IL-12作为替代免疫治疗剂的用途的制作方法

本申请要求于2016年7月18日提交的美国临时专利申请号62/363,648的优先权，其全部内容通过引用并入本文。本公开内容总体涉及将il-12用于替代免疫疗法的方法和组合物。
背景技术：
：以下包括可用于理解本公开内容的各个方面和实施方案的信息。并非承认本文提供的任何信息是现有技术或与目前描述或要求保护的发明相关，也非承认任何明确或隐含引用的出版物或文献是现有技术。白细胞介素-12(il-12)是一种包含p40和p35亚基的异二聚体细胞因子，因其在免疫中的作用而为人周知。在跨越约二十年的许多报告中，已经显示il-12调节炎症反应、对感染的先天抗性以及适应性免疫，并由此在先天免疫与适应性两者之间的相互作用中发挥重要作用。内源性il-12对于抵抗许多病原体以及可移植性肿瘤和化学诱导的肿瘤是必需的。il-12在免疫中的标志性作用在于其刺激从自然杀伤(nk)细胞、巨噬细胞和t细胞产生干扰素-γ(ifn-γ)的能力。进一步地，据90年代早期到中期的几项体外研究报道，il-12能够与其他细胞因子协同刺激血细胞生成。il-12的血细胞生成促进活性似乎是归因于对骨髓干细胞的直接作用，因为这些研究使用的是高度纯化的祖细胞或甚至单细胞。ifn-γ在il-12的造血活性中的作用尚不明确，因为一些研究显示血细胞生成的促进和抑制都与ifn-γ有关。据显示，当在暴露于全身辐射之前或之后较短时间内使用il-12时，其具有辐射防护功能。il-12保护骨髓免受电离辐射的损伤并使肠道对电离辐射敏感。在电离辐射后，il-12促进内源性血细胞生成的恢复和干细胞的植入。il-12是一种充分表征的细胞因子。在1989年，il-12被geneticsinstitute,inc.和thewistarinstituteofanatomyandbiology独立鉴定为自然杀伤细胞刺激因子(nksf)。在1990年，il-12被hoffmann-laroche,inc独立鉴定为细胞毒淋巴细胞成熟因子(clmf)。在1991年，geneticsinstitute,inc克隆了il-12cdna并将其命名为白细胞介素-12。在1993年，发现了il-12在调节和桥接先天免疫和适应性免疫方面的中心作用。在1995年，发现了il-12的抗血管生成特性。在1996年，hoffmann-laroche,inc.对il-12受体进行了表征。从1993年到2002年，il-12在包括黑素瘤、乳腺癌、结肠癌、肾癌和肉瘤模型在内的鼠模型中广泛地显示出抗肿瘤和抗转移活性。从1997年到2004年，在癌症患者中对il-12为主的单一疗法进行了探索。除ctcl、aids相关的卡波西肉瘤、nhl和黑素瘤外，其作为单一药剂的疗效很小。对癌症患者的临床疗效有限的原因在于所使用的高重复剂量方案导致快速耐受(减敏)。从2003年到2007年，neumedicinesinc.发现单次低剂量的il-12促进小鼠在致死电离辐射后的内源性血细胞生成的恢复。从2005年到2008年，neumedicinesinc.证明了其在骨髓抑制的荷瘤鼠模型系统中的促血细胞生成和抗肿瘤活性(造血免疫治疗作用)。从2008年至今，启动了开发il-12作为辐射医疗对策的neumedicines-barda合作。从2009年到2014年，neumedicinesinc.证明了il-12作为辐射医疗对策在猴子中的疗效(造血作用)，并证明了在健康志愿者中的安全性。本领域需要治疗具有潜在免疫抑制的各种疾病和伤口的方法，该疾病和伤口的相关之处在于它们均导致内源性il-12表达的抑制。技术实现要素：本公开内容提供了施用il-12作为替代免疫治疗剂的方法，该方法包括(a)鉴定有需要的受试者，其中所述受试者患有导致内源性il-12表达的抑制的疾病或伤口；以及(b)向所述受试者施用一个或多个生理剂量的外源性il-12。内源性il-12表达的抑制可导致包括抗原呈递细胞和树突细胞在内的关键免疫细胞的抑制。在本发明的一个方面，在施用一个或多个生理剂量的外源性il-12之前，待治疗的患者群体具有小于约5pg/ml或小于约1pg/ml的il-12表达水平。