应混合物根据goodmanufacturingpractice(gmp)制备。在实施方案中，癌症杀伤t细胞的扩增，选择和/或富集中的一种或多种是根据goodmanufacturingpractice(gmp)。在实施方案中，所述方法还包括将产生的癌症杀伤t细胞发送至例如医院，医疗保健提供者。在实施方案中，所述方法还包括例如从医院，医疗保健提供者接收t细胞，癌细胞或两者。

治疗方法的其他实施方案

在实施方案中，所述方法(例如治疗方法)还包括施用第二治疗剂或程序。在实施方案中，第二治疗剂或程序选自以下中的一种或多种：化学疗法，靶向抗癌疗法，溶瘤药物，细胞毒性剂，基于免疫的疗法，细胞因子，外科手术，放射程序，t细胞的激动剂(例如，激动性抗体或其片段或共刺激分子的激活剂)，抑制性分子(例如，免疫检查点抑制剂)的抑制剂，免疫调节剂，疫苗，或细胞免疫疗法。

在实施方案中，第二治疗剂是t细胞的激动剂(例如，激动性抗体或其片段或共刺激分子的激活剂)或免疫检查点抑制剂。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂是以下一种或多种的抑制剂：ctla4，pd1，pdl1，pdl2，b7-h3，b7-h4，tim3，lag3，btla，cd80，cd86，或hvem。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂包括以下中的一种或多种：伊匹单抗(ipilimumab)，tremelimumab，mdx-1106，mk3475，ct-011，amp-224，mdx-1105，imp321或mga271。

在实施方案中，t细胞的激动剂包含针对cd137，cd40和/或糖皮质激素诱导的tnf受体(gitr)的抗体或其片段。

在一个实施方案中，免疫调节剂是mdsc和/或treg细胞的抑制剂。在实施方案中，免疫调节剂包含/是来那度胺。

在实施方案中，第二治疗剂增强和/或恢复t细胞的免疫能力。

在其他实施方案中，免疫调节剂激活对肿瘤特异性抗原的免疫应答，例如，其是疫苗(例如针对靶标例如gp100，muc1或magea3的疫苗))。在其他实施方案中，免疫调节剂是细胞因子，例如选自gm-csf，il-7，il-12，il-15，il-18或il-21中的一种或多种的重组细胞因子。在其他实施方案中，免疫调节剂是自体t细胞，例如靶向肿瘤的细胞外和细胞内肿瘤特异性抗原(例如，cart细胞或tcrt细胞)。在其他实施方案中，免疫调节剂是与氨基酸分解代谢，肿瘤来源的细胞外atp的信号传导，腺苷信号传导，腺苷产生，趋化因子和趋化因子受体，外来生物的识别或激酶信号传导活性相关的组分(例如，酶或受体)的调节剂。示例性试剂包括ido，cox2，arg1，arg2，inos或磷酸二酯酶(例如pde5)的抑制剂(例如，小分子抑制剂)；tlr激动剂或趋化因子拮抗剂。本文描述了免疫调节剂的其他实例。

组合物和反应混合物的其他实施方案

在实施方案中，picf包含抗体分子，例如双特异性抗体或其片段，例如双特异性免疫球蛋白(bsigg)，与另外的抗原结合分子可操作地连接的免疫球蛋白，双特异性抗体(bsab)片段，双特异性融合蛋白或bsab缀合物。

在实施方案中，picf是选自由以下组成的列表的双特异性抗体：bsmabcd123/cd3，bsmabcd19/cd3和epcam/cd3。

在实施方案中，picf例如在本文所述的组合物中以可检测的量存在，例如，浓度按重量计小于10％，例如小于10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.05％，0.01％，0.001％或更少(但不小于0.0001％)。在一个实施方案中，picf以小于1％的水平存在。在优选的实施方案中，picf在制剂中以按重量计0.005％-10％的浓度存在。

在实施方案中，癌症杀伤细胞包含激活的t细胞。

在实施方案中，癌症杀伤细胞包含已经历过细胞增多症的细胞，例如包含来自癌细胞的细胞表面膜的一部分的细胞。

在实施方案中，癌症杀伤细胞是t细胞，例如细胞毒性t淋巴细胞，例如cd8+t细胞。

在实施方案中，组合物或制剂不包含实质数量的癌细胞，例如包含的癌细胞的浓度小于组合物或制剂中细胞总数的30％(例如，小于30％，25％，20％，15％，10％，5％，2.5％，1％，0.5％，0.1％或更低)。

在实施方案中，组合物或制剂不包含实质数量的调节性t细胞(treg)，例如，包含的treg的浓度小于组合物或制剂中细胞总数的30％(例如，小于30％，25％，20％，15％，10％，5％，2.5％，1％，0.5％，0.1％或更低)。

在实施方案中，组合物或制剂不包含实质数量的初始t细胞，例如，包含的初始t细胞的浓度小于组合物或制剂中细胞总数的30％(例如，小于30％，25％，20％，15％，10％，5％，2.5％，1％，0.5％，0.1％或更低)。

在实施方案中，组合物或制剂不包含实质数量的红细胞，例如包含的红细胞的浓度小于组合物或制剂中细胞总数的30％(例如，小于30％，25％，20％，15％，10％，5％，2.5％，1％，0.5％，0.1％或更低)。

在实施方案中，组合物或制剂不包含实质数量的非免疫细胞，例如包含的非免疫细胞的浓度小于组合物或制剂中细胞总数的30％(例如，小于30％，25％，20％，15％，10％，5％，2.5％，1％，0.5％，0.1％或更低)。

在实施方案中，组合物或制剂包含的激活t细胞的浓度为组合物或制剂中细胞总数的至少30％(例如，至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％或更多)。

在实施方案中，所述组合物或制剂包含的胞啃t细胞的浓度为组合物或制剂中细胞总数的至少30％(例如至少30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％或更多)。

此外，本文提供了癌症杀伤t细胞(例如，通过本文描述的方法制备的)的制剂，其(例如，用于制备药物，所述药物)用于治疗受试者中的癌症(例如，血液癌症，实体癌症或转移性癌症)。

此外，本文提供了癌症杀伤t细胞，其(例如，用于制备药物，所述药物)用于治疗受试者中的癌症(例如，血液癌症，实体癌症或转移性癌症)，其中所述癌症杀伤t细胞通过包括以下的方法产生：

(a)提供来自受试者的样品，其中所述样品包含t细胞和癌细胞；

(b)使所述样品与邻近免疫辅导因子(picf)接触例如一段时间；和

(c)富集已从癌细胞获得细胞表面标志物的癌症杀伤t细胞。

此外，本文的特征在于癌症杀伤t细胞，其(例如，用于制备药物，所述药物)用于治疗受试者中的癌症(例如，血液癌症或实体癌症)，其中所述癌症杀伤t细胞通过包括以下的方法产生：

(a)提供受试者的肿瘤样品；

(b)从受试者提供血液样品(例如外周血样品)，其中所述血液样品包含t细胞；

(c)使所述肿瘤样品与所述血液样品和邻近免疫辅导因子(picf)接触例如一段时间；和

(d)富集已从癌细胞获得细胞表面标志物的癌症杀伤t细胞。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物，专利申请，专利和其他参考文献都通过引用整体并入。在冲突的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。另外，材料，方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。

根据以下详细描述和权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。

附图简述

图1：示意图，其显示通过随后向先前通过将样品与picf孵育产生的细胞毒性t细胞中添加少量肿瘤细胞来选择细胞毒性t细胞的示例性方法。

图2：示意图，其显示用于测量胞啃作用的细胞表面标记机制。上图描绘了通过识别癌细胞上的特定细胞表面标志物的经荧光标记的抗体的细胞表面标记。下图显示了通过细胞跟踪染料的癌细胞的非特异性细胞表面标记。经标记的肿瘤细胞与t细胞之间的相遇将导致经标记的肿瘤细胞和t细胞之间的免疫突触的形成，以及胞啃，其中t细胞结合肿瘤细胞膜的部分以致经标记的抗体或细胞跟踪染料现在存在于t细胞表面上。

图3：图片，其显示在癌症杀伤t细胞(细胞毒性t细胞)和癌细胞之间产生的免疫突触，其中t细胞延伸其触手捕获癌细胞。这种接触涉及跨两细胞的膜区块的各自细胞膜的深度重叠。

图4：示意图，其显示通过使用经荧光标记的抗体和细胞跟踪染料的细胞表面标记测量胞啃作用，所述抗体特异性结合细胞表面上的靶标(上图)，并且所述细胞跟踪染料是在脂质膜双层内非特异性分布的荧光亲脂性分子。

图5：示意图，其显示在含有癌细胞和t细胞的样品中使用细胞跟踪染料测量胞啃作用的示例性方法。首先，将癌细胞，t细胞和picf一起孵育(例如，持续144小时)。可以去除picf(例如，通过洗涤步骤)，并且产生的细胞毒性t细胞将杀伤癌细胞，使得混合物中存在高百分比的细胞毒性t细胞和低百分比的癌细胞。可以引入用细胞跟踪染料标记的第二组癌细胞，并且可以通过鉴定已经结合来自第二组癌细胞的经标记的细胞膜的t细胞来测量胞啃作用。

图6：图表，其显示与不同浓度的肿瘤靶cd3t细胞双特异性抗体孵育后来自多发性骨髓瘤患者的骨髓样品中t淋巴细胞计数(cd8+cd25+)和浆细胞计数。

图7：图表，其显示与不同浓度的cd19(肿瘤靶标)/cd3(t细胞靶标)双特异性抗体孵育后来自慢性淋巴细胞白血病患者的外周血样品中的恶性b淋巴细胞计数和t淋巴细胞计数(cd8+cd25+)。

图8：一组图表，其显示与不同浓度的cd123(肿瘤靶标)/cd3(t细胞靶标)双特异性抗体孵育后来自三个急性髓性白血病患者(样品1，2和3)的骨髓样品的母细胞计数和t淋巴细胞计数(cd8+cd25+)。

图9：图表，显示在用药物(双特异性单克隆抗体)孵育之前(图9a和9b)和之后(图9c)的aml患者骨髓样品中的各种类型的细胞群。图9c中的圆圈显示了胞啃群体cd117+/cd3+的出现。

图10：实验的流式细胞术点图(cd117vscd3)，其显示在暴露于cd123/cd3bsmab144小时后新产生的ctl群体(胞啃细胞)的杀伤能力。图10a显示了在144小时bsmab暴露后来自第一个aml样品的点图，其中aml母细胞(cd117+/cd3-)已被消除，仅留下新产生的t细胞(cd3+/cd117-)。图10b显示来自同一患者的新冷冻保存的小瓶的点图，其中存在母细胞(cd117+/cd3-)和低水平的残留t细胞(cd117-/cd3+)。图10c显示了图10a和图10b的样品的混合物在0时间点的点图，其中可以看到存在t细胞(cd3+/cd117-)和新的aml母细胞(cd117+/cd3-)两者。图10d是孵育24小时后的点图，其中显然aml母细胞(cd117+/cd3-)在先前产生的t细胞群存在下被消耗。这是在没有cd123/cd3bsmab的情况下完成的。

图11：图表，其显示在重新引入和不重新引入药物(双特异性抗体)的情况下新产生的胞啃t细胞杀伤aml母细胞的能力随时间的结果。

图12：通过针对来自aml样品的母细胞分选的激活的t淋巴细胞(cd4+cd25+，cd8+cd25+和混合物cd4+cd25+/cd8+cd25+)的靶细胞裂解(肿瘤细胞存活率％)的代表性图(以e∶t比率(图12a)或t细胞数量(图12b))。各个数据点由线连接而没有模型拟合。

图13：一组图表，其中激活的癌症杀伤t细胞(图13a：cd8+cd25+，图13b：cd4+cd25+和图13c：cd4+cd25+/cd8+cd25+的混合物)的肿瘤细胞杀伤％，通过aml样品中的双曲线配体-受体模型拟合。相对于无药物对照评估肿瘤细胞存活率％。虚线对应于ic50值。

图14：流式细胞术点图(cd5vs.cd25)，其显示如何在来自aml患者的两个bm样品中富集ctl细胞计数。图14a显示了样品接收后的状态(cs5-cd25-)。图14b显示与cd123/cd3bsmab(cd5+cd25+)孵育后的样品。图14c显示荧光激活细胞分选cd5+cd25+群后的样品。该表显示了在该过程的每个步骤中存在的ctl的百分比。

图15：流式细胞术点图(cd5vs.cd123)，其显示ctl如何分选成胞啃(cd5+cd123+)和非胞啃(cd5+cd123-)ctl群体。图15a显示cd3+cd25+cd123-细胞群。图15b显示cd3+cd25+cd123+细胞群。图15c显示cd123+和cd123-群如何消耗aml母细胞的能力。

图16：一组图表，其显示cd123cd3bsmab对aml患者样品中的母细胞计数(图16a)和t细胞计数(图16b)的作用。母细胞计数存在时间和浓度依赖性降低，绝对t细胞计数存在相应的时间和浓度依赖性增加。

图17：cd123cd3bsmab在来自患有mrdaml的患者的样品中的作用。尽管样品的单核细胞群含有少于5％的母细胞，母细胞计数存在时间依赖性降低(图17a)，绝对t细胞计数存在相应的时间依赖性增加(图17b)。虚线表示没有bsmab的对照样品，实线表示cd123/cd3bsmab数据。

图18.流式细胞术点图，其显示来自aml患者的bm样品在与cd123/cd3bsmab孵育120小时之前和之后表达的标志物的水平。图18a-18d表示bsmab之前的基础时间点的细胞，图18e-18h显示孵育后样品的状态。图18a和18e显示激活标记物cd25的表达水平。图18b和18f显示由表型指示的亚群的分布：初始t细胞(初始，cd45ra⁺/ccr7⁺/cd27⁺)，中枢记忆t细胞(cm，cd45ra^-/ccr7⁺/cd27⁺)，效应记忆t细胞(em，cd45ra^-/ccr7^-/cd27^+/-)和末端效应记忆t细胞(e，cd45ra⁺/ccr7^-/cd27^-)。图18c和18g显示了标志物ccr7和cd62l的表达水平，并且图18d和18h显示了标志物cd28和cd57。数据来自一个aml样品，其代表所测试的4个aml样品。

图19.在两个时间点72小时和120小时孵育amlbm样品与cd123/cd3bsmab的结果。图19a显示了72小时孵育的母细胞消耗，并且图19b显示了120小时孵育的母细胞消耗。同时测量激活的ctl的水平，在图19c中表示72小时孵育，在图19d中表示120小时孵育。

图20.epcam/cd3双特异性抗体在对照和肿瘤细胞中的作用。图20a表示以剂量依赖性方式的肿瘤细胞杀伤。图20b显示肿瘤消耗的增加与t细胞上cd25激活标志物的增加有关。

图21.流式细胞术点图(cd5vs.pkh67)，显示t细胞的胞啃能力。图21a显示了孵育前基础时间的母细胞(pkh67++/cd5-)和t细胞(pkh67-/cd5++)的点图。图21b显示孵育后和不存在bsmab时母细胞(pkh67++/cd5-)和t细胞(pkh67-/cd5++)的点图。图21c显示孵育后和cd123/cd3bsmab存在下的母细胞(pkh67++/cd5-)和t细胞(pkh67-/cd5++)的点图。

图22.cd123/cd3bsmab在来自aml患者的bm样品中诱导应答。图22a显示ctl群体中的剂量-应答增加，其对应于(图22b)母(肿瘤)细胞的剂量-应答消耗。绝对计数的变化(δ)用于确定有效e∶t比为1∶100。

图23.一组图表，其显示在13个aml骨髓样品中在不同时间点(72-96-120小时)cd8+cd25+ctl(空心圆)和肿瘤细胞(实心圆)中cd123/cd3bsmab的ec50。图23a显示样品的ec50值的分布，图23b显示在各时间点各细胞群的中值。cd8+cd25+ctl和肿瘤细胞的ec50在各群和时间点之间相对相似。

图24.在不同孵育时间与bsmabcd123/cd3孵育的5种aml样品(选自图23中所示的那些，样品id001-005)的有效t∶e比率。y轴显示每个时间点的每个效应细胞(ctl)的靶细胞(肿瘤细胞)的数量。

图25：一组图表，其显示cd123cd3bsmab对具有配对bm(上图)和pb(下图)样品的5个aml患者(1-5)的作用。在相应的图中表示每个样品的有效e∶t比率，显示bm样品中更高的细胞毒性。

图26：图表，其显示bsmab对两个mm患者(a和b)对不同细胞群体(包括健康粒细胞)的结果。bsmab显示肿瘤细胞减少，ctl(cd8+cd25+)增加，但不杀伤健康的粒细胞。

图27：图表，其显示bsmab对两个aml患者(a和b)对不同细胞群体(包括健康b细胞)的结果。bsmab显示肿瘤细胞减少，ctl(cd4+cd25+和cd8+cd25+)增加，并且杀伤最小健康b细胞。

发明详述

本公开至少部分涉及产生和/或选择对不需要的靶细胞(例如癌细胞)具有增强的细胞毒性活性的免疫效应细胞的个性化医学方法。例如，本文的特征在于产生对靶标(例如癌细胞)具有增强的细胞毒性活性的免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)的方法。在实施方案中，所述方法包括使免疫效应细胞(例如，t细胞，例如细胞毒性t淋巴细胞(ctl))与靶细胞(例如癌细胞)空间接近。在实施方案中，所述方法包括使用药剂，例如邻近免疫辅导因子(picf)来诱导空间接近。

不希望受理论束缚，据信免疫效应细胞与靶细胞(例如癌细胞)的空间接近增加了经历免疫细胞激活的免疫效应细胞的数量，并且其中一些细胞经历被称为胞啃作用(trogocytosis)的过程(例如与在没有picf的情况下会发生胞啃作用的细胞数量相比)。而且，不希望受理论束缚，据信经历过胞啃作用的t细胞(例如，ctl)(也称为胞啃t细胞)对靶细胞(例如癌细胞)具有增强的细胞毒性活性。胞啃t细胞可包含许多记忆t细胞，其被稳定并高度致敏从而在本文所述的方法中杀伤暴露于其的特定靶细胞(例如，癌细胞)。

还认为实体瘤和血液恶性肿瘤中的一定百分比的t细胞富集于肿瘤浸润淋巴细胞(til)和/或癌症抗原特异性ctl(即识别癌细胞特异性抗原的ctl)。据信，存在于实体肿瘤块内的大多数(如果不是全部)t细胞是免疫抑制的肿瘤特异性抗原t细胞，称为til(肿瘤浸润淋巴细胞)。还认为实体瘤中til的百分比是免疫疗法治疗的临床应答的重要预测因子。这些概念导致了“基础e∶t比”(为关键的免疫肿瘤学变量，效应物与实体瘤中靶细胞的基础比率)的广泛使用。然而，在具有癌细胞的血液组织(来自血液恶性肿瘤或实体瘤的血液组织，例如血液，骨髓，脾，淋巴结)中，总是存在许多t细胞。因此，这些血液组织中的基础e∶t比具有与实体瘤中非常不同的含义。事实上，据信在这些具有癌细胞的血液组织中免疫抑制的肿瘤特异性抗原(tsa)t细胞群非常小。因此，如果按照与实体肿瘤相同的方法计算基础e∶t比率，总t细胞与癌细胞的比例，并且tsat细胞的百分比非常低，则这些基础e∶t比率可能会过高估计具有有效杀伤癌细胞(tsa)的先天能力但免疫抑制的t细胞数量。本文发现的“有效e∶t比”具有与以下相同的概念：能够有效杀伤癌细胞的效应t细胞数量除以癌细胞的数量的比率；在picf存在的情况下，它是新产生的激活的癌症杀伤t细胞(唯一可以杀伤癌细胞的细胞)的数量以及已被杀伤的癌细胞的数量的客观量度(两者均相对于对照条件)。在与血液恶性肿瘤样品一起孵育的双特异性抗体的出版物中，基础e∶t比率的大量使用表明缺乏对血液恶性肿瘤组织的t细胞异质性的认识。

据信，这些ctl的较高百分比存在于具有三维结构的微环境中，如实体瘤，骨髓和淋巴结，而这些ctl的较低百分比可能存在于更流体性的环境中，如外周血。ctl，例如癌症抗原特异性ctl，可以是用于例如通过将样品(含有癌细胞和ctl)与picf一起孵育产生具有增强的癌症杀伤活性的ctl的优选起始材料。在一些实例中，样品可以是具有三维结构的微环境(例如实体瘤，骨髓或淋巴结)。在其他实例中，样品可以是更流体性的微环境，如外周血。

另外，不希望受理论束缚，认为一些ctl(例如癌症抗原特异性ctl)被其微环境(例如骨髓或实体瘤)免疫抑制。还认为通过使ctl(例如，癌症抗原特异性ctl)与癌细胞离体直接接触，picf可以促进ctl(例如，癌症抗原特异性ctl)的激活和/或增殖。ctl(例如，癌症抗原特异性ctl)的激活可以使ctl从其免疫抑制状态释放并诱导其强烈增殖。这可以导致混合物中的大量ctl特异性识别癌症抗原并且高效杀伤具有所述特异性抗原的癌细胞。在使癌细胞与ctl在一起时，picf也可促进ctl的胞啃作用。因此，认为混合物中的胞啃t细胞倾向于是具有杀伤特定癌细胞的高效力的那些ctl。具有杀伤特定癌细胞的高效力的ctl群在本文中也称为胞啃t细胞。有利地，离体使用picf可以导致甚至从含有极少数癌症抗原特异性ctl的样品产生这种高杀伤效力ctl。

因此，picf提供了比先前可用的技术(例如，先前可用的act)产生具有增强的靶细胞杀伤活性的免疫效应细胞(例如，t细胞)的更有效方法(以及产生更多此类细胞的方法)。picf和胞啃作用以及测量其活性和识别高效癌症杀伤t细胞的方法在下面更详细地描述。

除了产生此类细胞的方法之外，本文还提供了包含对癌细胞具有增强的细胞毒性活性的免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)(例如，癌症杀伤t细胞，例如，胞啃t细胞)的组合物，例如药物组合物。

此外，不希望受理论束缚，据信包含本文所述的免疫效应细胞(例如，癌症杀伤t细胞)的疗法在杀死从实体癌症到血液癌症的各种癌症方面出人意料地有效。这与许多以前可获得的act不同，例如分离/扩增的肿瘤浸润淋巴细胞，其倾向于主要仅在高免疫原性癌症例如黑素瘤中有效。因此，特别出人意料的是本文所述的免疫效应细胞(例如，癌症杀伤t细胞)杀伤和治疗癌症的能力，在所述癌症中通常具有对癌细胞的低/最小免疫应答(例如，与黑素瘤不同，黑素瘤被认为具有比其他癌症类型更高的突变率，因此可能更具免疫原性)。

在实施方案中，免疫效应细胞(例如本文所述的癌症杀伤t细胞，例如，胞啃t细胞)，其制备方法和使用方法(例如，作为治疗)可具有以下一种或多种优点。在一些实施方案中，本文所述的癌症杀伤t细胞可靶向(和消除/减少)多种类型的癌细胞。在实施方案中，可以在不对患者细胞进行遗传修饰的情况下产生本文所述的癌症杀伤t细胞。例如，可以在不必鉴定t细胞所针对的特异性抗原的情况下产生本文所述的癌症杀伤t细胞。在实施方案中，可以在不预先标记癌细胞(例如，用可检测标记预先标记癌细胞膜或用特异性抗原预先标记癌细胞)的情况下产生本文所述的癌症杀伤t细胞。在实施方案中，本文所述的癌症杀伤t细胞可以在暴露/与癌细胞孵育之前在没有用抗原预激活t细胞的情况下产生。在实施方案中，本文所述的癌症杀伤t细胞可以通过将picf与来自受试者的血液样品(例如，骨髓，全血或外周血)一起孵育而不必从血液样品中分离任何细胞来产生。例如，血液样品可以包含靶细胞(例如，癌细胞)和将靶向靶细胞的免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)起始材料，使得不需要癌细胞和起始免疫效应细胞的单独制备。

本文方法和组合物的另一个优点包括激活的肿瘤抗原特异性t细胞(例如，胞啃t细胞)的安全优势。不希望受理论束缚，据信本文所述的激活的肿瘤抗原特异性t细胞(例如，使用本文所述的方法产生的)优先识别表达特定癌症抗原的癌细胞并且对其他不表达特异性癌症抗原的细胞(例如正常细胞)具有降低的反应性。这可以赋予这些激活的肿瘤抗原特异性t细胞安全性优势，因为它们优先杀死癌细胞。不希望受理论束缚，认为这种特异性是由于使用从已经对癌症抗原特异的ctl而来的激活的肿瘤抗原特异性t细胞的picf的离体测定中的优选和/或选择性激活和增殖。

此外，本文提供了为受试者(例如患者)选择合适的免疫疗法的方法。例如，本文提供了筛选picf的方法，例如，在产生对癌细胞具有增强的细胞毒性活性的免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)(例如，癌症杀伤t细胞，例如，胞啃t细胞)方面具有最佳活性的picf。在实施方案中，候选picf是先前未描述的新化合物/分子，并且这些方法用于药物发现。

另外，本文提供了鉴定对使用激活的肿瘤抗原特异性t细胞例如胞啃t细胞的治疗更可能有应答的受试者的方法。本文还描述了选择具有最高癌症杀伤活性的癌症杀伤t细胞的群体(例如，单个克隆或多个克隆)的方法。

本文还公开了鉴定更可能对癌症疗法(例如，先前描述的癌症疗法，例如，作为单一疗法或与本文所述的癌症杀伤t细胞疗法组合)有应答的患者的方法。所述方法利用使用picf(如本文所述)产生高细胞毒性癌症的t细胞的能力，并将这些细胞应用于离体测定。例如，所述方法涉及产生含有激活的肿瘤抗原特异性t细胞(例如，癌症杀伤t细胞，例如，胞啃t细胞(具有增强的靶细胞杀伤活性))的离体反应混合物，其中所述反应混合物由来自患者的组分产生。所述方法可以包括计算有效e∶t比率，其中高有效e∶t比率指示有效的t细胞杀伤活性，低有效e∶t比率指示差的t细胞杀伤活性。所述方法可以包括将候选癌症治疗剂添加到反应混合物中以检测应答，例如癌症杀死活性。不希望受理论束缚，据信反应混合物中激活的肿瘤抗原特异性t细胞(例如，癌症杀伤t细胞，例如，胞啃t细胞)的存在增加了测定的敏感性，使得在先前描述的离体测定中未观察到具有癌症杀伤活性的癌症治疗剂将在这种更灵敏的测定中显示出癌症杀伤活性。所述个性化医学测定也是测试大量癌症治疗剂在特定患者中的潜在效力以鉴定靶向治疗剂并避免施用在特定患者中不太可能有效的疗法的途径。所述方法与通过先前描述的离体测定法鉴定的相比，可以潜在地鉴定某些患者中有效并且可用的更多癌症治疗剂。

定义

如本文所用，冠词“一个”指的是一个或多于一个，例如，至少一个，所述冠词的语法对象。当在本文中与术语“包含”组合使用时，使用词语“一个”可以表示“一个”，但它也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的含义一致。

如本文所用，“约”和“近似”通常表示在给定测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差程度。示例性误差程度在给定值范围的20％内，通常在10％内，更通常在5％内。

术语“自体的”是指来自同一个体的任何材料，其后来被重新引入个体。

术语“同种异体的”是指衍生自与引入材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。

用于本说明书目的的术语“组合物”，术语组合物包括癌症杀伤t细胞，该术语包括激活的肿瘤抗原特异性t细胞，包括但不限于效应记忆t细胞，细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，辅助t细胞，肿瘤浸润淋巴细胞(til)和胞啃t细胞，及其药物组合物。

在治疗中使用“有效量”的目标化合物。根据本发明使用的化合物的剂量根据化合物和所治疗的病症，例如接受患者的年龄，体重和临床状况而变化。其他因素包括：施用途径，患者，患者的病史，疾病过程的严重程度以及特定化合物的效力。剂量应足以改善所治疗疾病的症状或体征，而不会对患者产生不可接受的毒性。通常，有效量的化合物是提供症状的主观缓解或临床医生或其他合格观察者所指出的客观可识别的改善的化合物。

如本文所用，“邻近icf”或“picf”是指通过使免疫效应细胞(例如t细胞)与靶细胞(例如癌细胞)接近而增强免疫效应细胞(例如t细胞(例如，ctl))的胞啃作用的试剂。在一个实施方案中，邻近icf结合(例如，直接结合)免疫效应细胞和靶细胞中的每一个。在一些实施方案中，邻近icf是抗体分子，例如对免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)具有第一结合特异性和对靶细胞具有第二结合特异性的双特异性抗体分子。不希望受理论束缚，picf可以帮助细胞毒性t细胞(ctl)的致敏和/或激活，其进而能够识别和/或消除肿瘤细胞。在一些实施方案中，例如，相对于在不存在picf的情况下由免疫效应细胞和癌细胞的混合物产生的胞啃免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)的群体，picf使胞啃免疫效应细胞(例如t细胞)的数量增加至少0.5％，1％，5％，10％，25％，30％或更多。

如本文所用，“胞啃作用”是指靶细胞(例如，抗原呈递细胞，例如癌细胞)的一部分细胞膜被转移至免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)，从而形成“胞啃”免疫效应细胞(其包含来自靶细胞的一部分细胞膜)的过程。在一些实施方案中，靶细胞的细胞膜部分包含一种或多种靶细胞抗原。因此，胞啃免疫效应细胞可在其细胞表面上包含一种或多种靶细胞抗原。在其他实施方案中，靶细胞的细胞膜部分损害膜荧光染料。因此，胞啃免疫效应细胞异常表达癌细胞表面标志物或先前用于染色癌细胞的膜染料。不希望受理论束缚，据信与未经历过胞啃作用的免疫效应细胞相比，经历过胞啃作用(例如捕获一种或多种靶细胞抗原)的免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)更有效地形成针对靶细胞的免疫应答(例如，杀伤)。

如本文所用的术语“免疫效应细胞”是指参与免疫应答的细胞，例如促进免疫效应子应答。免疫效应细胞的实例包括但不限于t细胞，例如cd4+和cd8+t细胞，α/βt细胞和γ/δt细胞，b细胞，天然杀伤(nk)细胞，天然杀伤t(nkt)细胞和肥大细胞。

如本文所用，“初始t细胞”是指包含缺乏抗原经验的细胞的t细胞，例如，其是记忆细胞的前体。在一些实施方案中，初始t细胞是较年轻的t细胞，即包含较低分化的表型。在一些实施方案中，初始t细胞的特征在于cd62l，cd27，ccr7，cd45ra，cd28和cd127的表达，以及不存在cd57，cd95，cd122，klrg-1或cd45ro的表达。在实施方案中，初始t细胞的特征在于长端粒长度。例如，与初始t细胞相关的表型标志物描述于例如mausm(2014)中，其通过引用并入本文。

如本文所用的“细胞毒性t淋巴细胞”(ctl)是指具有杀伤靶细胞能力的t细胞。在实施方案中，ctl在其细胞表面上表达cd8。不希望受理论束缚，据信cd8+t细胞一旦通过识别靶细胞上的抗原而被激活就变成ctl。例如，当发生以下两个步骤时发生ctl激活：1)靶细胞上的抗原结合的mhc分子和ctl上的t细胞受体之间发生相互作用；2)共刺激信号通过t细胞和靶细胞上的共刺激分子的接合而产生。然后，ctl识别靶细胞上的特异性抗原并例如通过细胞裂解诱导这些靶细胞的破坏。在实施方案中，ctl靶向并杀伤癌细胞和例如用病毒感染或以其他方式受损的细胞。在实施方案中，cd4+t细胞也可以杀死靶细胞，因此，如本文所用的“ctl”也可以指cd4+t细胞。

“肿瘤浸润淋巴细胞”(til)在本文中用于指已经迁移到肿瘤中的淋巴细胞。在实施方案中，til可以是处于成熟或分化的不同阶段的细胞，例如，til可以包括ctl，treg和/或效应记忆t细胞，以及其他类型的淋巴细胞。在实施方案中，til包括癌症抗原特异性的ctl，即其识别特异性癌症抗原。在实施方案中，til具有肿瘤杀伤活性。在实施方案中，与从除肿瘤之外的样品分离的淋巴细胞相比，til可包括细胞的不同的组成或不同的群。

如本文所用的“效应记忆t细胞”是指以快速时间尺度对抗原的存在作出应答的t细胞，例如通过快速产生效应细胞因子。例如，在与抗原接触后，效应记忆t细胞分泌大量炎性细胞因子。在实施方案中，效应记忆t细胞具有以下细胞表面表型：cd62l^low，cd44，tcr，cd3，il-7r(cd127)，il-15r和ccr7^low。

如本文所用，“有效比率”或“有效e∶t比率”是指暴露于picf和/或免疫调节剂后癌症杀伤t细胞和靶癌细胞之间的比率。使用暴露于picf和/或免疫调节剂后的癌症杀伤t细胞(e)的数量和靶癌细胞(t)的数量来计算有效e∶t比率。在其他实施方案中，可以针对不同浓度的picf计算有效e∶t比率，例如，在picf的最大浓度下，在产生激活的或细胞毒性的癌症杀伤t细胞的数量的最大峰值的picf的浓度下，或者在相应剂量反应曲线的ec50浓度下。在实施方案中，有效e∶t比率也可以表示为有效t∶e比率。如本文所用，“基础e∶t比率”定义为效应t细胞的总数(未指定其亚型)与靶细胞的总数之间的比率。因此，基础e∶t比率与“有效e∶t比率”不同，因为基础e∶t比率是指在不存在picf和/或免疫调节剂或暴露之前，t细胞和靶癌细胞的总数之间的比率。

如本文所用的“调节性t细胞”(treg)是指在胸腺中产生的t细胞，其例如通过接触依赖性和非接触依赖性机制介导免疫抑制和致耐受性应答。一些treg是可诱导的treg，其由外周的初始t细胞产生。在实施方案中，treg维持对自身抗原的耐受性并有助于减少自身免疫。在实施方案中，treg抑制和/或下调效应t细胞的增殖和诱导。在实施方案中，treg在细胞表面上表达一种或多种下列标志物：αβt细胞受体(tcr)，cd3，cd4，cd25，ctla4和/或糖皮质激素诱导的tnf受体(gitr)。在实施方案中，treg分泌一种或多种以下分子：il-10，tgfβ和/或il-35。

如本文所用的“克隆”是指衍生自相同祖先细胞的细胞群。在实施方案中，细胞克隆内的细胞共享相同的表型和基因型。

如本文所用的“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如免疫球蛋白链或其片段。抗体分子包括抗体(例如，全长抗体)和抗体片段。例如，全长抗体是天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的免疫球蛋白(ig)分子(例如，igg抗体)。在实施方案中，抗体分子是指免疫球蛋白分子的免疫活性的抗原结合部分，例如抗体片段。抗体片段，例如功能片段，是抗体的一部分，例如fab，fab′，f(ab′)2，f(ab)2，可变片段(fv)，结构域抗体(dab)或单链可变片段(scfv)。功能性抗体片段结合与完整(例如全长)抗体识别的相同的抗原。术语“抗体片段”或“功能片段”还包括由可变区组成的分离片段，例如由重链和轻链的可变区组成的“fv”片段或其中轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scfv蛋白”)。在一些实施方案中，抗体片段不包括没有抗原结合活性的抗体部分，例如fc片段或单个氨基酸残基。示例性抗体分子包括全长抗体和抗体片段，例如dab(结构域抗体)，单链，fab，fab′和f(ab′)2片段，和单链可变片段(scfv)。

在实施方案中，抗体分子是单特异性的，例如，其包含对单个表位的结合特异性。在一些实施方案中，抗体分子是多特异性的，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施方案中，抗体分子是双特异性抗体分子。如本文所用的“双特异性抗体分子”是指对多于一种(例如，两种，三种，四种或更多种)表位和/或抗原具有特异性的抗体分子。双特异性抗体分子可以包括多种形式，并且在本文的双特异性抗体分子部分中有更详细的描述。

如本文所用的“抗原”(ag)是指可以引发免疫应答的分子，例如涉及某些免疫细胞的激活和/或抗体的产生。任何大分子(包括几乎所有蛋白质或肽)都可以是抗原。抗原也可以衍生自基因组重组体或dna。例如，包含编码能够引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna编码“抗原”。在实施方案中，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码，抗原也不需要由基因编码。在实施方案中，抗原可以合成或可以衍生自生物样品，例如组织样品，肿瘤样品，细胞或具有其他生物组分的流体。

抗体分子的“抗原结合位点”或“结合部分”是指参与抗原结合的抗体分子(例如免疫球蛋白(ig)分子)的部分。在实施方案中，抗原结合位点由重链(h)和轻链(l)的可变(v)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的可变区内的三个高度发散的区段(称为高变区)被布置在称为“框架区”(fr)的更保守的侧翼区段之间。fr是天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间并与其相邻的氨基酸序列。在实施方案中，在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此设置以形成抗原结合表面，其与结合的抗原的三维表面互补。每条重链和轻链的三个高变区称为“互补决定区”或“cdr”。框架区和cdr已经在例如kabatea(1991)和chothiac(1987)中定义和描述。每个可变链(例如，可变重链和可变轻链)通常由三个cdr和四个fr构成，以以下氨基酸顺序从氨基端到羧基端排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3和fr4。

如本文所用，“最小残留疾病(mrd)”是指在治疗期间或之后，例如当患者处于缓解期(例如，没有疾病的迹象或症状)时，在患者中剩余的少量细胞群，例如患病细胞，例如癌细胞。在实施方案中，mrd可以是引起患者疾病(例如癌症)复发的细胞来源。可以使用流式细胞术，能够测量患者样品(例如组织样品)中的少量患病细胞的基于蛋白质，dna或rna的测定来检测mrd。

如本文所用的“癌症”可包括所有类型的致癌过程和/或癌性生长。在实施方案中，癌症包括原发肿瘤以及转移性组织或恶性转化的细胞，组织或器官。在实施方案中，癌症包括癌症的所有组织病理学和阶段，例如侵袭性/严重性的阶段。在实施方案中，癌症包括复发和/或抗性癌症。术语“癌症”和“肿瘤”可互换使用。

“样品”或“组织样品”是指从受试者或患者的组织或体液获得的生物样品。组织样品的来源可以是来自新鲜，冷冻和/或保存的器官，组织样品，活组织检查或抽吸物的实体组织；血液或任何血液成分(例如，血清，血浆)；骨髓或任何骨髓成分；体液例如尿液，脑脊液，全血，血浆和血清。样品可包括非细胞级分(例如，尿液，血浆，血清或其他非细胞体液)。在其他实施方案中，从个体获得样品的体液包含血液(例如，全血)。在一个实施方案中，样品是从受试者获得的全血样品，全骨髓样品，全外周血样品或全肿瘤样品。在实施方案中，“全”样品，例如，当涉及全血样品，全骨髓样品或全外周血样品时，是基本上没有组分(例如，细胞)已经从中移除或分离的样品。在一个实施方案中，在用于该方法的其余步骤之前，将样品(例如血液样品)稀释(例如，用生理学上相容的缓冲液或培养基稀释)。在其他实施方案中，“全”样品，例如全组织样品或全肿瘤样品，基本上维持来自原始组织的微环境，例如，基本上维持肿瘤或免疫微环境的结构。在另一个实施方案中，将样品(例如肿瘤样品)加工成较小的片(例如，研磨，切碎，混合，粉碎等)并稀释(例如，用生理学上相容的缓冲液或培养基稀释)。

如本文所用的“细胞表面标记”是指与细胞表面组分(例如细胞表面蛋白，聚糖，细胞膜)相互作用(例如，特异性和/或非特异性)的试剂。在实施方案中，所述试剂包含可检测信号，其用于标记细胞表面或细胞自身。在实施方案中，可检测信号是发射已知波长的荧光的化学分子，例如荧光染料。在一个实施方案中，细胞表面标记是选择性识别一个或多个细胞表面靶标的抗体，其中所述抗体连接(例如化学连接)至荧光团分子，例如，在本文中也称为“经荧光标记的抗体”。在一个实施方案中，细胞表面标记是另一种可以识别一种或多种细胞表面靶标的大分子，例如适体。在另一个实施方案中，细胞表面标记是细胞跟踪染料。在实施方案中，细胞跟踪染料是含有荧光分子(例如荧光染料)的分子，其可以非特异性方式在整个细胞表面膜上分布或扩散。在一个实施方案中，细胞跟踪染料可以是两亲性的，例如，分布到膜-水界面，亲脂的或疏水的，例如，共价连接到位于膜双层中的脂质。

癌症杀伤t细胞的产生

本文提供了产生(例如，制备/提供)具有增强的癌症杀伤活性的免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)(例如，癌症杀伤细胞)的方法。

在实施方案中，该方法包括提供来自受试者的t细胞和癌细胞(例如，对于t细胞和癌细胞的相同受试者或对于t细胞与癌细胞的不同受试者)。

在实施方案中，t细胞和癌细胞以来自受试者的样品的形式提供。样品可以是血液样品，例如全血，外周血或骨髓样品。在其他实施方案中，样品来自实体瘤(例如，从原发肿瘤或转移瘤切除的样品)，淋巴结或脾。

在实施方案中，基本上没有从样品中除去或分离组分(例如细胞)。例如，在用于该方法的其余步骤之前，将样品(例如血液样品)稀释(例如，用生理学上相容的缓冲液或培养基稀释)。在其他实施例中，在用于该方法的其余步骤之前，将样品(例如肿瘤样品)加工成较小的片(例如，研磨，切碎，混合，粉碎等)并稀释(例如，用生理学上相容的缓冲液或培养基稀释)。

在其他实施方案中，t细胞和癌细胞在来自受试者的不同样品中提供。例如，t细胞以血液样品的形式提供，例如全血，外周血或骨髓样品。在其他实施例中，t细胞以肿瘤样品的形式提供(例如，从原发肿瘤或转移瘤切除的样品)，例如，其中t细胞包含肿瘤浸润性t细胞。例如，癌细胞以血液样品的形式提供，例如全血，外周血或骨髓样品，例如，其中癌细胞包含循环肿瘤细胞(ctc)。在其他实例中，癌细胞以来自实体瘤(例如，从原发肿瘤或转移瘤切除的样品)，淋巴结或脾的样品的形式提供。

所述方法还涉及利用t细胞和癌细胞以及邻近免疫辅导因子(picf)形成离体反应混合物。本文描述的任何picf可用于所述方法中。在本文的“邻近免疫辅导因子(picf)”部分中更详细地描述了picf。在实施方案中，离体反应混合物在足以使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物(例如，允许t细胞进行胞啃)的条件下(如持续一段时间)形成。所述方法由此产生癌症杀伤t细胞。

不希望受理论束缚，据信在血液和实体肿瘤中，受试者中可存在受肿瘤细胞影响的不同组织。例如，在实体瘤中，转移瘤可含有与原发肿瘤位点内的肿瘤细胞具有不同特征，例如，表达模式(例如，不同的抗原表达模式)的肿瘤细胞。因此，所述方法可以包括使用picf来激活受试者体内受癌细胞影响的各组织内的癌症特异性ctl。

例如，在实施方案中，本文中描述的方法包括以下步骤：

(a)从患有癌症(例如，血液癌症或实体癌症)的受试者中提供t细胞；

(b)提供例如来自所述受试者的癌细胞；

(c)例如在足以允许t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物的条件下(如，持续一段时间)，形成包含t细胞，癌细胞和邻近免疫辅导因子(picf)的离体反应混合物，由此产生癌症杀伤t细胞；以及

(d)以下中的一个、两个、三个或全部：

i)扩增来自(c)的癌症杀伤t细胞；

ii)选择来自(c)的癌症杀伤t细胞；

iii)富集来自(c)的癌症杀伤t细胞；或

iv)纯化来自(c)的癌症杀伤t细胞，

其中癌细胞来源于来自受试者的原发性实体瘤，来源于来自受试者的转移瘤，和/或是来自受试者的循环肿瘤细胞(ctc)(例如来自血液(例如，全血，骨髓，或外周血))或淋巴样品。

在另一示例中，本文描述的方法包括以下步骤：

(a)提供来自患有癌症(例如，血液癌症或实体癌症)的受试者的样品，其中所述样品包含t细胞和癌细胞；

(b)例如，在足以使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物的条件下(例如，持续一段时间)，使所述样品与邻近免疫辅导因子(picf)接触；

(c)富集已从癌细胞获得细胞表面标志物的癌症杀伤t细胞，

其中所述样品来源于来自受试者的原发性实体瘤，来源于来自受试者的转移瘤，和/或是来自受试者的血液(例如，全血，骨髓，或外周血)或淋巴样品。

在又一个实施例中，本文描述的方法包括以下步骤：

(a)提供来自患有癌症(例如，血液癌症或实体癌症)的受试者的样品，其中所述样品包含癌细胞；

(b)从所述受试者提供样品，例如血液样品(例如外周血样品)，其中所述样品包含t细胞；

(b)例如，在足以使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物的条件下(例如，持续一段时间)，使来自步骤(a)的样品与来自步骤(b)的样品和邻近免疫辅导因子(picf)接触；

(d)富集已从癌细胞获得细胞表面标志物的癌症杀伤t细胞，

其中来自步骤(a)的样品来源于来自受试者的原发性实体瘤，来源于来自受试者的转移瘤，和/或是来自受试者的血液(例如，全血，骨髓，或外周血)或淋巴样品。

在实施方案中，使用来自给定受试者的不同样品重复产生本文所述的癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)的方法，其中每次重复包括使用不同的癌细胞样品，例如原发性实体瘤，转移，血液(例如，全血，骨髓或外周血)或淋巴。

在实施方案中，所述方法还包括汇集使用这些不同癌细胞样品中的每种产生的胞啃t细胞。

不希望受理论束缚，认为这种方法将产生有效对抗可能存在于给定受试者的不同组织中的不同种类癌细胞的胞啃t细胞。不希望受理论束缚，据信这种方法可以有利地杀伤整个受试者体内的癌细胞(例如，在原发肿瘤和转移瘤处，也可能是在血液中循环)，而不是仅杀伤身体内的一个部位处的癌细胞。