通常，待治疗的患者将具有小于1pg/ml的il-12表达水平或将具有低于检测下限(llod)的表达水平。在本发明的一个实施方案中，生理剂量的外源性il-12的施用恢复内源性il-12多效免疫和造血作用，包括与内源性il-12表达相关的多效性修复反应、抗感染反应和抗肿瘤反应。此外，施用生理剂量的外源性il-12可导致患有慢性病和伤口的受试者的结果改善。在本发明的另一个实施方案中，外源性生理剂量的il-12在外周血中产生一定范围的nm-il-12，如通过针对il-12p70的标准elisa所测量的，该范围大于约5皮克/ml且小于约200皮克/ml。受试者外周血中可测量水平的il-12还可显示出外周血中ifn-γ的伴随增加，此外，给药后伴随的ifn-γ水平可在约20pg/ml直至约1000pg/ml的范围内。进一步地，il-12的外源性生理剂量可大于约1μg且小于约20μg、大于约8μg且至多约15μg，或大于约10μg且至多约12μg。在另一个实施方案中，在疾病或伤口的治疗过程中，可以给予受试者两种生理剂量水平的il-12：治疗剂量和维持剂量。这两种类型的剂量可以相同或不同。例如，il-12的治疗剂量可大于约1μg且小于约20μg；并且/或者il-12的维持剂量可大于约1μg且小于约10μg。进一步地，可约每2周、约每3周或约每4周给予所述治疗剂量的il-12；并且/或者可约每1个月、约每2个月或约每3个月给予所述维持剂量的il-12。所述一个或多个生理剂量的il-12可以通过任何药学上可接受的手段施用，包括但不限于局部、皮下、静脉内、腹腔内、肌内、硬膜外或肠胃外施用。所述nm-il-12可以是重组人il-12，例如rhuil-12。在本发明的一个实施方案中，所述受试者患有慢性肾病，并且施用外源性il-12导致肾的修复和再生，从而减慢ckd的进展。ckd进展的减慢可以通过例如受试者的以下一项或多项来证明：肌酸酐减少、血尿素氮(bun)减少、蛋白尿减少或肾小球滤过率(gfr)增加。例如，与没有施用外源性il-12时观察到的进展相比，施用外源性nm-il-12可使ckd的进展减慢约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。外源性il-12的施用可以与针对ckd的常规治疗联合使用。在本发明的另一个实施方案中，所述受试者具有伤口，并且施用外源性il-12导致促进细胞向组织中迁移以帮助伤口愈合和组织修复，并因此产生伤口的加速愈合。所述受试者可以是具有伤口的任何人，包括但不限于老年受试者、糖尿病受试者或具有手术伤口的受试者。在其他实施方案中，所述受试者是老年受试者并患有压力性溃疡，或者所述受试者是糖尿病受试者并患有足溃疡。与没有施用外源性il-12时观察到的愈合速率相比，施用外源性nm-il-12可导致伤口愈合加速约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。外源性il-12的施用可以与针对伤口的常规治疗联合使用。在一个实施方案中，所述受试者患有年龄相关性黄斑变性(amd)，并且施用外源性il-12导致减慢或逆转amd进展。例如，amd的进展可被il-12的以下作用减慢或逆转：(i)减少新血管形成，因为il-12对多种血管生成因子具有广泛的抗血管生成作用；和/或(ii)通过补充衰老巨噬细胞来恢复免疫平衡。外源性il-12的施用可以与针对amd的常规治疗联合使用。在一个实施方案中，与没有施用外源性il-12时观察到的进展相比，施用外源性il-12导致amd进展减慢或逆转约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在另一个实施方案中，il-12可以(i)经由任何途径施用；(ii)经由眼内途径以外的任何途径施用，(iii)经由皮下注射施用，或(iv)经由眼内注射施用。在另一个实施方案中，所述受试者患有骨质疏松症并且施用外源性il-12导致引发造血干细胞来再生和动员骨髓中的细胞。施用外源性il-12可导致减少骨丢失和/或减少破骨细胞形成。例如，与没有施用外源性il-12时观察到的情况相比，施用外源性il-12可导致骨丢失减少和/或破骨细胞形成减少约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。外源性il-12的施用可以与针对骨质疏松症的常规治疗联合使用。本文所述和要求保护的发明具有许多属性和实施方案，包括但不限于本