另外，不希望受理论束缚，据信ctc(在癌症患者(通常是实体肿瘤癌症患者)的外周血中发现的肿瘤细胞)可能是转移的原因，因此是杀伤的良好靶标。因此，本文描述的方法包括将picf与外周血样品(含有ctc和t细胞)一起离体孵育，从而使ctc与其同源癌症抗原特异性t细胞接近以产生胞啃t细胞。在其他实施方案中，例如，在没有充分富集癌症抗原特异性t细胞的外周血样品中，将来自可能富含癌症抗原特异性t细胞的三维微环境(例如，骨髓，肿瘤，转移)的样品用来代替外周血样品。在这种情况下，例如，所述方法可以包括将picf和分离的ctc与来自受试者的骨髓，肿瘤或转移样品(含有癌症抗原特异性t细胞)一起离体孵育。这种离体混合物使得picf能够使ctc和与ctc上的那些抗原匹配的癌症抗原特异性t细胞空间接近，从而激活适当的t细胞以产生胞啃t细胞。在实施方案中，可以使用受癌症影响的受试者的每种组织重复这种方法，例如，以最大化ctc与适当的癌症抗原特异性t细胞的匹配。

癌症杀伤t细胞的进一步处理

根据本文所述的方法，在实施方案中，可以进一步选择，富集，纯化和/或扩增癌症杀伤t细胞。

在实施方案中，例如从反应混合物中选择例如通过本文所述的方法产生的本文所述的癌症杀伤t细胞。例如，反应混合物含有t细胞，癌细胞和邻近免疫辅导因子(picf)。在实施方案中，本文所述的癌症杀伤t细胞从t细胞和/或picf中纯化出来。在实施方案中，本文所述的癌症杀伤t细胞自反应混合物中的细胞混合物(例如，癌细胞和/或各种类型的t细胞)富集。

在实施方案中，选择步骤，纯化和/或富集步骤包括使用流式细胞术(例如，荧光激活细胞分选(facs))或其他分离方法，例如珠(例如，磁珠)。例如，珠可以用抗体或其片段包被，所述抗体或其片段结合一种或多种癌症抗原和/或一种或多种激活的t细胞(例如ctl)的标志物。以这种方式，与这种珠结合的细胞将是激活的t细胞(例如，ctl)，其表达一种或多种癌症抗原。这些细胞可能是具有增强的癌症杀伤活性的胞啃t细胞。同样，在facs中，可以将表达激活的t细胞(例如ctl)的标志物和癌细胞的标志物两者的细胞(例如，可能的胞啃t细胞)与其他细胞类型分开。阴性或阳性选择方法可用于选择步骤，纯化和/或富集步骤。

在实施方案中，扩增例如通过本文所述方法产生的本文所述的癌症杀伤t细胞，例如以产生一定量的用于施用于受试者的癌症杀伤t细胞。在实施方案中，扩增本文所述的癌症杀伤t细胞的制剂。在实施方案中，在选择，富集或纯化某些t细胞群之前进行扩增。在其他实施方案中，在选择，富集或纯化某些t细胞群之后进行扩增。

扩增细胞(例如，癌症杀伤t细胞)的示例性方法包括通过引用并入本文的us8,034,334，us2012/0244133和montesm(2005)中描述的那些。在实施方案中，癌症杀伤t细胞的扩增包括使例如在制剂中的癌症杀伤t细胞的数量增加，例如至少约2倍(例如，至少约3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，50，100，1000，10⁴，10⁵，10⁶倍或更多)。在实施方案中，扩增进行至少2天，例如，至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或更多天。在一些实施例中，通过在细胞因子如il-2和/或il-15的存在下任选地添加刺激t细胞受体的试剂(例如抗cd3抗体或其片段)培养细胞来扩增细胞。

在实施方案中，选择步骤，纯化步骤和/或扩增步骤包括顺序添加低数量，例如数量不足的癌细胞。本文描述的方法包括孵育癌细胞，t细胞和picf以产生细胞毒性t细胞，可产生细胞毒性t细胞的不同克隆。在实施方案中，通过依次添加低数量，例如，数量不足的癌细胞，可以选择对杀死癌细胞最有效或最有力的细胞毒性t细胞克隆。在一个实施方案中，可添加至包含癌症杀伤t细胞的反应中的低的或不足的数目或数量的癌细胞为激活的t细胞数目的50％或更少，例如30％，10％，1％，0.1％或0.01％或更少。在一个实施方案中，可将低或不足数量的癌细胞加入混合物(例如，包含癌细胞，t细胞和/或picf)至少一次或多次(例如2次，3次，4次，5次，6次，7次，8次，9次或10次)。在一个实施方案中，每6-48小时(例如6小时，12小时，24小时，36小时或48小时)添加低或不足数量的癌细胞。在一个实施方案中，添加的低或不足数量的癌细胞是来自患者的癌细胞。在一个实施方案中，添加的低或不足数量的癌细胞不是来自患者的癌细胞。在一个实施方案中，添加的低或不足数量的癌细胞是来自癌细胞系的癌细胞。

不希望受理论束缚，据信一旦与t细胞和picf的混合物中的癌细胞被消除，例如通过新产生的癌症杀伤t细胞被消除，癌症杀伤t细胞衰竭并数量减少。然而，在不希望受理论束缚的情况下，当向生成的癌症杀伤t细胞中添加低(例如，不足)数量的癌细胞时，癌症杀伤t细胞的亚群将识别并杀伤新添加的癌细胞。通过例如选择性识别和使其tcr结合癌细胞表面中表达的癌症抗原，可以发生对癌细胞的识别；并且对癌症抗原具有最高亲和力或最快kon动力学常数的t细胞克隆可以更强烈地和/或更快地结合新添加的癌细胞，从而导致癌细胞的消除和癌症杀伤t细胞克隆的增殖的激活。由于癌症杀伤t细胞之间的直接竞争，更有效的癌症杀伤t细胞亚群将被激活并将增殖，而不识别新添加的癌细胞的其余癌症杀伤t细胞将继续衰竭和自我消除的过程，从而留下更有效的癌症杀伤t细胞。因此，在不希望受理论束缚的情况下，杀伤新添加的癌细胞的癌症杀伤t细胞的亚群被认为是最好的杀伤剂，例如，最具活性或有效的癌症杀伤t细胞。在实施方案中，不希望受理论束缚，重复此种添加低(例如，不足)数量的癌细胞的过程被认为施加了向最具活性且更有效或有效力的癌症杀伤t细胞优先或选择性地激活和增殖的进化选择压力。因此，顺序添加低(例如，不足)数量的癌细胞可用于选择和富集最具活性和有效的癌症杀伤t细胞克隆。包括顺序添加少量癌细胞的示例性过程描述于图1中。

在实施方案中，选择的，纯化的，富集的和/或扩增的细胞可以形成癌症杀伤t细胞的制剂。

邻近免疫辅导因子(picf)

picf可包括例如双特异性抗体分子或cdr移植的支架。

双特异性抗体分子

在实施方案中，双特异性抗体分子可包含一个以上的抗原结合位点，其中不同位点对不同抗原具有特异性。在实施方案中，双特异性抗体分子可以结合相同抗原上的一个以上(例如，两个或更多个)表位。在实施方案中，双特异性抗体分子包含对靶细胞(例如癌细胞)特异的抗原结合位点和对免疫效应细胞(例如t细胞，例如ctl)特异的不同抗原结合位点。双特异性抗体分子可分为五个不同的结构组：(i)双特异性免疫球蛋白g(bsigg)；(ii)附有另外的抗原结合部分的igg；(iii)双特异性抗体片段；(iv)双特异性融合蛋白；(v)双特异性抗体缀合物。

(i)bsigg是每种抗原的单价形式。示例性bsigg形式包括但不限于crossmab，daf(二合一(two-in-one))，daf(四合一(four-in-one))，dutamab，dt-igg，突出入孔(knobs-in-holes)共有lc，突出入孔组件，电荷对，fab臂交换，seedbody，triomab，luz-y，fcab，κλ-body，正交fab。请参见spiess(2015)图1。示例性的bsigg包括卡妥索单抗(catumaxomab)(freseniusbiotech，trionpharma，neopharm)，其含有抗cd3臂和抗epcam臂；和ertumaxomab(neoviibiotech，freseniusbiotech)，其靶向cd3和her2。在一些实施方案中，bsigg包含经改造以进行异二聚化的重链。例如，可以使用突出入孔策略，seed平台，共有重链(例如，在κx-body中)和使用异二聚体fc区来设计重链以进行异二聚化。参见spiessc(2015)。已经用于避免bsigg中同源二聚体重链配对的策略包括突出入孔，duobody，azymetric，电荷对，ha-tf，seedbody和差异蛋白a亲和。参见如上。bsigg可以通过在不同宿主细胞中单独表达组分抗体并随后纯化/组装成bsigg来产生。bsigg还可以通过在单个宿主细胞中表达组分抗体来产生。可以使用亲和层析纯化bsigg，例如使用蛋白a和顺序ph洗脱。

(ii)附有另外的抗原结合部分的igg是另一种形式的双特异性抗体分子。例如，通过在单特异性igg上(例如在重链或轻链的n或c末端)附加额外的抗原结合单位，可以将单特异性igg改造为具有双特异性。示例性的另外的抗原结合单位包括单结构域抗体(例如，可变重链或可变轻链)，工程化的蛋白质支架和配对的抗体可变结构域(例如，单链可变片段或可变片段)。参见如上。附加的igg形式的实例包括双可变结构域igg(dvd-ig)，igg(h)-scfv，scfv-(h)igg，igg(l)-scfv，scfv-(l)igg，igg(l，h)-fv，igg(h)-v，v(h)-igg，igg(l)-v，v(l)-igg，kihigg-scfab，2scfv-igg，igg-2scfv，scfv4-ig，zybody，和dvi-igg(四合一)。参见spiessc(2015)，图1。igg-scfv的实例是mm-141(merrimackpharmaceuticals)，其结合igf-1r和her3。dvd-ig的实例包括结合il-1α和il-1β的abt-981(abbvie)；和结合tnf和il-17a的abt-122(abbvie)。

(iii)双特异性抗体片段(bsab)是缺少部分或全部抗体恒定结构域的双特异性抗体分子的形式。例如，一些bsab缺乏fc区。在实施方案中，双特异性抗体片段包括通过肽接头连接的重链和轻链区，其允许bsab在单个宿主细胞中有效表达。示例性双特异性抗体片段包括但不限于纳米抗体，纳米抗体-has，bite，diabody，dart，tandab，scdiabody，scdiabody-ch3，diabody-ch3，三体，miniantibody，minibody，tribiminibody，scfv-ch3kih，fab-scfv，scfv-ch-cl-scfv，f(ab')2，f(ab')2-scfv2，scfv-kih，fab-scfv-fc，四价hcab，scdiabody-fc，diabody-fc，串联scfv-fc和intrabody。参见如上。例如，bite形式包含串联scfv，其中组分scfv结合t细胞上的cd3和癌细胞上的表面抗原。示例性的bite包括结合cd3和cd19的博纳吐单抗(blinatumomab)(amgen)；结合cd3和epcam的solitomab(amgen)；结合cd3和cea的medi565(medimmune，amgen)；和结合cd3和psma的bay2010112(bayer，amgen)。示例性dart包括结合cd3和cd123的mgd006(macrogenics)；和结合cd3和gpa33的mgd007(macrogenics)。示例性tandab包括结合cd3和cd19的afm11(affimedtherapeutics)；和结合cd30和cd16a的afm13(affimedtherapeutics)。串联scfv的实例是rm28(universityhospitaloftubingen)，其结合cd28和mapg。示例性的纳米抗体包括结合tnf和hsa的ozoralizumab(ablynx)；结合il-17a/f和hsa的alx-0761(merckserono，ablynx)；结合il-6r和hsa的alx-0061(abbvie，ablynx)；结合rankl和hsa的alx-0141(ablynx，eddingpharm)。可以使用噬菌体展示鉴定/选择bsab的组分片段。在一些实施方案中，picf不包含博纳吐单抗。

(iv)双特异性融合蛋白包括与其他蛋白连接例如以增加额外的特异性和/或功能的抗体片段。双特异性融合蛋白的实例是immtac，其包含与识别hla呈递的肽的亲和力成熟的t细胞受体连接的抗cd3scfv。在实施方案中，对接-锁定(dock-and-lock，dnl)方法可用于产生具有更高价的双特异性抗体分子。此外，与白蛋白结合蛋白或人血清白蛋白的融合可以延长抗体片段的血清半衰期。参见如上。

在实施方案中，化学缀合(例如抗体和/或抗体片段的化学缀合)可用于产生bsab分子。参见如上。示例性双特异性抗体缀合物包括covx-body形式，其中低分子量药物与每个fab臂或抗体或其片段中的单个反应性赖氨酸位点特异性缀合。在实施方案中，缀合改善了低分子量药物的血清半衰期。示例性的covx-body是cvx-241(nct01004822)，其包含与抑制vegf或ang2的两种短肽缀合的抗体。参见如上。

(v)双特异性抗体分子可以通过在宿主系统中重组表达例如至少一种或多种组分来产生。示例性宿主系统包括真核细胞(例如哺乳动物细胞，例如cho细胞，或昆虫细胞，例如sf9或s2细胞)和原核细胞(例如大肠杆菌)。双特异性抗体分子可以通过在不同宿主细胞中单独表达组分并随后纯化/组装来产生。备选地，可以通过在单个宿主细胞中表达组分来产生双特异性抗体分子。双特异性抗体分子的纯化可以通过各种方法进行，例如亲和层析，例如使用蛋白a和顺序ph洗脱。在其他实施方案中，亲和标签可用于纯化，例如含组氨酸的标签，myc标签或链霉抗生物素蛋白标签。

cdr移植的支架(cdr-graftedscaffold)

在实施方案中，picf是cdr-移植的支架结构域。在实施方案中，支架结构域基于纤连蛋白结构域，例如，纤连蛋白iii型结构域。纤连蛋白iii型(fn3)结构域的总折叠与最小功能性抗体片段(抗体重链的可变结构域)的整体折叠密切相关。fn3末尾有三个环；bc，de和fg环的位置大致对应于抗体vh结构域的cdr1，2和3的位置。fn3没有二硫键；因此，与抗体及其片段不同，fn3在还原条件下是稳定的(参见例如wo98/56915；wo01/64942；wo00/34784)。可修饰(例如，使用本文所述的cdr或高变环)或改变fn3结构域，例如以选择结合本文所述的抗原/标志物/细胞的结构域。

在实施方案中，支架结构域(例如折叠结构域)基于抗体，例如通过从单克隆抗体的重链可变结构域缺失三条β链而产生的“minibody”支架(参见，例如，tramontanoa(1994)，martinf(1994))。“minibody”可用于呈现两个高变环。在实施方案中，支架结构域是v-样结构域(参见，例如，wo99/45110)或衍生自tendamistatin的结构域，其是由两个二硫键结合在一起的74残基的六链β折叠夹心(参见，例如，mcconnellsj(1995))。例如，可以对tendamistatin的环进行修饰(例如，使用cdr或高变环)或改变，例如以选择结合本文所述的标志物/抗原/细胞的结构域。另一个示例性支架结构域是衍生自ctla-4胞外结构域的β-夹心结构(参见例如wo00/60070)。

其他示例性支架结构域包括但不限于t细胞受体；mhc蛋白；细胞外结构域(例如，纤连蛋白iii型重复，egf重复)；蛋白酶抑制剂(例如，kunitz结构域，生态素(ecotin)，bpti等)；tpr重复；三叶结构；锌指结构域；dna结合蛋白；特别是单体dna结合蛋白；rna结合蛋白；酶，例如蛋白酶(特别是灭活的蛋白酶)，rnase；伴侣蛋白，例如硫氧还蛋白和热休克蛋白；和细胞内信号传导结构域(如sh2和sh3结构域)。参见，例如，通过引用并入本文的us2004/0009530和us7,501,121。

在实施方案中，例如通过以下标准中的一个或多个评估和选择支架结构域：(1)氨基酸序列，(2)若干个同源结构域的序列，(3)三维结构，和/或(4)ph，温度，盐度，有机溶剂，氧化剂浓度范围内的稳定性数据。在实施方案中，支架结构域是小的稳定的蛋白质结构域，例如小于100个氨基酸(例如，100，70，50，40或30个氨基酸)的蛋白质。结构域可包括一个或多个二硫键或可以螯合金属，例如锌。

增强t细胞活性的其他组合物和方法

根据本文所述的组合物和方法，在实施方案中，除了picf之外，还可以使用其他免疫调节剂以增强t细胞活性，例如，胞啃作用。这些免疫调节剂包括但不限于免疫检查点抑制剂，t细胞激动剂和其他免疫调节药物。

备选地，可以使用其他用于增强t细胞活性(例如，胞啃作用)的试剂(例如，使用免疫调节剂，例如免疫检查点抑制剂，t细胞的激动剂和其他免疫调节药物)代替picf。

免疫检查点抑制剂

在实施方案中，本文描述的方法包括例如在与癌细胞和免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)的反应混合物中例如除了picf之外还使用或代替picf使用免疫检查点抑制剂。在实施方案中，本文所述的方法包括使癌细胞和免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)与免疫检查点抑制剂接触。所述方法也可用于体内治疗方案。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂抑制检查点分子。在某些情况下，检查点分子会降低表达car的细胞产生免疫效应子应答的能力。示例性检查点分子包括但不限于ctla4，pd1，pd-l1，pd-l2，tim3，lag3，cd160，2b4，cd80，cd86，b7-h3(cd276)，b7-h4(vtcn1)，hvem(tnfrsf14或cd270)，btla，kir，i类mhc，ii类mhc，gal9，vista，btla，tigit，lair1和a2ar。参见，例如，pardolldm(2012)，其通过引用并入本文。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂是pd-1抑制剂，例如抗pd-1抗体，如纳武单抗(nivolumab)，帕姆单抗(pembrolizumab)或pidilizumab。纳武单抗(也称为mdx-1106，mdx-1106-04，ono-4538或bms-936558)是完全人igg4单克隆抗体，其特异性抑制pd1。参见，例如，us8,008,449和wo2006/121168。帕姆单抗(也称为lambrolizumab，mk-3475，mk03475，sch-900475或keytruda；merck)是与pd-1结合的人源化igg4单克隆抗体。参见，例如，hamido(2013)，us8,354,509和wo2009/114335。pidilizumab(也称为ct-011或curetech)是与pd1结合的人源化igg1k单克隆抗体。参见，例如，wo2009/101611。在一个实施方案中，pd-1的抑制剂是具有与其基本相同或相似的序列的抗体分子，例如，与纳武单抗，帕姆单抗或pidilizumab的序列具有至少85％，90％，95％或更高同一性的序列。另外的抗-pd1抗体，例如amp514(amplimmune)，描述于例如us8,609,089，us2010/028330和/或us2012/0114649中。

在一些实施方案中，pd-1抑制剂是免疫粘附素，例如，包含与恒定区(例如，免疫球蛋白的fc区)融合的pd-1配体(例如，pd-l1或pd-l2)的胞外/pd-1结合部分的免疫粘附素。在实施方案中，pd-1抑制剂是amp-224(b7-dcig，例如，描述于wo2011/066342和wo2010/027827中)，阻断b7-h1和pd-1之间的相互作用的pd-l2fc融合可溶性受体。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂是pd-l1抑制剂，例如抗体分子。在一些实施方案中，pd-l1抑制剂是yw243.55.s70，mpdl3280a，medi-4736，msb-0010718c或mdx-1105。在一些实施方案中，抗pd-l1抗体是msb0010718c(也称为a09-246-2；merckserono)，其是结合pd-l1的单克隆抗体。示例性人源化抗pd-l1抗体描述于例如wo2013/079174。在一个实施方案中，pd-l1抑制剂是抗pd-l1抗体，例如yw243.55.s70。yw243.55.s70抗体描述于例如wo2010/077634。在一个实施方案中，pd-l1抑制剂是mdx-1105(也称为bms-936559)，其描述于例如wo2007/005874。在一个实施方案中，pd-l1抑制剂是mdpl3280a(genentech/roche)，其是针对pd-l1的人fc优化的igg1单克隆抗体。参见，例如，us7,943,743和us2012/0039906。在一个实施方案中，pd-l1的抑制剂是具有与其基本相同或相似的序列的抗体分子，例如，与yw243.55.s70，mpdl3280a，medi-4736，msb-0010718c或mdx-1105的序列具有至少85％，90％，95％或更高同一性的序列)。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂是pd-l2抑制剂，例如amp-224(其是阻断pd1和b7-h1之间相互作用的pd-l2fc融合可溶性受体)。参见，例如，wo2010/027827和wo2011/066342。

在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是lag-3抑制剂，例如抗lag-3抗体分子。在实施方案中，抗lag-3抗体是bms-986016(也称为bms986016；bristol-myerssquibb)。bms-986016和其他人源化抗lag-3抗体描述于例如us201i/0150892，wo2010/019570和wo2014/008218。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂是tim-3抑制剂，例如抗tim3抗体分子，例如描述于us8,552,156，wo2011/155607，ep2581113和us2014/044728。

在实施方案中，免疫检查点抑制剂是ctla-4抑制剂，例如抗ctla-4抗体分子。示例性的抗ctla4抗体包括tremelimumab(来自pfizer的igg2单克隆抗体，以前称为ticilimumab，cp-675,206)；和伊匹单抗(也称为mdx-010，cas号477202-00-9)。其他示例性抗ctla-4抗体描述于例如us5,811,097。

t细胞的激动剂(例如，激动性抗体)

在实施方案中，本文描述的组合物和方法包括例如在与癌细胞和免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)的反应混合物中例如除了picf之外还使用或代替picf使用t细胞的激动剂(例如激动性抗体)。在实施方案中，本文所述的方法包括使癌细胞和免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)与t细胞的激动剂(例如，激动性抗体)接触。

在实施方案中，t细胞的激动剂是激动性抗体或其片段或共刺激分子的激活剂/激动剂。在实施方案中，t细胞的激动剂包含或是共刺激分子。共刺激分子是淋巴细胞(例如t细胞)对抗原的有效应答所需的细胞表面分子。在实施方案中，共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的分子。不希望受理论束缚，共刺激被认为增强t细胞的扩增，存活和效应子功能(例如，增强t细胞持久性和/或抗癌活性)。参见，例如，songdj(2012)。示例性共刺激分子包括但不限于cd28，icos(cd278)，btla，light，hvem(lightr)，cd160(by55)，ox40，cd27，cd2，cd7，cd40，cd30，4-1bb(cd137)，icam-1，b7-1，toll样受体，lfa-1(cd1la/cd18)，gitr，baffr，b7-h3，信号传导淋巴细胞活化分子(slam蛋白)，slamf7，slam(slamf1，cd150，ipo-3)，slamf4(cd244，2b4)，整合素，il2rβ，itga4，i类mhc分子，tnf受体，cd49d，cd49f，lfa-1，cd29，cd18，tnfr2，cd84，rankl，cd229，cd69，cd100(sema4d)，和slamf6(ntb-a，ly108)。

在一些实施方案中，t细胞的激动剂是cd137，gitr或cd40的激动性抗体或其片段。

示例性的激动性抗体描述于例如scottam(2012)中，其通过引用并入本文。

其他免疫调节药物

在实施方案中，本文所述的组合物和方法例如在与癌细胞和免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)的反应混合物中除了picf之外还包含或代替picf包含免疫调节药物，例如来那度胺。在实施方案中，本文所述的方法包括使癌细胞和免疫效应细胞(例如，t细胞，例如ctl)与t细胞的激动剂(例如，激动性抗体)接触。

在一些实施方案中，icf是免疫调节药物，如来那度胺。

在一个实施方案中，免疫调节剂是mdsc和/或treg细胞的抑制剂。不希望受理论束缚，mdsc和调节性t(treg)细胞是免疫抑制性肿瘤微环境的重要组分。实验证据表明，mdsc可以调节treg细胞的发育和诱导。例如，mdsc可以以各种方式抑制t细胞效应子功能。有若干个因素可以调节mdsc亚群中精氨酸，nadph氧化酶和nos的表达水平，最终影响微环境，包括1-精氨酸的消耗，rns和ros的释放(onoo-和h2o2分别是最普遍的分子)或无控制的高no水平生产。此外，1-半胱氨酸可被mdsc隔离。所有这些分子都影响抗原刺激后控制t细胞增殖的细胞内信号传导途径。mdsc介导的免疫抑制还可以与treg细胞群的扩增，t细胞增殖的抑制和t细胞凋亡的促进相关。

在一个实施方案中，免疫调节剂是来那度胺(lenalidomide)。

在其他实施方案中，免疫调节剂激活对肿瘤特异性抗原的免疫应答，例如，它是疫苗(例如针对靶标如gp100，muc1或magea3的疫苗)。

在其他实施方案中，免疫调节剂是细胞因子，例如选自gm-csf，il-7，il-12，il-15，il-18或il-21中的一种或多种的重组细胞因子。

在其他实施方案中，免疫调节剂是自体t细胞，例如靶向肿瘤的细胞外和细胞内肿瘤特异性抗原(例如，cart细胞或tcrt细胞)。

在其他实施方案中，免疫调节剂是与氨基酸分解代谢，肿瘤来源的细胞外atp的信号传导，腺苷信号传导，腺苷产生，趋化因子和趋化因子受体，外来生物的识别或激酶信号传导活性相关的组分(例如，酶或受体)的调节剂。示例性试剂包括ido，cox2，arg1，arg2，inos或磷酸二酯酶(例如pde5)的抑制剂(例如，小分子抑制剂)；tlr激动剂或趋化因子拮抗剂。示例性ido抑制剂包括incb24360，1-甲基色氨酸抑制剂和nlg919。示例性arg1/arg2抑制剂包括化合物9，ncx-4016和at38。示例性pde5抑制剂包括他达拉非(tadalafil)。调节肿瘤细胞外atp的示例性试剂包括p2x7的激动剂或拮抗剂，和p2y11的拮抗剂。调节腺苷信号传导的示例性试剂包括a2a受体的拮抗剂(例如，sch58261和sch420814)和a2b受体的拮抗剂(例如psb1115)。趋化因子和趋化因子受体如cxcr1，cxcr2，cxcr4，ccr2和ccr5的调节剂包括但不限于cxcr2特异性抗体，普乐沙福(plerixafor)，pf-4136309和马拉韦罗(maraviroc)。tlr的调节剂如tlr4(例如，om-174，tlr4激动剂)，tlr7(例如，咪喹莫特(imiquimod)，852a，tlr7/8激动剂)，tlr8(例如，vtx-2337，tlr8激动剂)和tlr9(例如，imo-2055，tlr9激动剂)。示例性激酶抑制剂包括但不限于alk，braf，ron，csf1，pi3k-δ和pi3k-γ的抑制剂。

免疫调节剂的其他实例进一步描述于例如，adamsjl(2015)和serafinip(2008)中，其通过引用并入本文。

癌症杀伤t细胞的评估

根据本文所述的方法，在实施方案中，可以多种方式表征或评估癌症杀伤t细胞(例如，癌症杀伤t细胞的制剂，例如选择的，纯化的，富集的和/或扩增的细胞)。

例如，可以例如利用抗体(例如单克隆抗体)的组针对各种癌细胞和/或效应t细胞标志物的表达来表征癌症杀伤性t细胞。在实施方案中，细胞的特征在于表达标志物(例如pd-1和tim-3)以及其他免疫检查点分子(例如，本文所述的免疫检查点分子)。在实施方案中，pd-1和/或tim-3在细胞上的表达的存在可以表明癌症杀伤t细胞更具肿瘤免疫反应性。

在实施方案中，可以例如体外或离体地评估癌症杀伤t细胞对癌细胞的反应性。不希望受理论束缚，据信对癌细胞的例如体外或离体反应性是癌症杀伤t细胞在体内杀死癌细胞的有效性的量度。在实施方案中，可以通过使癌症杀伤性t细胞与癌细胞(例如癌症来源的细胞系或原发性癌症样品)接触来评估对癌细胞的反应性。

在实施方案中，原发性癌症样品包括从受试者的血液恶性肿瘤中分离的细胞，例如从患有血液恶性肿瘤的受试者的血液样品(例如，外周血或骨髓)中分离的细胞。例如，通过例如以预定的t细胞：癌细胞比率共培养使癌症杀伤t细胞和癌细胞接触。示例性t细胞：癌细胞比率包括约1∶4至1∶100(例如，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50，1∶75，1∶100，或更高)。在实施方案中，可以在共培养后1-36小时(例如，1-36小时，1-6小时，6-12小时，12-24小时或24-36小时)评估反应性。可以通过量化细胞释放的干扰素-γ的量和/或表达4-1bb的t细胞的百分比来评估反应性。在实施方案中，与对照水平相比，更高水平的干扰素-γ和/或4-1bb表明癌症杀伤t细胞对癌细胞具有反应性。备选地，可评估特定肿瘤谱系的标志物，包括但不限于cd107a，颗粒酶b，穿孔素和其他特异性谱系肿瘤标志物。

在其他实施方案中，通过在与癌症杀伤t细胞共培养之前首先用标志物(例如，放射性标志物，例如⁵¹cr，荧光标志物或其他分子)标记癌细胞来评估反应性。在经标记的癌细胞与癌症杀伤t细胞共培养后，释放到培养基中的标志物的量(例如，癌细胞裂解程度的指标)是癌细胞死亡程度的量度。放射性标志物(例如⁵¹cr)的量可以通过使用任何方法来量化以检测和量化放射性。荧光标志物的量可以使用任何方法来量化以检测和量化荧光。标志物(例如荧光标志物或其他分子)的量也可以使用基于抗体的测定法(例如elisa)量化。在实施方案中，与对照水平相比，来自癌细胞的更高水平的释放标志物表明癌症杀伤t细胞对癌细胞具有反应性。

在实施方案中，对照水平可以是干扰素-γ和/或4-1bb的水平，和/或在没有癌症杀伤t细胞的情况下，在没有癌细胞的情况下或者在没有经标记的癌细胞的情况下在类似测定中产生的标志物的水平。

此外，本文提供了使用细胞表面标记测量癌症杀伤t细胞的胞啃作用的方法。测量癌症杀伤t细胞的胞啃作用可用于通过本文所述的任何方法产生的癌症杀伤t细胞的选择，表征和评估。用于测量胞啃作用的测定也可用于筛选测定。

在实施方案中，通过以下评估胞啃作用：1)使癌细胞与细胞表面标记(例如经荧光标记的抗体或其片段，或细胞跟踪染料)接触，从而标记癌细胞；2)使t细胞与经标记的癌细胞接触；3)通过测定结合来自癌细胞的细胞表面标记的t细胞来测量胞啃作用。在一个实施方案中，细胞表面标记是经荧光标记的抗体或其片段，其特异性结合靶抗原，例如癌细胞表面标志物。在一个实施方案中，细胞表面标记是细胞跟踪染料，其在细胞膜内非特异性地扩散和/或分布。

经荧光标记的抗体和细胞跟踪染料之间的区别显示在图2中：经荧光标记的抗体结合细胞表面中表达的特定抗原，例如细胞表面标志物，而细胞跟踪染料分布在整个细胞膜中，更不用说选择性，基本上非特异性标记细胞的所有表面膜。

在实施方案中，当发生胞啃作用时，在t细胞将其毒性因子插入癌症之前，在细胞之间产生的免疫突触中，癌症杀伤t细胞和靶癌细胞之间细胞膜表面广泛接触。图3是描绘该过程的图片，其中t细胞延伸其像章鱼般触须捕获癌细胞。这种接触涉及跨两细胞的膜区块的各自细胞膜的深度重叠。在胞啃作用中，t细胞摄取这些膜区块中的一些，以及存在于这些膜区块中的任何细胞表面标记，例如经荧光标记的抗体或细胞跟踪染料。

胞啃过程在图4中示意性地描绘：上图显示用识别(例如，结合)癌细胞上的特定细胞表面标志物的经荧光标记的抗体进行标记，下图显示用细胞跟踪染料对癌细胞膜进行非特异性标记。因为免疫突触发生(图中心)，在细胞分离后，细胞毒性t细胞最终会在其自身的膜表面具有癌细胞表面膜的区块，这些区块形成免疫突触的一部分。

使用经荧光标记的抗体的优点包括鉴定和跟踪已经结合来自癌细胞的特定细胞表面标志物的胞啃t细胞。然而，不希望受理论束缚，在一些实施方案中，使用经荧光标记的抗体可能不能检测到胞啃作用。在实施方案中，在t细胞中摄取的癌细胞荧光抗体的数量可以取决于它们在免疫突触的膜区块上的相对数量。例如，在一些实施方案中，靶细胞上的细胞表面标志物的密度或数量太低而不能检测可能发生的任何胞啃作用，例如，在待检测的胞啃事件后，没有足够的针对可检测信号识别靶标的经标记的抗体或者没有足够的结合到t细胞中的经标记的抗体。在另一个实例中，在实施方案中，与抗体连接的荧光染料不发射足够的可检测信号，因此在小部分经标记的抗体靶标被癌症杀伤t细胞摄取的胞啃事件中不能被检测到。在另一个实例中，在实施方案中，与细胞表面标志物结合的经荧光标记的抗体可以变得内化，这可以导致荧光信号显著降低至检测限以下。

细胞跟踪染料包括亲脂性或两亲性荧光染料，其不留在水性介质中，而是分布在整个细胞的疏水性表面膜。因此，与经荧光标记的抗体相反，在使用细胞跟踪染料的实施方案中，由t细胞摄取的癌细胞的任何膜区块将携带荧光分子并且可以是可检测的。在使用高剂量细胞跟踪染料的实施方案中，通过胞啃作用结合到t细胞的细胞膜中的荧光分子的数量可以比针对特定癌细胞靶标的经荧光标记的抗体的数量更高，例如，显著更高。

由于在标记细胞膜中细胞跟踪染料的非特异性，在含有癌细胞和t细胞的样品中使用细胞跟踪染料(例如，在本文中使用的全样品中)可以引起癌细胞和t细胞两者的标记，因此可能阻碍胞啃事件的准确测量。因此，在这样的实施方案中，细胞追踪染料仅在癌细胞中选择性地加入，例如在不存在t细胞或癌症杀伤t细胞的情况下添加至癌细胞。在使用细胞跟踪染料并且样品含有癌细胞和t细胞两者的实施方案中，细胞跟踪染料不直接添加到样品中。在此类实施方案中，在本文所述的条件下提供癌细胞，t细胞和picf以产生癌症杀伤t细胞。在实施方案中，可以将picf从癌细胞和t细胞(例如癌症杀伤t细胞)洗去。在一个实施方案中，在产生的癌症杀伤t细胞杀死所有或几乎所有癌细胞后，可以将经标记的癌细胞或经标记的癌细胞群添加到新产生的癌症杀伤t细胞中。在实施方案中，经标记的癌细胞或经标记的癌细胞群可以是来自患者的癌细胞(例如，直接来自患者或来自冷冻保存和解冻的样品)或来自已经用细胞跟踪染料标记的癌细胞系的癌细胞。在实施方案中，不希望受理论束缚，添加经标记的癌细胞和产生的癌症杀伤t细胞可以重新激活癌症杀伤t细胞并且可以诱导增殖，因此，可以通过检测细胞跟踪染料发射的信号来测量胞啃作用。该示例性过程在图5中示出。

此外，本文提供了针对特定患者选择最有效的癌症杀伤t细胞例如胞啃t细胞的方法。

在实施方案中，本文所述的方法包括评估癌症杀伤t细胞或其制剂的体内有效性(例如作为过继细胞疗法)。在实施方案中，所述方法包括确定以下参数中的一个或多个：增加的癌细胞杀伤活性，降低的毒性，降低的脱靶效应，增加的存活力或增加的增殖。不希望受理论束缚，据信具有增加的癌细胞杀伤活性，降低的毒性，降低的脱靶效应，增加的存活力和/或增加的增殖的癌症杀伤t细胞(或其制剂)更可能在体内有效(例如，作为过继细胞疗法)。

毒性降低的癌症杀伤t细胞或其制剂是杀伤显著更少的非病理细胞的细胞，即其更有选择性地杀伤。与参照相比时，这可以通过标记非病理细胞并且显示更多选择性癌细胞杀伤来测量，其中所述参考可以是针对相同癌症类型的不同患者样品，或者是同一患者样品(例如胞啃)内的不同细胞亚群(例如克隆)。

在细胞疗法中观察到的最常见的毒性称为细胞因子风暴，也称为细胞因子级联和高细胞因子血症。当在通过细胞裂解杀伤癌细胞的过程中杀伤癌细胞释放的细胞因子释放到细胞外导致各种细胞因子水平高度升高时，会产生潜在致命的免疫反应。在实施方案中，癌症杀伤t细胞或其制剂包含毒性降低的细胞，因为其在上清液和/或细胞内产生较少的细胞因子。在实施方案中，癌症杀伤t细胞或其制剂包含同时具有更高的癌症杀伤活性和降低的毒性的细胞，因为其在上清液和/或细胞内每单位癌细胞杀伤中产生更少的细胞因子，即通过定量估计癌细胞杀伤活性(如有效e∶t比率，ec50，emax，动力学或这些因子的组合)来标准化释放的细胞因子的类型和/或水平。

在实施方案中，本文所述的方法还包括测定癌症杀伤t细胞(例如，选择的，富集的，纯化的和/或扩增的)癌症杀伤t细胞或其制剂的癌症杀伤活性。癌症杀伤活性可以通过诸如包括以下的方法来测定：

(a)在足以使癌症杀伤t细胞杀伤靶细胞的条件下(例如，持续一段时间)，使癌症杀伤t细胞(或其制剂)与来源于癌症的靶细胞接触；和

(b)在步骤(a)之后测定靶细胞的数量。

在实施方案中，与接触步骤之前的靶细胞数量相比，接触步骤之后的靶细胞数量的减少表明癌症杀伤t细胞有效杀伤癌细胞。

在实施方案中，针对来自与分离t细胞的患者相同的患者的癌细胞测试癌症杀伤t细胞的活性。在另一个实施方案中，针对来自不同患者(即，分离t细胞的患者之外的患者)的癌细胞测试癌症杀伤t细胞的活性，例如，所述不同患者具有与分离t细胞的患者相同类型的癌症。在实施方案中，针对源自与分离t细胞的患者相同类型的癌症的细胞系测试癌症杀伤t细胞的活性。

在实施方案中，所述方法可以进一步包括在步骤(a)之后确定癌症杀伤t细胞的数量。在实施方案中，例如与接触步骤之前的癌症杀伤t细胞的数量相比，癌症杀伤t细胞的数量的增加表明癌症杀伤t细胞具有增加的活力和/或增殖，并且可以更有效地杀伤癌细胞。

在实施方案中，评估和/或确定步骤可在本文所述的选择，富集，纯化或扩增步骤之前和/或之后进行。在实施方案中，扩增被确定为更有可能体内有效的癌症杀伤t细胞(或其制剂)。在实施方案中，通过使癌症杀伤t细胞与癌细胞(例如癌症来源的细胞系或原发性癌症样品)接触，可以实现癌症杀伤t细胞的额外扩增。在一个实施方案中，将低数量或不足数量的癌细胞添加至如本文所述的癌症杀伤t细胞。在一个实施方案中，将癌细胞加入癌症杀伤t细胞一次或多次，例如数次，例如顺序加入。在一个实施方案中，当在该接触步骤中使用的全部或部分癌细胞被消除(例如杀死)时，进行癌细胞(例如，少量癌细胞)的每次添加。在实施方案中，不希望受理论束缚，癌细胞的每次添加诱导癌症杀伤t细胞的进一步扩增和/或特定癌症杀伤t细胞克隆的选择性扩增。

在一些实施方案中，通过例如本文所述的方法产生的本文所述的癌症杀伤t细胞(或其制剂)含有一个以上的t细胞克隆。在实施方案中，一些克隆可比其他克隆具有更高的癌症杀伤活性。

在实施方案中，选择含有最大活性(例如，在杀伤癌细胞方面)的癌症杀伤t细胞的克隆。在实施方案中，可以通过使用有限稀释或流式细胞术方法分离克隆，例如，以将单个细胞彼此分离，例如，铺板到单独的孔中。在实施方案中，扩增单个细胞以产生每个克隆的群体。例如通过测定癌症杀伤活性和任选的本文所述的其他参数，可评估每个克隆体内有效的可能性。在实施方案中，进一步扩增和/或储存那些表现出最高癌症杀伤活性的克隆。在实施方案中，通过例如在每次存在的癌细胞被消除后添加例如来自相同患者或癌细胞系的低(例如，不足)数量的癌细胞来选择最具活性的癌症杀伤t细胞克隆。在实施方案中，最具活性的t细胞克隆是在最先识别例如结合并消除若干癌细胞的t细胞中，由此优先诱导最具活性的t细胞克隆的增殖。因此，不希望受理论束缚，据信上述方法随着时间的推移富集t细胞池中最具活性的癌症杀伤t细胞。任选地，将表现出高癌症杀伤活性的多个克隆合并在一起，并且例如进一步扩增和/或储存。

在实施方案中，本文所述的癌症杀伤t细胞(或其制剂)含有t细胞的单个克隆。

在实施方案中，根据goodmanufacturingpractice(gmp)制备本文所述的癌症杀伤t细胞。例如，本文所述的例如用于产生癌症杀伤t细胞的离体反应混合物根据goodmanufacturingpractice(gmp))制备。在实施方案中，使用嵌入gmp系统或设施中的自动化流式细胞术平台制备癌症杀伤t细胞。在实施方案中，离体反应混合物中使用的t细胞，癌细胞或两者均获自医院或医疗保健提供者。在实施方案中，癌症杀伤t细胞的扩增，选择，纯化和/或富集根据goodmanufacturingpractice(gmp)进行。在实施方案中，本文描述的方法还包括将癌症杀伤t细胞(例如，由gmp产生)发送至医院或医疗保健提供者。

癌症杀伤t细胞和受试者应答性的评估

本文提供了评估受试者产生癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)的潜力的方法。此外，本文提供了评估受试者对杀死癌细胞的应答的方法。

在实施方案中，所述方法包括(a)提供来自患有癌症的受试者的t细胞；(b)提供来自所述受试者的癌细胞；以及(c)形成包含t细胞，癌细胞和picf的离体反应混合物，例如其中在足以使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物例如足以允许产生针对癌细胞具有细胞毒性活性的胞啃t细胞的条件下(例如，持续一段时间)，形成所述离体反应混合物。

在实施方案中，使用离体/体外测定来测定候选picf和/或免疫调节剂和产生的t细胞的活性以测量剂量应答曲线，其数学拟合使得定量参数(其选自ec50，有效e∶t比率，emax或动力学中的至少一个)能够估计活性。这些参数可用于评估癌症杀伤t细胞和个体受试者的应答。

-t细胞增殖的ec50确定在样品中产生50％的激活的癌症杀伤t细胞的picf的浓度。t细胞激活的ec50类似于癌细胞消耗的ec50。

-有效e∶t比率表示产生的癌症杀伤t细胞(有效t细胞)对癌细胞(靶细胞)的活性。高的有效e∶t比率预测对作为自体细胞疗法的癌症杀伤t细胞敏感的患者，并且低的有效e∶t比率预测对作为自体细胞疗法的癌症杀伤t细胞抗性的患者。

-癌细胞的剂量应答曲线的emax确定在给定的孵育时间下在高剂量的picf下存活的癌细胞的百分比(％)。更长时间的孵育允许癌症杀伤t细胞杀伤更多的癌细胞。激活的癌症杀伤t细胞需要杀死100％的癌细胞，这样的t细胞对于患者来说才是合适的单一疗法治疗。当杀死癌细胞显著低于100％时，并且在较长的孵育时间没有改善，那些存活的癌细胞具有抗性并且可以在临床上提供信息以确定治疗。为了恢复抗性表型，添加额外的免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂)可以克服这种免疫抑制并因此克服这种抗性。

癌症杀伤t细胞活性的时间依赖性动力学。对于相同的picf，t细胞激活和癌细胞消耗的效率在每个受试者中是不同的。能够更快地杀死癌细胞的癌症杀伤t细胞可能在细胞疗法中更有效。更快的活性与对患者癌细胞的更快作用相关，这是反映更高的敏感性的积极结果。当癌症杀伤t细胞是通过mhc-i机制识别癌细胞的cd8+肿瘤特异性抗原t细胞时，更快的活性意味着对癌细胞的更高亲和力。

在实施方案中，所述方法还包括鉴定反应混合物中的胞啃t细胞。在实施方案中，所述方法还包括量化反应混合物中的胞啃t细胞。鉴定和/或量化可涉及鉴定表达来自癌细胞的一种或多种标志物的细胞。另外或备选地，鉴定和/或量化涉及鉴定表达ctl(例如效应记忆ctl)的一种或多种标志物的细胞。可以使用经标记的抗体分子(例如，经荧光标记的或放射性标记的抗体分子)进行ctl标志物的鉴定和/或量化。在实施方案中，还可以使用细胞表面标记(例如分布在靶细胞膜中或遍及靶细胞膜的荧光细胞跟踪染料)进行胞啃标志物的鉴定和/或量化。在此类实施方案中，将细胞表面标记(例如细胞跟踪染料)添加至癌细胞但不添加至用于产生胞啃t细胞的反应(例如，包含癌细胞，t细胞和picf的反应)中的癌症杀伤t细胞。在一些实例中，流式细胞术可用于鉴定(和任选地量化)反应混合物中的细胞上的标志物的表达。在实施方案中，流式细胞术可用于量化具有特定表达模式(例如指示癌症杀伤t细胞(例如，胞啃性t细胞)的表达模式)的细胞的数量。在实施方案中，使用来自受试者的组分(例如，t细胞和癌细胞)产生的更多数量(例如，与参考水平相比)的胞啃t细胞表明受试者能够产生癌症杀伤t细胞，例如，胞啃t细胞。在实施方案中，使用来自受试者的组分(例如，t细胞和癌细胞)产生的更多数量(例如，与参考水平相比)的胞啃t细胞表明受试者对包含癌症杀伤t细胞的疗法(例如作为过继细胞疗法)有应答。在实施方案中，参考水平可以是在不存在t细胞，癌细胞或picf中的一种或多种的情况下在类似的反应混合物中产生的癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)的数量。例如，参考水平可以是在不存在picf的情况下在类似的反应混合物中产生的癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)的数量。在其他实施方案中，参考水平是在一段不足以使t细胞获得来自癌细胞的细胞表面标志物的时间后在离体反应混合物中产生的癌症杀伤t细胞(例如，胞啃t细胞)的数量。