发明内容中提出或描述或引用的那些。本
发明内容并非旨在包括所有内容，并且本文所述和要求保护的发明不限于或不受限于
发明内容中所确定的特征或实施方式，其仅出于说明而非限制性的目的而被包括在内。另外的实施方案可在下面的具体实施方式中公开。附图说明图1：图示了nm-il-12是一种干细胞、造血细胞和免疫细胞因子，其具有再生(通过干细胞和祖细胞，起到补充所有血细胞谱系的作用)、根除(通过先天免疫(nk细胞)和适应性免疫(cd8+和cd4+细胞)根除病毒、细菌和肿瘤)，以及修复(伤口愈合、组织修复和免疫监视)的作用。图2：示出了在辐射暴露(例如，骨髓消融)后，在非人灵长类动物中的评估nm-il-12的非临床研究的图片(图2a)，显示出显著增强的细胞再生(图2b)。进一步地，在证明组织损伤的修复(图2c)中，nm-il-12在造口拆除(stomatakedown)患者中已经取得临床成功，该分子显示出对由手术切口造成的组织损伤显著地加速闭合(100％)(图2d)。最后，nm-il-12在根除肿瘤生长方面已经显示出临床成功，其中il-12用于治疗皮肤t细胞淋巴瘤患者(图2e)，导致根除和完全持久的应答(图2f)。图3：图示了nm-il-12如何通过刺激骨髓中的诸如cd34+细胞、干细胞、祖细胞、巨核细胞、淋巴母细胞、成粒细胞、未成熟nk细胞和网织红细胞等细胞而刺激血细胞生成。nm-il-12还促进细胞从血液向组织中迁移，以帮助伤口愈合和组织修复。图4：图示了nm-il-12在以下三种示例性疾病病况中诱导再生、根除和修复时的作用：糖尿病足溃疡(dfu)、慢性肾病(ckd)和骨质疏松症。图5：图示了nm-il-12在以下两种示例性疾病病况中诱导再生、根除和修复nm-il-12时的作用：弥漫性大b细胞性淋巴瘤(dlbcl)和年龄相关性黄斑变性(amd)。图6：图示了慢性病或衰老如何抑制关键免疫细胞即抗原呈递/树突细胞，抑制il-12产生，从而降低免疫能力。图7：图示了图6所示问题的解决方法，即使用il-12作为外源性nm-il-12，通过恢复关键免疫能力重新激起多效性修复反应、抗感染反应和抗肿瘤反应，从而改善患有慢性病、癌症、感染和衰老的患者的结果。图8：可视化地示出了nm-il-12如何作为替代免疫治疗剂通过与见于所有关键成熟免疫效应细胞上和骨髓的未成熟祖细胞和干细胞上的独特il-12受体相互作用来恢复内源性il-12多效免疫和造血作用(根据自lasek等人,cancerimmunol.immunother.,63:419(2014)修改)。图9：示出了epo的表达是由肾髓质小管引起的。示出了来自人皮层和髓质的载玻片，以及来自恒河猴髓质的载玻片，并说明il-12rβ2在人和恒河猴的髓质小管中表达，但在人皮质小管中不表达。图10：示出了单次低剂量的nm-il-12诱导恒河猴中的epo并导致网织红细胞(红细胞的前体)的增加。示出了以下3个治疗组的epo(pg/ml)与时间的关系：组1＝0ng/kgnm-il-12(n＝3)；组2＝50ng/kgnm-il-12(n＝3)；以及组3＝500ng/kgnm-il-12(n＝4)。该图中还示出了相同的3个治疗组的网织红细胞(％变化)与时间的图像。图11：示出了单次低剂量的nm-il-12(12μg)直接诱导人体内的epo。所示图像示出了以下两个治疗组的epo(pg/ml)随时间的变化：组1＝nm-il-12皮下施用，12μg单剂量，n＝4名受试者；和组2＝安慰剂，n＝8名受试者。图12：示出了发现单次低剂量皮下注射nm-il-12动员了循环的成熟外周血细胞和未成熟的cd34+造血祖细胞，用于体内需要的组织修复和再生。图12a-f示出了健康志愿者中12μgnm-il-12(48名受试者)或安慰剂(12名受试者)造成的血液学变化，图12a＝网织红细胞，图12b＝血小板，图12c＝cd34+细胞，图12d＝淋巴细胞，图12e＝嗜中性粒细胞，12f＝nk细胞。图13：可视化地示出了il-12在加速糖尿病患者和具有不愈合伤口的老年人的缓慢愈合伤口的闭合中的预期有用性。图14：在正常皮肤组织(图14a)和受伤的经照射皮肤组织(图14b和图14c)中显示证明了il-12在刺激伤口愈合中的先前未确定的作用。在经照射的皮肤中，发现il-12rβ2受体在真皮的基底膜(bm)和毛囊下的皮脂(se)腺中的祖细胞上高度表达。图15：示出了伤口面积(表示为第0天的百分比)与损伤后天数的图像，其中比较了通过向雄性和雌性小鼠局部施用媒介物或重组鼠il-12(15ng)而获得的结果。在损伤时和损伤后第3天和第6天，与媒介物治疗的小鼠相比，向被给予全身照射(tbi，500cgy)和全层皮肤损伤的雄性和雌性小鼠施用重组鼠il-12(rmuil-12，15ng，局部)显著加速了伤口愈合并使伤口完全闭合。通过学生t检验进行统计分析，*p≤0.05，**p≤0.01。图16：示出了伤口面积(表示为第0天的百分比)与损伤后天数的图像，其中在具有糖尿病背景的zucker大鼠中比较了通过局部施用媒介物和两种不同剂量的重组鼠il-12(rmuil-12，15和474ng，局部)而获得的结果。单次施用rmuil-12显著加速了全层损伤的愈合。通过学生t检验进行统计分析，*p≤0.05，**p≤0.01。图17：示出了以下4个治疗组的伤口面积(表示为第0天的百分比)与损伤后天数的图像：媒介物(局部)，15ngrmuil-12局部3x/天，15ngrmuil-12局部1x/天和20ngrmuil-12皮下(sc)1x/天。接受20ngrmuil-12皮下1x/天的动物显示出明显最快的伤口愈合，而接受15ngrmuil-12局部3x/天的动物具有第二快的愈合速率。通过学生t检验进行统计分析，*p≤0.05，**p≤0.01，***p≤0.001。图18：图18a示出了局部施加媒介物后的伤口的图片，而示出了伤口的显著愈合的图18b描述了通过皮下rmuil-12(20ng，产生于图17的数据)获得的结果。图19：示出了使用荧光寿命显微术获得的在愈合期间受伤皮肤中的代谢活动的动力学。荧光寿命(ps)与研究天数的图像示出了在愈合期间受伤皮肤中的代谢活动的动力学。在第2天，与有伤口的安慰剂组相比，皮下rmuil-12+伤口组具有明显更长的荧光寿命(p<0.05)。在第3天，与无伤口组相比，皮下rmuil-12+伤口组具有明显更长的荧光寿命(p<0.05)。最后，与第0天相比，rmuil-12+伤口组在第2天和第3天具有明显更长的荧光寿命(*，p<0.05)。图20：图示了nm-il-12如何作为替代免疫治疗剂恢复内源性il-12的多效免疫和造血作用以对抗感染和愈合伤口(根据lasek等人,cancerimmunol.immunother.,63:419(2014)修改)。图21：图示了据预测nm-il-12在amd中的多效作用如何通过(i)减少新血管形成，因为il-12对多种血管生成因子具有广泛的抗血管生成作用；(ii)抑制il-17，其是眼睛中“免疫崩溃”的关键介质；以及(iii)通过补充衰老的巨噬细胞恢复免疫平衡来逆转进展。图22：示出了重组鼠il-12对碱性成纤维细胞生长因子诱导的(沉淀p)小鼠角膜新血管形成的影响。图22a-f示出了在植入碱性成纤维细胞生长因子沉淀(p)后5天，表示媒介物治疗的(对照)c57bl/6小鼠(图22a)、scid小鼠(图22b)和米色小鼠(图22c)的角膜或il-12治疗的c57bl/6小鼠(图22d)、scid小鼠(图22e)和米色小鼠(图22f)的角膜的图像。该附图显示，rmuil-12是血管生成的抑制剂。图23：示出了眼内重组鼠il-12对激光诱导的眼损伤模型(实验性脉络膜新血管形成)中平均病变体积的剂量反应。0.1和1ng/眼的rmuil-12显著减小了平均血管病变体积(由荧光标记的抗胶原iv抗体染色分析确定)。