在实施方案中，导致癌细胞死亡的癌症杀伤t细胞与靶细胞(例如癌细胞)的比率可以是受试者对癌症杀伤t细胞的应答性的指标。不希望受理论束缚，据信更高的靶细胞∶癌症杀伤t细胞比率可以指示更多的(例如，使用本文描述的方法)产生的激活的(例如，胞啃)t细胞，并且可以反过来指示受试者是对癌症杀伤t细胞的更好应答者(并且可能是用于产生癌症杀伤t细胞的picf的更好应答者)。

药物组合物和治疗方法

本文公开的药物组合物可包含癌症杀伤t细胞(其包括激活的肿瘤抗原特异性t细胞，包括但不限于本文所述的效应记忆t细胞，细胞毒性t淋巴细胞(ctl)，辅助t细胞，肿瘤浸润性淋巴细胞(til)和胞啃t细胞或其制剂)与一种或多种生理学或药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。例如，药物组合物可包含缓冲液(例如，中性缓冲盐水，磷酸盐缓冲盐水；多肽/氨基酸(例如甘氨酸)；抗凝血剂(例如肝素)；蛋白质；抗氧化剂；碳水化合物(例如葡萄糖，甘露糖，蔗糖或葡聚糖，甘露醇)；佐剂(例如氢氧化铝)；螯合剂(例如edta或谷胱甘肽)；和/或防腐剂。在实施方案中，药物组合物基本上不含污染物，例如支原体，内毒素，慢病毒或其组分，磁珠，细菌，真菌，牛血清白蛋白，牛血清和/或质粒或载体组分。在实施方案中，药物组合物包含根据goodmanufacturingpractice(gmp)制备的癌症杀伤t细胞。

在实施方案中，药物组合物是纯化的制剂。例如，药物组合物基本上不含污染物，例如，没有可检测水平的污染物。在实施方案中，所述污染物包括内毒素，支原体，p24，vsv-g核酸，hivgag，有复制能力的慢病毒(rcl)，残留picf，抗体，牛血清白蛋白，牛血清，汇集的人血清，培养基组分，载体包装细胞或质粒组分，细菌或真菌。在一个实施方案中，所述细菌是选自由以下组成的组中的至少一种：粪产碱杆菌(alcaligenesfaecalis)，白色念珠菌(candidaalbicans)，大肠杆菌(escherichiacoli)，流感嗜血杆菌(haemophilusinfluenza)，脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitides)，绿脓杆菌(pseudomonasaeruginosa)，金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)，肺炎链球菌(streptococcuspneumonia)和酿脓链球菌组a(streptococcuspyogenesgroupa)。

在某些实施方案中，药物组合物包含可检测(例如，痕量)量的picf，例如本文所述的picf。在实施方案中，picf以按重量计小于10％的浓度存在，例如按重量计小于10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.05％，0.01％或更低(例如，但按重量计不低于0.0001％)。

在某些实施方案中，药物组合物包含可检测(例如，痕量)量的细胞表面标记，例如荧光细胞表面标记，例如本文所述的抗体细胞表面标记或细胞跟踪染料。在实施方案中，细胞表面标记，例如荧光细胞表面标记，以按重量计小于10％的浓度存在，例如按重量计小于10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.05％，0.01％或更低(例如，但按重量计不低于0.0001％)。

在实施方案中，药物组合物包含使用本文描述的方法制备的癌症杀伤t细胞(或其制剂)。

本文描述的方法包括通过使用本文所述的癌症杀伤t细胞(或其制剂)，例如使用本文所述的药物组合物治疗受试者中的癌症。还提供了用于减轻或改善受试者中癌症症状的方法，以及用于抑制癌症生长和/或杀死一种或多种癌细胞的方法。在实施方案中，本文所述的方法在施用本文所述的癌症杀伤t细胞或本文所述的药物组合物的受试者中减小肿瘤的大小和/或减少癌细胞的数量。

在实施方案中，癌症是血液癌症。在实施方案中，血液癌症是白血病或淋巴瘤。示例性的血液癌症包括但不限于霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤(例如，b细胞淋巴瘤，弥漫性大b细胞淋巴瘤，滤泡性淋巴瘤，慢性淋巴细胞白血病，套细胞淋巴瘤，边缘区b细胞淋巴瘤，伯基特淋巴瘤，淋巴浆细胞淋巴瘤，毛细胞白血病)，急性髓性白血病，慢性髓性白血病，骨髓增生异常综合征，多发性骨髓瘤或急性淋巴细胞白血病。在实施方案中，癌症不是急性髓性白血病(aml)。

在实施方案中，癌症是实体癌症。示例性实体癌症包括但不限于卵巢癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，肛门区域的癌症，子宫癌，结肠癌，直肠癌，肾细胞癌，肝癌，非小细胞肺癌，小肠癌，食道癌，黑素瘤，卡波西肉瘤，内分泌系统癌，甲状腺癌，甲状旁腺癌，肾上腺癌，骨癌，胰腺癌，皮肤癌，头颈癌，皮肤或眼内恶性黑素瘤，子宫癌，脑干胶质瘤，垂体腺瘤，表皮样癌，宫颈鳞状细胞癌，输卵管癌，子宫内膜癌，阴道癌，软组织肉瘤，尿道癌，外阴癌，阴茎癌，膀胱癌，肾癌或输尿管癌，肾盂癌，脊柱轴肿瘤，中枢神经系统肿瘤(cns)，原发性cns淋巴瘤，肿瘤血管发生，所述癌症的转移病灶，或其组合。

在实施方案中，癌症不是黑素瘤。

在实施方案中，待通过癌症杀伤t细胞治疗的受试者与分离t细胞和/或癌细胞以产生癌症杀伤t细胞的受试者相同。在实施方案中，待通过癌症杀伤t细胞治疗的受试者不同于分离t细胞和/或癌细胞以产生癌症杀伤t细胞的受试者。在实施方案中，两个受试者患有或已经患有相同类型的癌症。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞(或药物组合物)以适合于待治疗或预防的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由诸如患者的状况以及患者的疾病的类型和严重性等因素确定。适当的剂量可以通过临床试验确定。例如，当指示“有效量”或“治疗量”时，医生可以考虑肿瘤大小的个体差异，感染或转移程度，受试者的年龄，体重和状况来确定待施用的药物组合物(或癌症杀伤t细胞)的精确量。在实施方案中，本文所述的药物组合物可以10⁴至10⁹个细胞/kg体重例如10⁵至10⁶个细胞/kg体重(包括那些范围内的所有整数值)的剂量施用。在实施方案中，本文所述的药物组合物可以这些剂量多次施用。在实施方案中，本文所述的药物组合物可以使用免疫疗法(参见例如，rosenbergsa(1988))中描述的输注技术施用。

在实施方案中，将癌症杀伤t细胞(或其制剂)或药物组合物肠胃外施用于受试者。在实施方案中，将细胞静脉内，皮下，肿瘤内，结内，肌内，皮内或腹膜内施用给受试者。在实施方案中，将细胞直接施用(例如注射)到肿瘤或淋巴结中。在实施方案中，细胞作为输注(例如，如rosenbergsa(1988)中所述)或静脉内推进施用。在实施方案中，细胞作为可注射的储库制剂施用。

在实施方案中，将单剂量的癌症杀伤t细胞(或药物组合物)施用给受试者。在实施方案中，将多剂量的癌症杀伤t细胞施用给受试者。在实施方案中，每个剂量之间的时间是至少12小时，例如，至少12，24，36，48，72，96小时或更长，或至少1，2，3，4，5，6，7天或更长，或至少1，2，3，4周或更长。

在实施方案中，单剂量包含10³至10¹¹个癌症杀伤t细胞(例如，10³至10⁴，10⁴至10⁵，10⁵至10⁶，10⁶至10⁷，10⁷至10⁸，10⁸至10⁹，10⁹至10¹⁰或10¹⁰至10¹¹个癌症杀伤t细胞)。

在实施方案中，多剂量方案的每个剂量包含10³至10¹¹个癌症杀伤t细胞(例如，10³至10⁴，10⁴至10⁵，10⁵至10⁶，10⁶至10⁷，10⁷至10⁸，10⁸至10⁹，10⁹至10¹⁰，或10¹⁰至10¹¹个癌症杀伤t细胞)。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞或其制剂(或药物组合物)减少受试者中癌细胞的数量或百分比，例如相对于阴性对照减少至少25％，至少30％，至少40％，至少50％，至少65％，至少75％，至少85％，至少95％或至少99％。

在实施方案中，受试者是哺乳动物。在实施方案中，受试者是人，猴，猪，狗，猫，牛，绵羊，山羊，兔，大鼠或小鼠。在实施方案中，受试者是人。在实施方案中，受试者是儿科受试者，例如，小于18岁，例如，小于17，16，15，14，13，12，11，10，9，8，7，6，5，4，3，2，1岁或以下。在实施方案中，受试者是成年人，例如，至少18岁，例如，至少19，20，21，22，23，24，25，25-30，30-35，35-40，40-50，50-60，60-70，70-80或80-90岁。

组合疗法

根据本文所述的方法，在一些实施方案中，本文所述的效应t细胞，例如本文所述的效应t细胞群(例如，胞啃t细胞)可以与第二治疗剂或程序组合使用。

在实施方案中，效应t细胞和第二治疗剂或程序在受试者被诊断患有癌症后(例如在癌症已从受试者中消除之前)施用/进行。在实施方案中，效应t细胞和第二治疗剂或程序同时或并行施用/进行。例如，当第二治疗剂的递送开始时，一种治疗的递送仍然发生，例如，治疗的施用存在重叠。在其他实施方案中，依次施用/进行效应t细胞和第二治疗剂或程序。例如，在开始一种治疗的递送之前停止递送另一种治疗。

在实施方案中，组合疗法导致更有效的治疗，例如更有效地杀死癌细胞。在实施方案中，第一和第二治疗的组合比单独的第一或第二治疗更有效(例如，导致症状和/或癌细胞的更大减少)。在实施方案中，与作为单一疗法施用时实现类似效果通常所需的第一或第二治疗的剂量相比，组合疗法允许使用较低剂量的第一或第二治疗。在实施方案中，组合疗法具有部分累加效应，完全累加效应或大于累加效应。

在实施方案中，第二治疗剂或程序包括本文“增强t细胞活性的其他方法”部分中描述的疗法。在实施方案中，第二治疗剂包括免疫检查点抑制剂(例如，本文所述的免疫检查点抑制剂)，t细胞的激动剂(例如，本文所述的t细胞的激动剂)和/或如本文所述的其他免疫调节药物(例如，来那度胺。

新的picf和免疫调节剂的筛选测定

本文提供了筛选候选picf和/或候选免疫调节剂的方法。例如，所述方法涉及评估picf的效力，例如离体效力。本文的方法包括筛选多种picf和/或免疫调节剂候选物和/或它们的组合，以鉴定对特定患者的特定肿瘤/癌症类型最有效的picf和/或免疫调节剂组。

在实施方案中，所述方法包括基于细胞的测定，并且可以涉及自动化样品制备和自动化评估，例如通过流式细胞术例如使用exvitech平台。参见，例如，us8,703,491，us2013/0109101a1，us2010/0298255a1，us8,313,948和bennettta(2014)，其通过引用并入本文。例如，使用自动化平台，例如自动化流式细胞术平台，能够评估数百或数千种不同的picf和/或免疫调节剂，并且该评估可以离体进行。流式细胞术方法的使用允许单个细胞的评估以及特定细胞群的分选。免疫细胞可以用结合细胞类型特异性细胞表面标志物的抗体染色。靶癌细胞可以用细胞表面标记(例如结合细胞类型特异性细胞表面标志物的抗体或分布在靶细胞膜中的细胞跟踪染料)染色。还可以针对存在于细胞内部的分子对细胞进行染色，从而通过其蛋白质(例如白细胞介素或干扰素)的产生来表征细胞。

在实施方案中，可以使用自动化流式细胞术平台(例如exvitech平台)筛选候选picf和/或免疫调节剂。参见如上。所述平台允许确定数百或数千种picf和/或免疫调节剂的癌症杀伤(例如，胞啃)潜力。picf和/或免疫调节剂的癌症杀伤潜力也可以通过靶癌细胞与如本文所述的癌症杀伤t细胞的比率来测量。所述平台还允许筛选picf和/或免疫调节剂的许多组合。

在实施方案中，筛选方法包括将一种或多种候选picf和/或免疫调节剂与癌细胞和t细胞一起孵育。在实施方案中，所述方法包括将一种或多种候选picf和/或免疫调节剂与样品(例如血液样品)一起孵育，其中所述血液样品含有癌细胞和t细胞。在实施方案中，所述方法包括将一种或多种候选picf和/或免疫调节剂与肿瘤样品一起孵育，其中所述肿瘤样品含有癌细胞和t细胞。在其他实施方案中，癌细胞和t细胞来自不同的样品，例如，癌细胞来自肿瘤样品，t细胞来自血液样品。

在实施方案中，样品包含血液样品，例如全血样品，外周血或骨髓。在另一个实施方案中，样品获自淋巴结或脾。在实施方案中，样品获自涉及恶性肿瘤(例如血液恶性肿瘤或实体癌症)的任何其他组织。在实施方案中，样品在获得后立即用于本文所述的方法中。备选地，可以用化学品处理样品以避免凝聚并在稍后的时间点进行分析。在一个实施方案中，用肝素处理血液样品以避免凝聚。在另一个实施方案中，用edta处理血液样品以避免凝聚。在另一个实施方案中，用抗凝血剂(包括但不限于凝血酶抑制剂)处理血液样品以避免凝聚。在实施方案中，使用样品而无需纯化或分离步骤，例如，使得细胞环境更类似于体内环境。

在实施方案中，孵育时间足以使t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物，例如以进行胞啃作用以形成例如杀伤癌细胞的胞啃t细胞。在实施方案中，孵育时间足以使picf和/或免疫调节剂在消除的癌细胞和cd8和/或cd4激活的t细胞之间诱导显著更高的有效e∶t比。在实施方案中，孵育时间为至少12小时(例如，至少12，24，36，48，72，96，120小时或更长)。在实施方案中，在癌细胞，t细胞和picf的第一反应混合物离体产生癌症杀伤t细胞之后添加第二组或后续癌细胞组，并且在这些情况下，孵育时间更短，例如，至少1小时(例如至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，24小时或更长)。

可以评估或筛选数百或数千种候选picf和/或免疫调节剂。本文描述的方法能够以等分试样的形式分析各种浓度的大量候选picf和/或免疫调节剂(例如，候选picf和/或免疫调节剂的组合)以评估用于个性化医疗方案(例如，用于个性化生产和使用癌症杀伤t细胞)的大量变量。在一个实施方案中，所述方法分析(任选地每种候选picf和/或免疫调节剂)约5-500个等分试样(例如，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，100，200，500或更多)，或由前述任何两个值定义的范围。在另一个实施方案中，所述方法分析约96个或更多个等分试样。另外，候选picf和/或免疫调节剂的数量可以随着等分试样的数量而变化。在一个实施方案中，等分试样的数量和不同候选picf量和/或免疫调节剂的数量均大于约5(例如，5，10，15，20，25，30，35或40)，或由前述任何两个值定义的范围。在另一个实施方案中，等分试样的数量和不同候选picf和/或免疫调节剂的数量均大于约50。在另一个实施方案中，等分试样的数量和不同候选picf和/或免疫调节剂的数量均大于约96。在另一个实施方案中，可以在本文所述的测定中筛选本领域已知的批准药物的活性成分，以鉴定潜在的picf和/或免疫调节剂。这种批准药物在人体中是安全的，并且可以用于产生用于施用给患者的癌症杀伤t细胞。

在实施方案中，筛选方法包括鉴定(例如，量化)靶细胞(例如，癌细胞)群体。备选地/另外，筛选方法包括鉴定效应细胞群(例如，胞啃t细胞群)。可以通过使用针对特定细胞表面或细胞内标志物(例如，其与检测标记如荧光标签缀合)的抗体(例如单克隆抗体)来鉴定细胞群。在实施方案中，细胞表面标志物包括分化簇(cd)标志物，其用于鉴定血液恶性肿瘤(例如白血病，多发性骨髓瘤，淋巴瘤)和白细胞。cd标志物也用于鉴定和诊断实体瘤。流式细胞术能用于细胞群的检测和量化。细胞表面标记(例如细胞跟踪染料)也可用于标记癌细胞的表面膜，以测量癌症杀伤t细胞的胞啃作用。免疫组织化学也可用于检测某些细胞标志物，例如，以鉴定细胞群。

在实施方案中，确定候选picf和/或免疫调节剂对效应细胞(例如t细胞)的群和亚群的作用。例如，样品可以在与picf和/或免疫调节剂孵育之前含有各种类型的t细胞，并且在与picf和/或免疫调节剂孵育后可以含有不同组合的或不同水平的各种t细胞类型。在实施方案中，与picf和/或免疫调节剂一起孵育可导致胞啃t细胞数量的形成和/或增加。在实施方案中，测量在与picf和/或免疫调节剂孵育后变为胞啃细胞(并且表达来自效应t细胞和癌细胞的标志物)的t细胞的百分比。

在实施方案中，测量候选picf和/或免疫调节剂对靶细胞(例如癌细胞)群的作用。测量可以包括测量细胞消耗，例如，相对于含有阴性对照的孔量化含有picf或免疫调节剂的孔中的细胞计数。

在实施方案中，测量候选picf和/或免疫调节剂对效应细胞(例如，胞啃t细胞)群的作用。测量可涉及细胞增殖分析，例如，将含有picf和/或免疫调节剂的孔中的细胞计数与含有阴性对照的孔进行比较。

在实施方案中，将导致以下的候选picf和/或免疫调节剂鉴定为有效的picf和/或免疫调节剂，例如，有效产生具有增强的癌症杀伤活性的t细胞：(i)靶细胞(例如癌症细胞)的消耗；(ii)胞啃t细胞(例如，包含来自癌细胞的标志物和来自效应t细胞例如ctl的标志物)的形成或水平增加，和/或(iii)效应t细胞(例如，ctl)的增殖。

在实施方案中，与参照例如本文所述的picf和/或免疫调节剂相比较，评估候选picf和/或免疫调节剂。在实施方案中，与参照相比导致靶(例如癌症)细胞相似或更大消耗的候选picf被鉴定为有效的picf和/或免疫调节剂。在实施方案中，导致类似或更高水平的胞啃t细胞(例如，包含来自癌细胞的标志物和来自效应t细胞例如ctl的标志物)形成或增加的候选picf被鉴定为有效的picf和/或免疫调节剂。在实施方案中，导致癌症杀伤t细胞的相似或更大程度增殖的候选picf和/或免疫调节剂被鉴定为有效的picf和/或免疫调节剂。

在实施方案中，使用离体/体外测定来测定候选picf和/或免疫调节剂和产生的t细胞的活性以测量剂量应答曲线，其数学拟合使得定量参数(其选自ec50，有效e∶t比率，emax或动力学中的至少一个)能够估计活性。

-t细胞增殖的ec50确定在样品中产生50％的激活的癌症杀伤t细胞的picf的浓度。t细胞激活的ec50类似于癌细胞消耗的ec50。

-有效e∶t比率表示产生的癌症杀伤t细胞(有效t细胞)对癌细胞(靶细胞)的活性。高的有效e∶t比率预测对作为自体细胞疗法的癌症杀伤t细胞敏感的患者，并且低的有效e∶t比率预测对作为自体细胞疗法的癌症杀伤t细胞抗性的患者。

-癌细胞的剂量应答曲线的emax确定在给定的孵育时间下在高剂量的picf下存活的癌细胞的百分比(％)。更长时间的孵育允许癌症杀伤t细胞杀伤更多的癌细胞。激活的癌症杀伤t细胞需要杀死100％的癌细胞，这样的t细胞对于患者来说才是合适的单一疗法治疗。当杀死癌细胞显著低于100％时，并且在较长的孵育时间没有改善，那些存活的癌细胞具有抗性并且可以在临床上提供信息以确定治疗。为了恢复抗性表型，添加额外的免疫调节剂(例如免疫检查点抑制剂)可以克服这种免疫抑制并因此克服这种抗性。

1.离体添加额外的免疫调节剂以减轻免疫抑制对于为随后的细胞疗法产生的癌症杀伤t细胞尤其有意义。原因在于，这使得能够组合多种免疫治疗剂，免疫调节剂(包括多种作用机制)，多达5种，10种或20种试剂，这与现有技术中描述的组合治疗相反，其由于多免疫疗法的毒性限制仅允许2-3种免疫疗法药物的组合同时体内施用给受试者。如本文所述的筛选测定(其测量癌症杀伤t细胞(单独或通过其癌细胞杀伤活性标准化)的离体/体外毒性)可以适合于鉴定离体/体外孵育的免疫疗法的最佳组合，其限制它们的组合毒性同时增强它们的组合活性。因此，离体产生的用于细胞疗法的癌症杀伤t细胞可以利用多免疫疗法的优点。

2.作为另外的免疫治疗处理，将免疫调节剂添加到体内的癌症杀伤t细胞，导致组合治疗。如本文所述的筛选测定(其测量癌症杀伤t细胞(单独或通过其癌细胞杀伤活性标准化)的离体/体外毒性)可以适合于预测免疫疗法的最佳组合以通过限制它们的组合毒性同时增强它们的组合活性来治疗患者。

-癌症杀伤t细胞活性的时间依赖性动力学。对于相同的picf，t细胞激活和癌细胞消耗的效率在每个受试者中是不同的。能够更快地杀死癌细胞的癌症杀伤t细胞可能在细胞疗法中更有效。更快的活性与对患者癌细胞的更快作用相关，这是反映更高的敏感性的积极结果。当癌症杀伤t细胞是通过mhc-i机制识别癌细胞的cd8+肿瘤特异性抗原t细胞时，更快的活性意味着对癌细胞的更高亲和力。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含离体/体外毒性较小的细胞，因为它们杀伤显著较少的非病理细胞，即它们更有选择性地杀伤。与参照相比时，这可以通过标记非病理细胞并且显示更多选择性癌细胞杀伤来测量，其中所述参考可以是针对相同癌症类型的不同患者样品，或者是同一患者样品(例如胞啃)内的不同细胞亚群(例如克隆)。

在细胞疗法中观察到的最常见的毒性称为细胞因子风暴，也称为细胞因子级联和高细胞因子血症。当在通过细胞裂解杀伤癌细胞的过程中由癌症杀伤t细胞释放的细胞因子释放到细胞外(导致各种细胞因子水平高度升高)时，会产生潜在致命的免疫反应。在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含具有离体/体外毒性较小的细胞，因为它们在上清液和/或细胞内产生较少的细胞因子。在实施方案中，癌症杀伤t细胞制剂包含同时具有更高的癌症杀伤活性和较小离体/体外毒性的细胞，因为它们在上清液和/或细胞内每单位癌细胞杀死中产生更少的细胞因子，即通过定量估计癌细胞杀伤活性如有效e∶t比率，ec50，emax，动力学或这些因子的组合来标准化释放的细胞因子的类型和/或水平。

在实施方案中，候选picf和/或免疫调节剂的效力(例如功效，活性)使用不同比率的癌症杀伤t细胞：靶细胞(例如靶细胞可以是癌细胞)使用离体/体外测定来确定。在一些实施方案中，杀伤测定包括提供例如根据本文所述的方法产生的癌症杀伤t细胞或其制剂。在实施方案中，所述测定还包括步骤(a)在足以使癌症杀伤t细胞杀伤靶细胞的条件下(例如，持续一段时间和特定浓度的候选picf和/或免疫调节剂)，形成多个离体反应混合物，其包含候选picf和/或免疫调节剂，靶细胞(例如癌细胞)和癌症杀伤t细胞或其制剂。在实施方案中，离体反应混合物包含靶细胞与t细胞的多个比率。所述测定还可以包括针对靶细胞与t细胞的每个比率的步骤(b)，确定步骤(a)之后的靶细胞的数量，以及任选地确定步骤(a)之后的癌症杀伤t细胞的数量。在实施方案中，所述测定还包括步骤(c)将步骤(a)的靶细胞与t细胞的比率与步骤(b)中的靶细胞数量相关联。在实施方案中，步骤(a)的靶细胞与t细胞的高比率(例如，比参考比率更高的比率)(导致步骤(a)后较少的靶细胞)表明候选picf和/或免疫调节剂是用于从受试者产生癌症杀伤t细胞的有效的picf和/或免疫调节剂(例如，有功效的picf和/或免疫调节剂)。

在实施方案中，参考比率是预定比率，例如约1∶3至1∶10，例如约1∶3，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9或1∶10。在实施方案中，来自步骤(b)的靶细胞与t细胞的高比率为约1∶4至1∶100(例如，1∶4，1∶5，1∶6，1∶7，1∶8，1∶9，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45，1∶50，1∶75，1∶100或更高)。

在实施方案中，与对照值相比，步骤(b)中较低数量(例如，低至少1.5倍，例如，至少2，3，4，6，8，10，25，50，100，150，200，500，1000或更多)的靶细胞指示步骤(a)后较少的靶细胞。在实施方案中，对照值是在离体混合物形成之前靶细胞的数量，或在不足以允许癌症杀伤t细胞杀伤靶细胞的一段时间后离体混合物中靶细胞的数量。在实施方案中，对照值是在没有picf或者仅含有t细胞相互作用臂(例如cd3)的picf的无效对照的情况下孵育相同时间的离体混合物中的靶细胞数量。

在实施方案中，癌症杀伤t细胞或其制剂包含t细胞，例如cd8+和cd25+的ctl和/或cd4+和cd25+的t细胞。

在实施方案中，所述方法(例如，所述方法的步骤(b))在自动化平台中进行，例如本文所述的自动化流式细胞术平台，例如本文所述的exvitech平台。

在实施方案中，有效候选picf和/或免疫调节剂用于本文所述的方法，例如，本文所述的产生癌症杀伤t细胞的方法，本文所述的治疗方法，评估本文所述的癌症治疗的方法，和/或鉴定对本文所述的癌症杀伤t细胞有应答的患者的方法。

癌症治疗的评估测定

本文提供了评估患者是否对某种癌症治疗有应答的方法。在实施方案中，评估方法包括筛选可能在特定患者中有效的癌症治疗的方法。

在实施方案中，能够评估多种类型的癌症治疗(化学疗法，靶向抗癌疗法，溶瘤药物，细胞毒性剂，基于免疫的疗法，细胞因子，t细胞的激动剂(例如，激动性抗体或其片段或共刺激分子的激活剂)，抑制性分子(例如，免疫检查点抑制剂)的抑制剂，免疫调节剂，疫苗，或细胞免疫疗法)。在实施方案中，待评估的癌症治疗包括但不限于免疫检查点抑制剂，例如以下一种或多种的抑制剂：ctla4，pd1，pdl1，pdl2，b7-h3，b7-h4，tim3，lag3，btla，cd80，cd86或hvem。示例性免疫检查点抑制剂包括伊匹单抗(ipilimumab)，tremelimumab，mdx-1106，mk3475，ct-011，amp-224，mdx-1105，imp321或mga271。在实施方案中，待评估的癌症治疗包括t细胞的激动剂，例如针对cd137，cd40和/或糖皮质激素诱导的tnf受体(gitr)的抗体或其片段。在实施方案中，待评估的癌症治疗包括免疫调节剂，例如lenolidomide。可以评估本文所述的任何免疫调节剂。

在实施方案中，评估方法包括：(a)提供来自患有癌症(例如，血液癌症或实体癌症)的受试者的t细胞；(b)提供例如来自所述受试者的癌细胞；(c)例如在足以允许t细胞从癌细胞获得细胞表面标志物的条件下(例如持续一段时间)，形成离体反应混合物，其包含t细胞，癌细胞和邻近免疫辅导因子(picf)；以及(d)使离体反应混合物与候选癌症治疗或癌症治疗组合进行接触。所述方法还包括确定一个或多个参数，所述参数指示候选癌症治疗在特定患者中杀伤癌细胞方面的有效性。

示例性picf在本文的“邻近免疫辅因子(picf)”部分中详细描述。

在实施方案中，t细胞和癌细胞来自相同的样品，例如来自待评估(评估癌症治疗的应答性)的患者。例如，提供来自待评估患者的血液样品(例如，包括癌细胞和t细胞)作为样品。备选地，提供来自待评估患者的肿瘤样品(例如，包含癌细胞和t细胞，例如肿瘤浸润性t细胞)。在实施方案中，所述方法不包括在形成离体反应混合物之前从样品(例如血液样品或肿瘤样品)中除去任何组分(例如，细胞组分)。在实施方案中，血液样品或肿瘤样品可以是新鲜分离的样品或冷冻和解冻的样品。

在实施方案中，样品包含血液样品，例如全血样品，外周血或骨髓。在另一个实施方案中，样品获自淋巴结或脾。在实施方案中，样品获自涉及恶性肿瘤(例如血液恶性肿瘤或实体癌症)的任何其他组织。在实施方案中，样品在获得后立即用于本文所述的方法中。备选地，可以用化学品处理样品以避免凝聚并在稍后的时间点进行分析。在一个实施方案中，用肝素处理血液样品以避免凝聚。在另一个实施方案中，用edta处理血液样品以避免凝聚。在另一个实施方案中，用抗凝血剂(包括但不限于凝血酶抑制剂)处理血液样品以避免凝聚。在实施方案中，使用样品而无需纯化或分离步骤，例如，使得细胞环境更类似于体内环境。

在实施方案中，反应混合物在容器(例如多孔培养皿或平板(例如，微孔板，例如，包含6，12，24，48或96个孔)的孔，或测定管)中进行。

在实施方案中，所述方法(例如，通过包括picf)产生具有增强的癌症杀伤活性的胞啃t细胞群。不希望受理论束缚，据信通过产生这种增强的癌症杀伤t细胞群，所述测定在检测癌症治疗效果方面比不包含这种癌症杀伤t细胞的其他类型的测定更敏感。

在实施方案中，评估方法可以以高通量方式进行，例如，可以包括筛选可能在特定患者中有效的癌症治疗。在实施方案中，筛选方法包括基于细胞的测定，并且可以涉及例如通过流式细胞术例如使用exvitech平台的自动化样品制备和自动化评估。例如，使用自动化平台，例如自动化流式细胞术平台，能够评估数百或数千种不同的癌症治疗，并且该评估可以离体进行。在实施方案中，可以使用自动化流式细胞术平台(例如exvitech平台)筛选候选癌症治疗。所述平台还允许筛选癌症治疗的许多组合。

可以采集数百或数千个候选癌症治疗方案。本文描述的方法能够以等分试样的形式分析各种浓度的大量候选癌症治疗(例如，候选癌症治疗的组合)以评估大量变量。在一个实施方案中，所述方法分析(任选地每种癌症治疗)约5-500个等分试样(例如，5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，100，200，500或更多)，或由前述任何两个值定义的范围。在另一个实施方案中，所述方法分析约96个或更多个等分试样。另外，癌症治疗的数量可以随着等分试样的数量而变化。在一个实施方案中，等分试样的数量和不同候选癌症治疗的数量均大于约5-40(例如，5，10，15，20，25，30，35或40)，或由前述任何两个值定义的范围。在另一个实施方案中，等分试样的数量和不同候选癌症治疗的数量均大于约50。在另一个实施方案中，等分试样的数量和不同候选癌症治疗的数量均大于约96。

候选癌症治疗对来自待评估患者的癌细胞的影响可以通过与在不存在候选治疗的情况下相比在候选治疗的存在下发生的癌症杀伤的程度来确定。可以使用本文描述的方法确定癌症杀伤的程度。在实施方案中，通过测量消除的靶癌细胞和激活的t细胞(癌症杀伤t细胞)之间的有效e∶t比率(如本文所述并称为有效e∶t比率)来确定癌症杀伤活性。例如，可以例如通过使用流式细胞术通过检测癌症特异性细胞标志物然后量化来鉴定癌细胞。

在实施方案中，测定中导致更大程度的癌症杀伤的候选癌症治疗(例如，治疗后癌细胞数量比之前更少，或者与含有阴性对照治疗的样品相比癌细胞数量更少)(例如，癌细胞数量减少至少10％(例如，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1.5倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍或更多)表明患者可能对所述癌症治疗敏感或应答，即所述癌症治疗可能有效杀伤癌细胞和/或降低患者的肿瘤负荷。

在实施方案中，测定中导致更大程度的癌症杀伤的候选癌症治疗(例如，治疗后癌细胞数量比之前更少，或者与含有阴性对照治疗的样品相比癌细胞数量更少)(例如，癌细胞数量减少至少10％(例如，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，1.5倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍，100倍或更多)表明所述癌症治疗可能有效治疗患者的癌症。

在实施方案中，所述方法还包括制备和/或提供患者对各种候选癌症治疗的应答性的报告。在实施例中，将报告提供给患者或另一个人或实体，例如护理人员，例如，医生，例如，肿瘤学家，医院，诊所，第三方付款人，保险公司或政府办公室。在另一个实施方案中，将报告提供给负责解释或确定候选癌症治疗对癌细胞的作用(例如，癌症杀伤程度)的一方。

在实施例中，报告可以是电子的，基于网络的或纸质的形式。报告可以包括来自所述方法的输出，例如，癌细胞的鉴定，癌细胞的量化，以及对应于每种癌症治疗或癌症治疗组合的癌细胞杀伤程度。

在一个实施方案中，产生例如纸或电子形式的报告，其鉴定癌细胞死亡的程度和导致该效果的相关癌症治疗。

此类信息可包括有关潜在或建议的癌症治疗的信息。报告可以包括关于癌症治疗的可能有效性，癌症治疗的可接受性或将癌症治疗应用于患者的可行性的信息。例如，报告可以包括关于将癌症治疗施用给病人的信息或建议，例如，以预选剂量或预选治疗方案施用，例如，与其他药物组合。在一个实施方案中，并非在报告中鉴定了在所述方法中测试的所有候选癌症治疗。例如，报告可以限于可能对患者有效的癌症治疗。在其他实施例中，报告可以省略对患者不太有效的癌症治疗。可以在实践所述方法的本文所述的实体收到样品后的3-21天(例如，3，4，5，6，7，14或21天)内，向例如所述实体提供报告。

实施例

实施例1：双特异性抗体在多发性骨髓瘤(mm)中的作用

在实施方案中，从患有血液恶性肿瘤的患者获得的样品可用于测试bsmab对恶性细胞上的特定肿瘤靶标和ctl上的t细胞靶标(cd3)的作用，因为这样的样品包含靶标(恶性)细胞和效应(ctl)细胞。从已被诊断患有多发性骨髓瘤的患者获得骨髓(bm)样品。所有样品均来自18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。

将双特异性单克隆抗体(bsmab)和对照抗体加入96孔板中。每个bm样品以其整体(即，不首先从bm中分离细胞或其他组分)用培养基稀释，并铺板到96孔板中，所述孔含有bsmab，对照抗体或两者都没有，所有条件一式两份测试。将样品孵育96小时以促进样品中ctl的增殖。在分析之前，裂解红细胞，并将定义恶性细胞群和ctl群的抗体加入板中：cd138-pe(cytognos，ref：cyt-138pe4，克隆b-a38)/cd38percp(immunostep，ref：38pp-100t，克隆gr7a4)/cd45-pb(bd-pharmingen，ref：560367，克隆30-f11)/膜联蛋白v-fitc(immunostep，ref：anxvf)/cd56-apc(bd-pharmingen，ref：341027，克隆ncam16，2)/cd3pe(cytognos，ref：cyt-3pe5，克隆33-2a3)/cd4pb(immunostep，ref：4cfb-100t，克隆hp2/6)/cd8fitc(cytognos，ref：cyt-8f8，克隆ucht-4)/cd25apc(biolegend，ref：302610，克隆bc96)/cd69percp(biolegend，ref：310928，克隆fn50)。加入膜联蛋白v-fitc以监测细胞凋亡水平。使用基于exvitech流式细胞仪的平台分析平板。使用基于前向散射(fsc)，侧向散射(ssc)和各种表面标志物(包括cd38，cd138和cd56)的表达的门控策略来鉴定细胞。通过将具有bsmab的孔中的活细胞数量与没有bsmab的对照孔中的活细胞数量进行比较来确定活细胞的百分比。

图6显示代表性样品的图，其显示在用x轴上显示的各种浓度的bsmab(药物)孵育96小时后恶性细胞和ctl的计数。在ctl的增殖增加(连续线，三角形)方面存在bsmab剂量-应答作用，其对应于恶性细胞群的减少(虚线，正方形)。恶性细胞群的减少通过与细胞凋亡分开的机制发生，表明与t细胞裂解一致的非凋亡性细胞死亡。仅靶向恶性细胞或t细胞群的对照mab没有作用。对于该样品，基础(不含bsmab)e∶t比为1∶2.7，不同于1∶6.1的有效(含bsmab)e∶t比。这表明bsmab的功能可以离体评估，并且在bsmab(具有抗cd3的一只臂)存在下，在整个骨髓样品中促进ctl的增殖，而不必事先从整个骨髓样本中分离出淋巴细胞。

实施例2-bsmab对慢性淋巴样白血病(cll)中靶细胞和效应细胞的作用。

在该实施例中，以与实施例1中测试的那些不同的适应症和不同的样品类型测试bsmab对靶细胞和效应细胞的作用。使用来自已被诊断患有cll的患者的外周血(pb)样品。所有样品均来自18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。

将靶向恶性细胞上的cd19和ctl上的cd3的bsmab以及对照抗体加入到96孔板中。每个pb样品以其整体(即，不首先从pb中分离细胞或其他组分)用培养基稀释，并铺板到96孔板中，所述孔含有bsmab，对照抗体或两者都没有，所有条件一式两份测试。将样品孵育144小时以促进样品中ctl的增殖。在分析之前，裂解红细胞，并将定义恶性细胞群和ctl群的抗体加入板中。使用8色板测定cd3/cd19bsmab对每个活细胞群的作用：cd3pb(bd-pharmingen，ref：558117，克隆ucht1)/cd45-po(invitrogen，ref：mhcd4530，克隆hi30)/膜联蛋白v-fitc(immunostep，ref：anxvf)/cd19-pe(ebioscience，ref：12-0199-42，克隆hib19)/cd4-pecy5(biolegend，ref：317412，克隆okt4)/cd5-pecy7(biolegend，ref：300622，克隆ucht2)/cd8apc(bd，ref：555369，克隆rpa-t8)/cd25apch7(bd-pharmingen，ref：560225，克隆m-a251)。加入膜联蛋白v-fitc以监测细胞凋亡水平并完全量化活细胞数量。在y轴上显示活白血病b细胞(cd45+cd19+，正方形)的数量和活ctl(cd8+cd25+，三角形)的数量。x轴代表8种浓度的cd3cd19bsmab(ng/ml)。使用基于exvitech流式细胞仪的平台分析平板。使用基于前向散射(fsc)，侧向散射(ssc)和各种表面标志物的表达或缺乏表达的门控策略来鉴定细胞。通过将具有bsmab的孔中的活细胞数量与没有bsmab的对照孔中的活细胞数量进行比较来确定活细胞的百分比。

图7显示代表性样品的图，其显示在用各种浓度的bsmab(药物)孵育144小时后恶性b细胞和ctl的计数。在ctl的增殖增加(三角形)方面存在剂量-应答作用，其对应于恶性细胞群的减少(正方形)。恶性细胞群的减少通过与细胞凋亡分开的机制发生，表明与t细胞裂解一致的非凋亡性细胞死亡。仅靶向恶性细胞或t细胞群的对照mab没有作用。对于该样品，基础(不含bsmab)e∶t比为1∶30.1，不同于1∶5.7的有效(含bsmab)e∶t比。这些结果证明bsmab的功能可以使用全外周血以及全骨髓离体评估。在cd19/cd3bsmab存在下，在全pb样品中促进ctl的增殖，而不必事先从pb样品中分离淋巴细胞。

实施例3-bsmab对急性髓性白血病(aml)中靶细胞和效应细胞的作用

在该实施例中，bsmab对靶细胞和效应细胞的作用以与实施例1和2不同的适应症进行测试。从已被诊断患有aml的患者获得骨髓(bm)样品。所有样品均来自18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。

将靶向恶性细胞上的cd123和t细胞群上的cd3的bsmab以及对照抗体加入到96孔板中。每个bm样品以其整体(即，不首先从bm中分离细胞或其他组分)用培养基稀释，并铺板到96孔板中，所述孔含有bsmab，对照抗体或两者都没有，所有条件一式两份测试。将样品孵育120小时以促进样品中ctl的增殖。在分析之前，裂解红细胞，并将定义恶性细胞群和ctl群的抗体加入板中：cd3pb(bd-pharmingen，ref：558117，克隆ucht1)/cd45-po(invitrogen，ref：mhcd4530，克隆hi30)/膜联蛋白v-fitc(immunostep，ref：anxvf)/cd117-pe(biolegend，ref：313204，克隆104d2)或cd33pe(bd-pharmingen，ref：555450，克隆wm53/cd4-pecy5(biolegend，ref：317412，克隆okt4)/cd5-pecy7(biolegend，ref：300622，克隆ucht2)/cd8apc(bd，ref：555369，克隆rpa-t8)/cd25apch7(bd-pharmingen，ref：560225，克隆m-a251)。膜联蛋白v-fitc用以监测细胞凋亡水平。

使用基于exvitech流式细胞仪的平台分析平板。使用基于前向散射(fsc)，侧向散射(ssc)和各种表面标志物的表达或缺乏表达的门控策略来鉴定细胞。通过将具有bsmab的孔中的活细胞数量与没有bsmab的对照孔中的活细胞数量进行比较来确定活细胞的百分比。

图8显示三个代表性样品的图表，其显示在用x轴上显示的各种浓度的bsmab(药物)孵育120小时后恶性细胞(活母细胞)和ctl(cd8+cd25+)的计数。对于每个样品，在ctl的增殖增加(灰线，三角形)方面存在剂量-应答作用，其对应于恶性细胞群的减少(黑线，正方形)。恶性细胞群的减少通过与细胞凋亡分开的机制发生，表明与t细胞裂解一致的非凋亡性细胞死亡。仅靶向恶性细胞或t细胞群的对照mab没有作用。在该实施例中，靶细胞(aml母细胞)的减少水平因样品而异，效应细胞(恶性母细胞)群的增加也是如此。有效e∶t比率在不同患者样本之间也有所不同，从1∶0.8到1∶7.1，这意味着对于一个样品，每个激活的t细胞杀死的癌细胞少于1个(1∶0.8)，而另一个样品，每个激活的t细胞杀死超过7个癌细胞(1∶7.1)。这证明了鉴定具有有利的e∶t比率的患者的方法，所述比率是与bsmab孵育后的比率。在实施方案中，有利的有效e∶t比率可对应于过继细胞疗法可能特别有效的患者。这进一步表明bsmab的功能可以离体评估，并且在bsmab(一只臂是抗cd3)存在下，在整个骨髓样品中促进ctl的增殖，而不必事先从整个骨髓样本中分离出淋巴细胞。

实施例4-对act理想的胞啃效应细胞群的流式细胞术鉴定

在一些实施方案中，显示bsmab剂量依赖性增殖的t细胞群潜在地具有ctl和恶性浆细胞群的标志物。在此类实施方案中，该ctl群可以具有活跃参与的恶性细胞，并且当裂解恶性细胞时，恶性细胞的一些细胞表面标志物可以在胞啃过程中嵌入ctl的膜中。该群体在本文中称为“胞啃ctl”，并且它们是与恶性细胞相互作用并且最可能消除恶性细胞的激活的t细胞的亚群。由于ctl经历与恶性细胞的紧密接触，在一些实施方案中，它们暴露于恶性细胞上的特异性抗原，因此将被引发以产生对这些抗原特异的受体。在其他实施方案中，这些ctl识别恶性细胞中的多种抗原。不希望受理论束缚，据信这种胞啃ctl群体可以扩展并用于识别(和杀伤)宿主中的恶性细胞。

为了证明这种效果，用针对cd标志物的全套抗体分析来自aml患者的bm样品，以描绘恶性细胞和标志物以鉴定淋巴细胞群的亚群。在aml样品中120小时cd123/cd3bsmab暴露后，针对被定义为在膜表面中表达异常母细胞标志物(cd117+)的t细胞(cd3+)的胞啃群体的存在对各孔进行评估。

图9a显示了使用侧向散射(ssc)和cd3表达定义t细胞群(灰色)的门(gate)(正方形)。图9b显示在不存在bsmab的情况下t细胞(cd3+/cd117-)群体(方形门，灰色)和aml母细胞(cd117+/cd3-)群体(方形门，黑色)的120小时孵育后的点图。在没有bsmab的情况下，没有明显的胞啃细胞，如在描绘cd117+/cd3+群体的圆形门中所见。图9c显示与图9b相同的门，但是在cd123/cd3bsmab存在下孵育120小时后。在该时间点并且在含有的bsmab的浓度＞0.05μg/ml的孔中，明显消除了恶性母细胞(cd117+/cd3-)，并且t细胞(cd3+/cd117-)数量明显增加。另外，观察到表达aml母细胞标志物cd117的新t细胞群(cd117+/cd3+，圆圈)的出现。该群体被定义为胞啃ctl群体。

各种picf(例如各种bsmab)的有效性可以例如在例如本实施例中描述的测定中离体测试。在实施方案中，可以检测可能在靶向恶性细胞方面优越的ctl群体的存在。在实施方案中，该群体可以扩增，并且ctl细胞制剂可以用作药物，特别是在恶性肿瘤(例如血液恶性肿瘤)的act治疗中。

实施例5-评估通过使用bsmab抗体产生的ctl群的杀伤能力。

在一些实施方案中，通过使用bsmab产生的胞啃细胞ctl可以具有更大的能力以从相同宿主中消除恶性细胞群。在实施方案中，胞啃群体将例如通过使用荧光激活细胞分选(facs)从样品的其余部分分离。为了检验这一点，测试了含有被诊断患有aml的患者的白细胞的冷冻保存的样品。

图10a，10b和10c显示实验的流式细胞术点图(cd117相比于cd3)，其证明在暴露于cd123/cd3bsmab120小时后新产生的ctl群体的杀伤能力。首先，将来自aml患者的一管冷冻保存的细胞暴露于浓度为0.875μg/ml的cd123cd3bsmab120小时。洗涤所得细胞以除去任何过量的bsmab，并将细胞在37℃下与5％co2在湿度下孵育过夜。将来自同一患者的第二管冷冻保存的细胞解冻，并将该样品与先前通过暴露于bsmab产生的样品混合。

图10a显示了在120小时bsmab暴露后来自第一个aml样品的结果的点图(cd117相比于cd3)，其中aml母细胞(cd117+/cd3-)已被消除，仅留下新产生的t细胞(cd3+/cd117-)。

图10b显示来自同一患者的新冷冻保存的小瓶的点图(cd117/cd3)，其中存在母细胞(cd117+/cd3-)和低水平的残留t细胞(cd117-/cd3+)。在暴露于bsmab之前，图10a中所示的细胞样品看起来类似于图10b。将样品混合后，在存在和不存在0.875μg/mlcd123/cd3bsmab的情况下将它们孵育2小时，4小时和24小时。还在不添加预处理的(图5a)细胞的情况下单独测试新解冻的细胞。

图10c显示了图10a和图10b细胞群的混合物在0时间点的点图(cd117/cd3)，其中可以看到存在t细胞(cd3+/cd117-)和新的aml母细胞(cd117+/cd3-)两者。图10d是孵育24小时后的点图(cd117/cd3)，其中显然aml母细胞(cd117+/cd3-)在先前产生的t细胞群存在下被消耗。这是在没有cd123/cd3bsmab的情况下完成的。先前产生的t细胞群能够在没有bsmab辅助的情况下杀伤aml母细胞群。这表明通过初始暴露于bsmab和恶性细胞产生的ctl在没有bsmab的情况下保留了杀伤恶性群体的能力。

图11中的图表显示了先前产生的ctl随时间消耗新小瓶中aml母细胞的动力学效应。中灰色虚线表示aml母细胞(来自图10b)的对照群体(不存在来自图10a的t细胞)。结果表明，随着时间的推移，母细胞群会轻微自发消耗。黑色圆圈代表与图10a的t细胞混合的aml母细胞。先前产生的t细胞群体对aml母细胞的消耗非常迅速，几乎50％的母细胞在前2小时内消失。截至24小时，母细胞群的几乎100％已经消耗。添加cd123/cd3bsmab(浅灰色正方形)没有作用。这些结果经一段时间发生，所述时间段太短而不能成为新小瓶中存在的t细胞群(图10b中的细胞)的结果。

实施例6-通过不同e∶t比的剂量应答测量由picf诱导的激活的t细胞的活性

测量药物活性的方法是产生评估其在不同浓度下的活性的剂量应答曲线，将数据拟合为描述活性并使其能够通过标准参数进行定量的操作药效学数学模型。

用picf孵育t细胞和肿瘤细胞诱导癌症杀伤t细胞的激活和增殖，所述癌症杀伤t细胞是杀伤肿瘤细胞的药剂。

在第一步中，通过将患者样品(例如血液，骨髓)与picf一起孵育(例如120小时)(导致较少数量的肿瘤细胞，因为癌症杀伤t细胞消除了许多肿瘤细胞)来产生激活的癌症杀伤t细胞。在随后的步骤中，在一些情况下，可以任选地洗掉picf，并且可以任选地通过facs(荧光激活细胞分选仪)将癌症杀伤t细胞组cd4+cd25+和cd8+cd25+分选为纯群体。备选地，可以使用相同的方案而无需洗掉picf和/或不通过facs分选。

然后可以将第二患者样品(例如，相同患者样品的等分试样)添加到癌症杀伤t细胞组中并分离，或者将其添加到整批剩余细胞中。因为癌症杀伤t细胞代表药剂，将其以不同的量，特别是以不同的e∶t比率添加到第二等分试样(患者样品)，使得能够测量剂量应答曲线和使用标准药效学建模方法。在一些实例中，肿瘤细胞的数量是固定的，并且添加的癌症杀伤t细胞的数量是变化的，以产生不同e∶t比率的剂量应答曲线。这是一种测量药物活性的药效学方法。

该实施例还描述了在来自aml样品的母细胞上使用作为picf的双特异性抗体cd3xcd123。在37℃在含有5％co2的潮湿空气中并在cd123xcd3bite(creativebiolabs)存在下孵育120小时后，从冷冻的aml样品中产生t淋巴细胞。此后，使用facsariaiii流式细胞仪(bd)通过荧光激活细胞分选(facs分选)分选激活的(cd25+)t细胞(cd8+和cd4+)。分选细胞群的纯度高于99％。一旦效应t细胞被纯化，就将来自同一患者的新小瓶解冻以评估分选的群体的细胞毒性。

将效应t细胞(cd8+cd25+或cd4+cd25+或两者同时以相同的50/50比例)与恒定数量的母细胞以不同效应细胞：靶标(e∶t)比率(从接近于1∶1的比率开始)混合。将两种细胞类型(效应细胞和靶标)接种以在37℃在含有5％co2的潮湿空气中在cd123xcd3bite不存在下再孵育24小时。

图12显示了cd123xcd3bite暴露后分选的cd8+cd25+或cd4+cd25+细胞的以细胞剂量依赖性方式的杀伤能力，在接近1∶1的比率时达到最大杀伤能力。x轴表示e∶t比(图12a)或激活的t细胞数量(图12b)。在母细胞的数量是固定的情况下，图表在两种表示中是相同的，并且y轴表示在不同比率或t细胞计数下孵育24小时后的活母细胞的百分比。

使用不同的药效学建模和模拟策略来表征免疫调节和肿瘤细胞消耗活性。这些模型允许估计典型的群体参数以及对每个个体的活性的准确评估。最简单的模型评估t细胞激活与肿瘤细胞消耗之间的关系，或这些变量与药物浓度的直接关系。可以建模更复杂的情况，例如最终应答与基础e∶t比(nk)的关系，或激活的t细胞(cd8+cd25+或cd4+cd25+)的最大数量与基础母细胞的比率，或在特定参考药物浓度点(包括本文所述的有效e∶t比)的激活的t细胞和消耗的母细胞的比率。所述关系说明了不同浓度药物和不同孵育时间的作用。如果测量被限制为每个样本一个，如仅当其到达时的原始e∶t比率，或者激活的t细胞的最大数量，则可以使用不同的建模方法。例如，可以使用群体建模方法，其中来自每个样品的测量值有助于建立对所有样品有效的连续模型函数。也可以应用嵌套模型，其中一个模型的因变量(例如，t细胞的激活相比于药物浓度和时间)用作其中分析第二变量(例如，肿瘤细胞消耗相比于激活的t细胞)的第二模型的输入。

标准药效学模型可用于拟合本文所述的例如在该实施例中的数据集至操作模型以量化它们各自的活性。因为癌症杀伤t细胞是由激活的t细胞中的t细胞受体与肿瘤靶细胞的结合引起的，所以应用了配体-受体结合的简单模型。平衡模型用于拟合作为配体浓度(x，t细胞计数)的函数的结合数据(y)。使用最大结合容量(blmax)和受体结合亲和力(kd)。该模型遵循双曲线方程：

利用该模型拟合的癌症杀伤t细胞的3个亚群(cd8+cd25+，cd4+cd25+和cd8+cd25+/cd8+cd25+)中的每个的数据点显示在图13(a-c)中。图13中所示的拟合图显示了这3个亚群之间活性的显著差异。在通过拟合使得能够量化活性后，可以理解这种差异。下表1显示每个t细胞亚群的标准活性值；效力或ic50，诱导50％肿瘤细胞杀伤的浓度(激活的t细胞数量)。e0或在拟合曲线在x轴上过零的点处(即在不存在t细胞的情况下)的存活％与未添加激活的t细胞的对照孔相似但不相同。emax或激活的t细胞最大剂量时的存活％。auc(曲线下面积)积分了拟合曲线下的面积(限制在0到1000个t细胞之间，以避免在非常大且不切实际的t细胞数量或比率下出现伪影)。auc捕获所有激活的t细胞的总体累积活性。cd8+cd25+相比于cd4+cd8+的效力显著更高：67比336，或5倍。这意味着为了杀伤相同数量的肿瘤细胞，cd8激活的t细胞与cd4激活的t细胞相比，t细胞的需要少5倍。然而，cd8亚群使13.7％的肿瘤细胞存活，而cd4亚群杀死所有肿瘤细胞。cd8的auc显著小于cd4的auc。等比例的cd4/cd8混合物具有中间值。因此，cd8+cd25+在杀死癌细胞方面表现更好，尽管cd4+cd25+亚群在杀死所有癌细胞方面增加了额外的活性，包括在这24小时内cd8+cd25+细胞无法杀死的一些(13.7％)。

表1

该实施例显示了建模方法(其在免疫肿瘤学离体测定中很少使用)的能力。通过这些模型对癌症杀伤活性进行定量，使离体检测更加精确，使其成为筛选新icf和/或免疫调节剂和icf和/或免疫调节剂组合的更好检测方法，更好的测定以个性化免疫肿瘤药物治疗(单独或组合)，以及更好的测定以鉴定用于自体细胞疗法的适当的癌症杀伤t细胞(单独或组合)。药效学建模和模拟已广泛应用于药物开发的不同阶段。参见，例如，uptonrn(2014)和moulddr(2013)。

在肿瘤学中也描述了多种应用。参见，例如，buil-brunan(2016)。本文描述的是表征免疫调节和肿瘤细胞消耗活性的药效学建模和模拟策略。结构模型可以通过线性，s形或对数线性模型以及包括协变量研究来涵盖标准应答暴露关系。参见，例如，uptonrn(2014)，moulddr(2013)和theguidanceforindustrypopulationpharmacokinetics(1999)。

例如，上述模型评估t细胞激活与肿瘤细胞消耗之间的关系，以及这些变量与药物浓度的直接关系。另外的模型使用如上所用的激活的细胞研究最终应答与相对e∶t比率的关系，或激活的t细胞(cd8+cd25+或cd4+cd25+)的最大数量与基础母细胞的比率，或特定参考药物浓度点(包括本文所提出的有效e∶t比)的激活的t细胞和消耗的母细胞的比率。将考虑作为不同药物暴露水平或不同孵育时间的作用的不同协变量来开发模型。这些模型允许估计典型的群体参数以及每个个体的活性的准确估计。

如上实施例所示，也存在一些不测量多个e∶t比率的建模方法。例如，当仅使用来源于利用picf进行初始孵育而不添加第二部分样品变化条件的数据时。在这些情况下，若干参数中只有一个值，例如有效e∶t比率可用。然而，该数据比对样品的第二部分混合不同的e∶t比率具有更少的操作，因此也被考虑。通过单样品设计可以克服每个样品只有一个比率可用的可能限制，其中来自每个样品的单个数据点有助于建立对所有样品有效的连续模型函数。

实施例7-通过测量剂量应答曲线中icf和/或免疫调节剂对由picf诱导的激活的t细胞的作用来测量它们的活性

本文描述了示例性免疫调节剂，例如，并且包括免疫检查点抑制剂(pd1或ctl4)，treg抑制剂和mdsc抑制剂。

如上所述的类似方案(在与picf孵育后添加第二患者样品(例如相同患者样品的第二等分试样)，产生激活的癌症杀伤t细胞)用于评估免疫-肿瘤学应答的其他组分。可以添加本文所述的e∶t比率，并且还可以包括潜在的icf或免疫调节剂。

无论该分子本身是否具有增强癌症杀伤活性的活性，该方案都是适用的。一旦picf产生激活的t细胞，就可以更好地观察到这种活性。例如，免疫检查点分子例如pd1或ctl4仅在与picf孵育数天后才在t细胞的细胞表面上表达。因此，合适的测定是在其靶标已在t细胞表面上表达后添加免疫检查点抑制剂，例如抗pd1抗体。例如，剂量应答曲线可以在有或没有免疫检查点抑制剂(例如抗pd1抗体)剂量的情况下测量。如果添加这种抗pd1抗体增强对肿瘤细胞的免疫应答(通过增加cd4和/或cd8激活的细胞的数量，和/或通过改善e∶t比率，和/或通过增强这些t细胞的杀伤活性)，免疫检查点抑制剂例如抗pd1抗体被认为是icf。活性的增强可以通过如实施例6中所示的药效学模型中的特定参数(例如ec50，emax和auc)来测量。如果例如抗pd1抗体的分子增强癌症杀伤t细胞的活性，则其被认为是icf。

如上所述，不同的icf或免疫调节剂作用于除激活的t细胞或肿瘤细胞之外的细胞类型。实例是称为treg的免疫抑制性调节性t细胞和髓源性抑制细胞(mdsc)。为了测量这些化合物作为icf或免疫调节剂的活性，可以使用相同的测定，即将固定剂量的这些化合物加入到激活的t细胞的剂量应答中。有时，这些离体样品中treg和mdsc的数量可能低或不足以进行此类测量。在这些情况下，可以通过向样品的第二部分添加固定量的treg或mdsc或两者来进一步扩展该方案，其足以适当地测量这些icf和免疫调节剂化合物的作用。

在一些实施例中，可以将分选的和/或纯化的treg和/或mdsc(其负调节t细胞的细胞毒性作用或细胞扩增)添加到共培养物中。一旦不同的群体(bite暴露后的激活的t细胞，treg或mdsc)进行facs分选，分选的细胞可以在共培养实验中混合，改变彼此的比率(t细胞：treg：母细胞；或t细胞：mdsc：母细胞)并评估t细胞的裂解能力，例如在冷冻小瓶中在这些抑制细胞存在下。

此外，可以将免疫检查点抑制剂(例如，如本文所述，例如pd-1和/或ctl4的抑制剂)添加到不同的共培养模型中以评估它们的作用，例如，评估它们增强母细胞裂解或t细胞扩增的能力。

本文描述的方法是筛选新icf或免疫调节剂，将它们彼此直接比较或以各种组合(例如，它们之间和/或与其他类型的分子例如标准护理)进行比较的有效测定。

实施例8-选择和/或富集激活的ctl

在该实施例中，证明了选择和富集激活的ctl群体的能力。从诊断为aml的患者获得两个bm样品。样品均来自18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。

制备并测试每个样品的一部分以确定存在的激活的ctl的基础数量。在分析之前，裂解rbc并将定义活性ctl群体的抗体加入板(cd138-pe(cytognos，ref：cyt-138pe4，克隆b-a38)/cd38percp(immunostep，ref：38pp-100t，克隆gr7a4)/cd45-pb(bd-pharmingen，ref：560367，克隆30-f11)/cd56-apc(bd-pharmingen，ref：341027，克隆ncam16，2)/cd3pe(cytognos，ref：cyt-3pe5，克隆33-2a3)/cd4pb(immunostep，ref：4cfb-100t，克隆hp2/6)/cd8fitc(cytognos，ref：cyt-8f8，克隆ucht-4)/cd25apc(biolegend，ref：302610，克隆bc96)/cd69percp(biolegend，ref：310928，克隆fn50))中，以监测凋亡水平，还加入膜联蛋白v-fitc(immunostep，ref：anxvf)。使用基于exvitech流式细胞仪的平台分析平板。参见，例如，us8,703,491，us8,313,948和bennettta(2014)，其通过引用并入本文。

将骨髓样品以其整体用培养基稀释(即，不首先从bm中分离细胞或其他组分)，并铺板到96孔板中，所述孔含有cd123/cd3bsmab(creativebiolabs，shirley，ny)，对照抗体，或两者都没有，所有条件一式两份进行测试。将样品孵育120小时以促进样品中ctl的增殖。在孵育期结束时，如上所述处理板并使用exvitech进行分析。另外，使用facsariaiii流式细胞仪(bd，sanjose，ca)通过荧光激活细胞分选(facs分选)对每个样品的一部分进行分选，以富集激活的ctl群体。门被设定为分选cd5和cd25两者皆阳性的细胞。

结果显示在图14中，其中来自样品1的点图显示x轴上的cd5强度和y轴上的cd25强度。图14a是基点，显示非常低水平的cd5+cd25+细胞(右上象限)。图14b显示了与cd123/cd3bsmab一起孵育后的样品，其中大部分细胞是激活的ctl，但仍存在其他细胞亚型。在对该群体进行分选后(图14c)，超过99％的细胞是激活的ctl。每个样品和每种条件的cd5+和cd25+细胞的百分比显示在图14d中。这表明如何通过选择性分选产生和富集激活的ctl。

实施例9-胞啃癌症杀伤t细胞的作用

该实施例描述了bsmab作为picf对来自aml样品的母细胞的用途。从aml样品产生激活的t淋巴细胞，其中含有恶性细胞和正常细胞的白细胞群先前被分离并冷冻保存。样品来自18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。

将样品解冻并与含有cd123/cd3bsmab(creativebiolabs，shirley，ny)的培养基混合。将样品在37℃在含有5％co2的潮湿空气中孵育120小时。cd3臂结合并帮助激活t细胞，而cd123臂结合恶性aml细胞，使其接近现在激活的ctl。

孵育后，洗涤样品，然后暴露于一组抗体以鉴定已经经历过胞啃作用的激活的ctl和没有经历过胞啃作用的ctl。使用的抗体混合物是cd3pb(bd-pharmingen，ref：558117，克隆ucht1)，cd25apc(biolegend，ref：302610，克隆bc96)和cd123(参照)以及膜联蛋白v-fitc(immunostep，ref：anxvf)。cd3和cd25将鉴定ctl，并且cd123是恶性aml细胞上的标志物，如果存在于ctl上则表示胞啃ctl。通过荧光激活细胞分选(facs分选)，使用facsariaiii流式细胞仪(bd)将样品分选成两个群体：cd3+cd25+cd123-(图15a)和胞啃cd3+cd25+cd123+(图15b)。分选细胞群的纯度高于99％。一旦效应t细胞被纯化，就将来自同一患者的新的冷冻保存小瓶解冻以评估分选的群体的细胞毒性。

将来自两个群体(cd123+和cd123-)的相同数量的效应t细胞与来自含有恶性母细胞的新解冻样品的细胞混合。将两种细胞类型(效应细胞和靶标)在37℃在含有5％co2的潮湿空气中在不存在cd123/cd3bsmab的情况下接种用于另外24小时孵育。从图15c中可以看出，胞啃ctl(cd123+)群体比cd123-细胞群体杀死了多大约10％的恶性母细胞(61％对72％存活)。由于这个简单的制剂赋予了一些优点，该实验的不同参数的优化可以显示出更明显的优点。

实施例10-bsmab诱导的ctl产生和aml母细胞消耗的患者间变异性

该实施例评估cd123/cd3bsmab(creativebiolabs，shirley，ny)对来自aml患者的17个bm样品的离体作用。所有样品均来自18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。

收集后24-48小时内收到样品。将bm以其整体用培养基稀释(即，不首先从bm中分离细胞或其他组分)，并铺板到96孔板中，所述孔含有cd123/cd3bsmab，对照抗体，或两者都没有，所有条件一式两份进行测试。将样品孵育72，96或120小时。在分析之前，裂解rbc并将定义活性ctl群体的抗体(cd3pb(bd-pharmingen，ref：558117，克隆ucht1)/cd4-pecy5(biolegend，ref：317412，克隆okt4)/cd5-pecy7(biolegend，ref：300622，克隆ucht2)cd8apc(bd，ref：555369，克隆rpa-t8)/cd25apch7(bd-pharmingen，ref：560225，克隆m-a251)/cd45-po(invitrogen，ref：mhcd4530，克隆hi30))和aml母细胞群体(cd33pe(bd-pharmingen，ref：555450，克隆wm53或cd117-pe(biolegend，ref：313204，克隆104d2))加入板中，以监测细胞凋亡水平，还添加膜联蛋白v-fitc(immunostep，ref：anxvf)。使用基于exvitech流式细胞仪的平台分析平板。参见，例如，us8,703,491b2，us8,313,948b2和bennett等.clin.lymphoma，myeloma，andleukemia.14.4(2014)：305-18，通过引用并入本文。

cd123/cd3bsmab结合髓样细胞(包括恶性aml母细胞)上的cd123并识别t细胞上的cd3。cd3的结合和aml母细胞的接近激活ctl，导致aml母细胞的裂解。由于来自aml患者的bm样品含有aml母细胞和t细胞，因此可以在每个样品中同时测量bsmab对两个群体的作用。cd123/cd3bsmab以时间和剂量依赖性方式显示aml母细胞杀伤(图16a)。类似地，还存在时间和剂量依赖性t细胞激活和ctl增殖(图16b)。图中的每一行代表一个患者。从这些结果可以看出，在母细胞消耗(a)的动力学和效率以及clt群体(b)的增殖方面存在非常高水平的患者间变异性。这种类型的动力学分析(其中药理学数据可以在几个时间段内从剂量-应答数据(例如ec50和emax)确定)可以用作bsmab或其他icf的有效性的另一种定量评估。需要进一步开展工作以确定这些结果与患者的临床应答之间是否存在相关性，然而，这种类型的数据有朝一日可用于确定特定bsmab是否适合特定患者。

实施例11-最小残留病(mrd)样品中bsmab活件的测量。

从患有mrd的aml患者获得骨髓(bm)样品。样本来自18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。

在收到样品后测试样品，发现aml母细胞群少于单核细胞群的5％。将bm以其整体用培养基稀释(即，不首先从bm中分离细胞或其他组分)，并铺板到96孔板中，所述孔含有cd123/cd3bsmab，对照抗体，或两者都没有。由于样品的量很小，在3个时间点(72，96和120小时)仅测试单剂量(3μg/m1)的cd123/cd3bsmab。所有条件一式三份进行测试。

在分析之前，在每个时间点，裂解红细胞，并将定义恶性细胞群和ctl群的抗体加入板中：cd3pb(bd-pharmingen，ref：558117，克隆ucht1)/cd45-po(invitrogen，ref：mhcd4530，克隆hi30)/膜联蛋白v-fitc(immunostep，ref：anxvf)/cd117-pe(biolegend，ref：313204，克隆104d2)或cd33pe(bd-pharmingen，ref：555450，克隆wm53/cd4-pecy5(biolegend，ref：317412，克隆okt4)/cd5-pecy7(biolegend，ref：300622，克隆ucht2)/cd8apc(bd，ref：555369，克隆rpa-t8)/cd25apch7(bd-pharmingen，ref：560225，克隆m-a251)。膜联蛋白v-fitc用以监测细胞凋亡水平。

使用基于exvitech流式细胞仪的平台分析平板。参见，例如，us8,703,491，us8,313,948和bennettta(2014)，其通过引用并入本文。使用基于前向散射(fsc)，侧向散射(ssc)和各种表面标志物的表达或缺乏表达的门控策略来鉴定细胞。

图17在y轴上表示aml母细胞(图17a)或激活的ctl细胞(cd25+，图17b)随时间(x轴)的绝对细胞计数。虚线表示没有bsmab的对照样品，实线表示cd123/cd3bsmab数据。从图17中可以看出，即使当肿瘤细胞的百分比在全样品中最低限度地表达时，仍然以时间依赖性方式产生激活的ctl(图17b)。另外，存在的少数母细胞也以时间依赖性方式消耗(图17a)。

实施例12.暴露于bsmab之前和之后人t淋巴细胞群的表征

该实施例评估bsmab暴露后人t淋巴细胞的表型。从4名被诊断患有aml的患者中提取骨髓(bm)样品。样品均来自18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。

将样品稀释于培养基(roswellparkmemorialinstitute(rpmi)1640(sigma，stlouis，mo)，所述培养基补充有20％(体积/体积)fbs(thermoscientific，waltham，ma)，2％hepes，1％抗生素(zellshield，labclinics，barcelona，spain)和1％l-谷氨酰胺200mm(lonzo，hopkinton，ma))中，以0.21875μg/ml的浓度加入cd123/cd3bsmab(creativebiolabs)。将样品孵育120小时以促进样品中ctl的增殖。

为了表征t细胞表型，使用以下标记抗体：cd4(immunostep，salamanca，spain)，cd27(bdpharmingen)，cd8(cytognos，salamanca，spain)，cd62l(bdpharmingen，)，cd45ra(quantobio，beijing，china)，cd5(biolegend，sandiego，ca)，cd25(biolegend，sandiego，ca)，ccr7(biolegend，sandiego，ca)，cd28(bdpharmingen)和cd57(bdbiosciences)。图18表示在bsmab暴露之前和之后杀死癌细胞的t细胞制剂。该图是所测试的样品之一，并且代表所有样品，因为它们之间仅有轻微的变化。显示了流式细胞术点图，每个表示轴上不同cd标志物的强度。在基础时间，在添加bsmab之前(图18a-d)，我们观察到非常少的cd25+细胞(图18a)。cd25是激活标志物，因此这种低表达是预期的。图18b显示样品中不同t细胞群表型的分布如下：46％初始t细胞(初始，cd45ra⁺/ccr7⁺/cd27⁺)，43％中枢记忆t细胞(cm，cd45ra-/ccr7⁺/cd27⁺)，9％效应记忆t细胞(em，cd45ra-/ccr7-/cd27^+/-)，和2％终末效应记忆t细胞(e，cd45ra⁺/ccr7^-/cd27^-)，也如别处所述(larbia2014)。图18c和18d显示标志物ccr7，cd62l，cd28和cd57的表达，其也对应于未激活的t细胞群中预期的表达。在与cd123/cd3bsmab孵育120小时后这些相同标志物的表达显示在图18e-h中。如图18e-h中所见，97％的细胞现在表达激活标志物cd25。各种亚群的分布也发生了重大转变(图18f)，90％的细胞现在落入中枢记忆t细胞群(cm，cd45ra^-/ccr7⁺/cd27⁺)。所有样品的这种分布相似，孵育后cm群体等于或大于90％。图18g显示ccr7表达保持高水平并且cd62l表达保持混合，但开始下降。在图18h中，cd28略微增加并且cd57表达大大增加，这也显示向激活的记忆细胞群的转变。

实施例13.使用生理相容性培养基(使用自体血浆)测量bsmab活性

为了评估生理学上更相关的培养基对picf(bsmab)活性的影响，来自aml受试者的一个骨髓bm样品在下列条件下一式两份进行测试：

i)培养基，其含有roswellparkmemorialinstitute(rpmi)1640(sigma，stlouis，mo)，补充有20％(体积/体积)fbs(thermoscientific，waltham，ma)，2％hepes，1％抗生素(zellshield，labclinics，barcelona，spain)和1％l-谷氨酰胺200mm(lonzo，hopkinton，ma)。

ii)培养基，其含有rpmi1640，补充有离心后获得的20％(体积/体积)自体血清，2％hepes，1％抗生素和1％l-谷氨酰胺200mm。

bm样品获自患有aml的18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。对于这两种条件，将8种浓度的cd123/cd3bsmab(creativebiolabs)在含有5％co2的潮湿空气中于37℃孵育72或120小时。

孵育后，进行利用膜联蛋白-vpb(immunostep，salamanca，spain)，cd45po(invitrogen，carlsbad，ca)，cd8-fitc(cytognos，salamanca，spain)，cd117-pe(bectondickinson，sanjose，ca)，cd4percp(biolegend，sandiego，ca)，cd5-pe-cya7(biolegend，sandiego，ca)和cd25-apc(biolegend，sandiego，ca)的多色流式组以同时评估母细胞消耗和t细胞激活。

如图19所示，在正常培养基(灰线)或补充有20％自体血浆(黑线)的培养基中，72小时或120小时(分别为图19a和19b)的两种测定条件下的母细胞消耗相似。然而，对于正常培养基(图19c)，在72小时观察到更高的t细胞激活(ctl)和/或扩增，但是在120小时(图19d)，两种条件都显示出类似的结果。

表2显示了量化方法，其显示在72小时时间点较低的有效e∶t比率，其中正常培养基(1∶8)相比于自体血浆培养基(1∶21)。尽管用自体血浆产生的ctl的数量较低，但它们在杀死与利用正常培养基产生的更多数量的ctl杀死的相同数量的肿瘤细胞方面同样有效。这表明，虽然血浆中的某些东西减少了产生的ctl数量，但它也产生了更有效的ctl。

然而，较长的孵育减少了有效杀伤能力的这种差异。可能，自体血浆ctl群体扩增开始得更慢，但随后有时间赶上。这说明使用更类似生理的培养基产生更有效地消除肿瘤细胞的ctl，并且可以提供关于患者如何应答治疗的更有价值的信息。

表2

实施例14.测量实体瘤样品中的bsmab活性

该实施例评估了epcam/cd3bsmab(g&pbiosciences，santaclara，ca)对从tumorbiobank(molecularresponse，sandiego，ca)获得的黑素瘤样品(同时存在癌细胞和自体t细胞)的离体作用。

将样品解冻并接种到96孔板中，所述孔含有3种不同浓度的epcam/cd3bsmab(3，2，1μg/ml)和对照抗体。将样品与培养基(其含有roswellparkmemorialinstitute(rpmi)1640(sigma，stlouis，mo)，补充有20％(体积/体积)fbs(thermoscientific，waltham，ma)，2％hepes，1％抗生素(zellshield，labclinics，barcelona，spain)和1％l-谷氨酰胺200mm(lonzo，hopkinton，ma))孵育。孵育144小时后，用0.05％胰蛋白酶/edta收获所有细胞，并通过离心旋降。在分析之前，添加多色流式细胞仪组以定义肿瘤和t细胞群：膜联蛋白v(immunostep)，cd45po(invitrogen)，cd8(cytognos)，tag72(bionova)，cd4(biolegend)，cd5(biolegend)，epcam(bd，biosciences)和cd25(biolegend)。

如图20所示，在存在epcam/cd3(灰色直方图)的孔中但不在对照孔中，肿瘤细胞以剂量依赖性方式被杀死(图20a)。此外，肿瘤细胞消耗的这种增加与t细胞上cd25激活标志物的增加有关(图20b)。

实施例15.aml样品中胞啃癌症杀伤t细胞的作用

该实施例证明经历过胞啃的激活的ctl具有高杀伤能力。

冷冻保存的aml样品用膜联蛋白v(immunostep)，cd45(invitrogen)，cd33(bd，biosciences)和cd5(biolegend)染色。使用facsariaiii流式细胞仪(bd，sanjose，ca)通过荧光激活细胞分选(facs分选)对活的母细胞(膜联蛋白-/cd45+/cd33++)和活t细胞(膜联蛋白-/cd45++/cd5+)群体进行分选，其中细胞纯度＞99％。样品获自被诊断患有aml的18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。

用细胞表面染料pkh67(sigmaaldrich，st.louis，mo)染色母细胞，并在存在或不存在cd123-cd3bsmab的情况下，以不同的效应细胞∶靶标比率一式三份与自体t细胞一起孵育144小时。pkh67是细胞膜标记染料。对于该特定测定，仅母细胞被染料染色而t细胞不染色。在bsmab暴露后，预期t细胞将在bsmab诱导的细胞间相互作用期间从母细胞中获得该标志物，这将显示已发生胞啃作用。

将细胞与培养基(其含有roswellparkmemorialinstitute(rpmi)1640(sigma，stlouis，mo)，补充有20％(体积/体积)fbs(thermoscientific，waltham，ma)，2％hepes，1％抗生素(zellshield，labclinics，barcelona，spain)和1％l-谷氨酰胺200mm(lonzo，hopkinton，ma))孵育。在分析之前，添加多色流式细胞仪组以定义肿瘤和t细胞群：膜联蛋白v(immunostep)，cd45(invitrogen)，cd8(cytognos)，cd33(bd，biosciences)，cd4(biolegend)，cd5(biolegend)和cd25(biolegend)。

图21a，21b和21c显示说明t细胞的胞啃能力的实验的流式细胞术点图(cd5/pkh67)。同时表示活母细胞和t细胞。图21a显示了在孵育前的基础时间的母细胞(pkh67++/cd5-，左上象限)和一些t细胞(pkh67-/cd5++，右下象限)的点图。此时，未观察到双阳性t细胞(pkh67++/cd5++)。图21b显示孵育后和不存在bsmab时母细胞(pkh67++/cd5-)和t细胞(pkh67-/cd5++)的点图。在此时间点和不存在bsmab时，未观察到双阳性t细胞(pkh67++/cd5++，右上象限)。图21c显示孵育后和bsmab存在下的母细胞(pkh67++/cd5-)和t细胞(cd5++)的点图。可以看出，大多数激活的t细胞(ctl)出现在右上象限，表明它们在与肿瘤细胞的相互作用中拾取了跟踪染料。在该样品中产生的胞啃ctl在存在bsmab的情况下cd5++群体的比例为78％，而对照仅为9％。

来自相同aml患者的第二冷冻保存的管用于以剂量-应答方式量化母细胞的消耗和t细胞激活。用上述相同的培养基稀释样品，并加入含有8种不同浓度的cd123/cd3bsmab(0.5，1，10，50，100，250，500和1000ng/ml)的板中。将板孵育144小时。在分析之前，将上面使用的相同的多色流式细胞术标志物组添加到板中以鉴定肿瘤细胞和ctl群体。图22a显示cd123/cd3bsmab如何以剂量-应答方式诱导ctl群体的增加，其对应于母(肿瘤)细胞的剂量-应答消耗。该样品的有效e∶t比率为60∶6,000或1∶100，证明产生的ctl在杀伤肿瘤细胞方面非常有效。有效e∶t比率可以证明是用于确定bsmab或其他icf活动对每位患者的稳健性的额外工具。

实施例16.癌症杀伤t细胞的药理学活性的离体测量

有四个参数可定量测量患者样品中由picf产生的癌症杀伤t细胞的活性，并确定用于细胞疗法的癌症杀伤t细胞的药理学活性。

t细胞增殖的ec50对应于产生50％的激活的癌症杀伤t细胞的picf的浓度。图16b显示来自若干个独立受试者的激活的t细胞的作为picfbsmabcd3xcd123剂量的函数的叠加剂量应答曲线。注意，t细胞激活的ec50类似于癌细胞消耗的ec50(图16a)，因为它们代表相同的过程：picf如何诱导激活的t细胞变成消耗癌细胞的癌症杀伤细胞。在本说明书的图6，7和8中也可以观察到t细胞激活和癌细胞消耗的ec50之间的这种等效性。

在被诊断患有相同疾病的多个患者样品中，t细胞激活的ec50非常相似(图16a和图16b)。因此，该参数仅针对ec50与大多数样品显著不同的少数情况提供患者敏感性的信息。如果ec50显著降低，则应解释为对于所述特定患者，t细胞将以较低剂量的picf激活。相反，如果ec50值显著更高，则解释是对于所述特定患者，t细胞将以更高剂量的picf激活，因此在孵育期间应使用更高剂量的picf以产生癌症杀死t细胞。

有效e∶t比率表示由picf产生的癌症杀伤t细胞的活性。因此，它是决定是否用通过本文公开的方法获得的激活的t细胞治疗患者的关键参数。该参数可以通过添加在与picf孵育后产生的精确数量的激活的癌症杀伤t细胞(先前通过facs分选分离，如图12和13所示)测量剂量应答来验证。

高的有效e∶t比率预测对作为自体细胞疗法的这些癌症杀伤t细胞敏感的患者，并且低的有效e∶t比率预测对作为自体细胞疗法的癌症杀伤t细胞抗性的患者。

emax或效力测量在高剂量picf下存活的癌细胞％。该参数取决于孵育时间，并且对于关于t细胞治疗的临床决定，需要长的孵育时间，其中激活的t细胞杀死大多数样品的所有癌细胞；以此孵育时间，显示癌细胞抗性亚群的小样品亚群具有临床信息性。对于这些癌症杀伤t细胞而言激活的癌症杀伤t细胞必须杀死100％的癌细胞以适合于用于患者的单一疗法治疗。相反，如果激活的t细胞不能杀死所有癌细胞(图16a)，并且存在一部分抗性癌细胞，则预测作为单一疗法的癌症杀伤t细胞将使这些癌细胞存活，因此其不会被认为是适当的治疗。在治疗中可以组合其他药物或其他icf，这将逆转癌细胞的抗性表型。

当此种癌细胞亚群被鉴定为对癌症杀伤t细胞具有抗性时，这些抗性癌细胞是免疫抑制的，因为其对激活的自体t细胞疗法具有抗性。因此，添加额外的免疫调节剂如免疫检查点抑制剂可以克服免疫抑制并因此克服癌细胞对治疗的抗性。这些额外的免疫调节剂可以两种不同的方式添加：

a)离体添加以减轻免疫抑制并使得能够产生完全细胞毒性的癌症杀伤t细胞。这对于为随后的细胞疗法产生的癌症杀伤t细胞特别有意义。其可以添加到用picf孵育的相同孔中，或者在与picf孵育后的第二步中添加。离体添加免疫调节剂使得多种药剂的组合成为可能，包括具有多种作用机制的药剂，这可以是多达5种，10种或20种药剂。这些数字远高于通常可以体内同时施用给临床患者的2-3种免疫治疗药物(毒性限制了多免疫疗法)。因此，用于细胞疗法的癌症杀伤t细胞的离体产生能比直接患者临床药物治疗更好地利用多免疫疗法。

b)能与细胞疗法组合施用给患者，以致其减轻患者体内的免疫抑制。这对于癌细胞上的靶标尤其有意义，所述靶细胞使得这些癌细胞对作为对患者施用的细胞疗法的癌症杀伤t细胞具有抗性。

上述用于测量癌症杀伤t细胞活性的3个参数中的任何一个可以作为孵育时间的函数而变化，并且因此反应的动力学也可以提供有意义的信息。时间依赖性参数反映了这些过程的动力学。下面描述了一些有意义的解释的例子。

图16显示对于相同的bsabcd3xcd123，aml样品间t细胞激活和癌细胞消耗的动力学和效率方面存在非常高水平的患者间变异性。

能够更快地杀死癌细胞的癌症杀伤t细胞可能是更有效的细胞疗法。更快的活性可以意味着针对患者癌症的更快作用，这是反映更高的敏感性的积极结果。如果癌症杀伤t细胞是通过mhc-i机制识别癌细胞的cd8+肿瘤特异性抗原t细胞，更快的活性可以还意味着对癌细胞的更高亲和力。图11显示了来自给定样品的癌症杀伤t细胞的癌细胞杀伤动力学。

当t细胞在较早的时间点被picf激活时，可能需要一些分开的循环以使其杀伤效力最大化。另一方面，在癌症杀伤t细胞杀死癌细胞并且不再有癌细胞后，这些t细胞变得衰竭，数量，激活状态和杀伤能力急剧下降。有时存在癌细胞抗性亚群，其不能通过增加孵育时间被杀死，但是癌症杀伤t细胞确实识别其并诱导自身增殖，从而增加癌症杀伤t细胞的数量而不改变癌细胞的数量因此在这些较长的孵育时间内改变有效e∶t比率。因此，为了测量癌症杀伤t细胞的活性，重点关注激活后(此时增殖与癌细胞杀伤相关)以及在其达到衰竭或发现t细胞抗性癌细胞亚群之前的时间。

为了证明这些概念，13个aml骨髓样品获得自18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。将样品与培养基一起孵育72，96或120小时，并加入含有8种不同浓度的cd123/cd3bsmab的板中。请注意，并非所有患者在所有时间都进行分析。孵育后，进行利用膜联蛋白-v(immunostep，salamanca，spain)，cd45(invitrogen，carlsbad，ca)，cd8(cytognos，salamanca，spain)，cd117(bectondickinson，sanjose，ca)，cd64(biolegend，sandiego，ca)，cd34(bectondickinson，sanjose，ca)，cd33(bectondickinson，sanjose，ca)，hla-dr(immunostep，salamanca，spain)，cd4percp(biolegend，sandiego，ca)，cd5-pe-cya7(biolegend，sandiego，ca)和cd25-apc(biolegend，sandiego，ca)的多色流式组以同时评估母细胞消耗和t细胞激活。每种特定样品使用适当的母细胞标志物。

表3显示了cd8+ctl和肿瘤细胞的ec50，emax(msmab的最高浓度下的绝对细胞计数)和e0(不存在bsmab时的绝对细胞计数)的统计参数。从表3和图23中可以看出，ctl和肿瘤细胞群的ec50相似。图23a显示每个时间点的每个样品的ctl和肿瘤细胞群的ec50，其显示一些一致性，但是在所有时间点都可以看到变化。个体差异是预期的，然而图23b显示每个群体以及每个时间点的中值ec50值非常相似。

通过计算效应细胞的绝对计数的变化和靶细胞的绝对数量的变化来确定有效e∶t比率。emax和e0值用于将其量化。在此效应细胞是ctl群体，靶标是肿瘤细胞。有效e∶t比率表示由icf(例如bsmab)诱导的值的变化。

图24显示了来自上面的5个代表性aml样品的t∶e比例的一个版本。y轴显示各时间点(72，96或120小时)每个效应细胞存在的靶细胞数量(t/e)。当cd8+ctl随时间增加，通常在较长的孵育时间内存在有效t∶e比率的降低。

该实施例证明了在可发生肿瘤消耗和t细胞扩增的细胞培养模型中定量地测量癌症杀伤t细胞活性的相关性。以动力学方式分析多个关键参数，包括ec50，emax和有效e∶t比率，为肿瘤和ctl群体提供了有价值的信息。生成的数据提供了一个强大的工具来量化icf的活性和有效性。

表3

实施例17：骨髓相比于外周血样品中的癌症杀伤t细胞的离体活性

该实施例评估了10对bm和pbaml样品(5对bm和pb)中ctl的细胞毒性能力。样品获得自18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。收集后24-48小时内收到样品。将bm样品以其整体用培养基稀释(即，不首先从bm中分离细胞或其他组分)，并铺板到96孔板中(所述孔含有8个浓度的bsmab和对照抗体)72小时。

孵育后，进行利用膜联蛋白-v(immunostep)，cd45(invitrogen)，cd8(cytognos)，cd117(bectondickinson)，cd64(biolegend)，cd34(bectondickinson)，cd33(bectondickinson)，hla-dr(immunostep)，cd4(biolegend)，cd5(biolegend)，cd25(biolegend)，cd138(cytognos)，cd38(immunostep)，cd45(bd-pharmingen)，cd56(bd-pharmingen)，cd19(biolegend)和cd3(cytognos)的多色流式组以同时评估肿瘤消耗和t细胞激活。每种特定样品使用适当的肿瘤标志物。

本发明人假设picf可以激活免疫抑制的肿瘤特异性抗原(tsa)t细胞，并且这些激活的t细胞比也被picf激活的其他正常t细胞具有更高的癌细胞杀伤作用。另外，其还描述了存在于具有三维结构的组织例如骨髓(而不是外周血)中的免疫抑制微环境。然后，如果该假设是正确的，则骨髓样品中癌症杀伤t细胞的活性应高于同一癌症患者的外周血样品中的活性。

来自5名aml患者的来自(相同患者的)骨髓和外周血的配对样品与cd3xcd123一起孵育。图25显示了每个患者的两个配对样品(s1-s5，上图和下图)中t细胞激活和癌细胞消耗的剂量-应答曲线。对于相同患者的每个血液和骨髓样品，在ec50和emax方面观察到类似的模式。不同的样品确实表现出不同的行为，特别是在其emax方面。

通过包括在图25和下表4的每个图中的有效e∶t比率计算癌症杀伤t细胞的活性。在样品1，4和5中，骨髓样品具有比其对应的血液对应物更高的有效e∶t比率。样品2和3的骨髓样品在骨髓和血液中具有相同的有效e∶t比率。因此，证实了预期结果，即骨髓癌杀伤t细胞具有比其血液对应物更高或相似的癌症杀伤活性，而不是更少。该模式可能反映了可被picf激活的免疫抑制tsat细胞的存在，表明骨髓样品中这些t细胞的存在更高，骨髓中的有效e∶t比率与血液配对样品相比更高。这可能类似于作为免疫疗法反应的已知临床预测因子的实体瘤样品中％til的测量值。

表4

实施例18：癌症杀伤t细胞的离体选择性杀伤

该实施例评估了ctl对来自两个mm和两个aml患者的残留正常细胞的选择性能力。样品获得自18岁以上的成年患者，他们提供了研究参与知情同意书。收集后24-48小时内收到样品。将bm样品以其整体用培养基稀释(即，不首先从bm中分离细胞或其他组分)，并铺板到96孔板中(所述孔含有8个浓度的bsmab和对照抗体)72小时。

孵育后，进行利用膜联蛋白-v(immunostep)，cd45(invitrogen)，cd8(cytognos)，cd117(bectondickinson)，cd64(biolegend)，cd34(bectondickinson)，cd33(bectondickinson)，hla-dr(immunostep)，cd4(biolegend)，cd5(biolegend)，cd25(biolegend)，cd138(cytognos)，cd38(immunostep)，cd45(bd-pharmingen)，cd56(bd-pharmingen)，cd19(biolegend)和cd3(cytognos)的多色流动组以同时评估肿瘤消耗，t细胞激活和残留正常细胞。后一群体对应于aml患者的b细胞(cd19+)和mm患者的粒细胞(cd45+/sschigh/fschigh)。每种特定样品使用适当的肿瘤标志物。

发明人假设picf可激活血液系统恶性肿瘤骨髓样品中的免疫抑制的肿瘤特异性抗原(tsa)t细胞，这与双特异性抗体以非抗原依赖性作用机制通过使t细胞接近癌细胞而激活t细胞的一般理解相反。如果激活的t细胞是tsat细胞，其应该选择性识别并杀伤癌细胞。相反，如果激活的t细胞以非选择性非抗原依赖性方式杀伤，其也应该杀伤非病理细胞。这可以在用于mm(图26)和aml(图27)的picf双特异性抗体的孵育实验中评估，所述实验同时分析其相应的非病理细胞与癌细胞。

图26显示了两个mm骨髓样品(a和b)，其中picf诱导t细胞激活(cd8+cd25+)和癌细胞杀伤(肿瘤细胞减少)。当将粒细胞群添加到这些图中时，就数量最多的非病理细胞而言，在与picf孵育后其数量保持非常相似而没有被显著杀伤，而癌细胞被杀伤。这些样品的每个孔中的大量粒细胞(分别为约22.000和11.500)表明该结果在统计学上非常显著。这些结果显示癌症杀伤t细胞选择性地杀伤癌细胞。

图27显示了两个aml骨髓样品(a和b)，其中picf诱导t细胞激活和癌细胞杀伤。当将b细胞群添加到这些图中时，就数量最多的非病理细胞而言，在与picf孵育后其数量不显著减少，而癌细胞被杀伤。较低数量的b细胞(分别约450和200)在统计学上不如mm样品中的粒细胞显著，但与mm结果一致。这些结果显示癌症杀伤t细胞选择性地杀伤癌细胞。

等同物

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