通过学生t检验进行统计分析，0.1和1ng/眼的rmuil-12均与单独的媒介物相比，*p≤0.02。图24：示出了在激光诱导的眼损伤模型中，在眼内施用媒介物或多剂量的重组鼠il-12后荧光血管病变的可视化(图24a＝媒介物；图24b＝0.1ngil-12；图24c＝0.1ngil-12；而图24d＝1ngil-12)。图25：示出了在激光诱导的眼损伤模型中，在用媒介物(约2.6)、抗vegf抗体(约1.7)和rmuil-12(约1.75)治疗后的平均血管病变体积(μm3x106)的图像。rmuil-12和抗vegf抗体对血管生成具有类似的显著抑制。通过学生t检验进行统计分析，与单独的媒介物相比，*p≤0.05。图26：示出了在激光诱导的眼损伤模型中，在用媒介物(约112)、抗vegf(约60)和il-12(约60)治疗后的平均iba-1阳性体积(μm3x103)的图像。rmuil-12和抗vegf抗体对血管生成具有类似的显著抑制。通过学生t检验进行统计分析，与单独的媒介物相比，*p≤0.05。图27：nm-il-12在体外显著抑制il-17。添加到pbmc的nm-il-12有效限制致病性th17/il-17反应。在该研究中，将人pbmc与0、1和10pm的nm-il-12一起培养2天。制备裂解物并探测(pcr)ifn-γ和il-17的mrna。数据是平均值±sem，p值是学生t检验。如所预测的，il-12治疗显示出显著增加抗血管生成ifn-γ(图27a)，并显著降低破坏性il-17(图27b)。图28：示出了正常巨噬细胞与衰老巨噬细胞在眼部新血管形成中的作用。在激光诱导的视网膜损伤后，在年轻(<2个月)小鼠和老年(>18个月)小鼠中发生巨噬细胞浸润。在老年小鼠中，降低的il-12和增加的il-10限制了减少眼中损伤诱导的新血管形成的能力。图29：图示了nm-il-12如何作为rankl的天然抑制剂减少骨丢失，增加骨髓中的成骨细胞，并通过促进抗原呈递和增强细胞向肿瘤的运输以及激活cd8+细胞和nk细胞而具有抗肿瘤作用。图30：示出了非人灵长类动物中两个治疗组(0ng/kg和250nm-il-12ng/kg)的trap计数-股骨，例如总股骨面积的trap(抗酒石酸酸性磷酸酶)部分。皮下施用nm-il-12导致显著降低在股骨中测量的破骨细胞形成。通过学生t检验进行统计分析，与媒介物相比，*p≤0.01。图31：类似地，图31示出了非人灵长类动物中两个治疗组(0ng/kg和250il-12ng/kg)的trap计数-肋骨，例如总肋骨面积的trap部分。皮下施用nm-il-12导致显著降低在肋骨中测量的破骨细胞形成。通过学生t检验进行统计分析，与媒介物相比，*p≤0.05。图32：鼠il-12促进照射小鼠的造血恢复。针对il-12rβ2染色的来自未经照射的未治疗小鼠的股骨骨髓的代表性切片在图32a和图32b中示出。动物经受tbi(8.0gy)，并且随后在照射后的指定时间皮下接受媒介物(图32c和图32d)或rmuil-12(20ng/小鼠)。在照射后12天对股骨骨髓进行针对il-12rβ2的免疫组织化学染色(橙色)。来自用媒介物治疗的小鼠的骨髓(图32c和图32d)缺乏表达il-12rβ2的细胞并且没有显示出造血再生的迹象，而用rmuil-12治疗的小鼠(图32e和图32f)显示出造血重建并存在表达il-12rβ2的巨核细胞、髓样祖细胞和成骨细胞。放大倍数＝100x。图33：可视化地示出了骨髓中il-12、ifn-γ和il-18诱导的破骨细胞凋亡的机制，由此减少骨丢失。图34：示出了在向健康人受试者皮下施用nm_il-12或安慰剂后，ifn-γ和il-18二者的循环水平与时间的图像。il-12及其诱导的下游因子ifn-γ和il-18是rankl的天然抑制剂，从而减少骨丢失。*安慰剂治疗的受试者中ifn-γ的循环水平低于定量限。图35：示出了il-12和ifn-γ基线水平。图35a和图35b中示出的盒须图描述了110名受试者的il-12(35a)和ifn-γ(35b)基线水平，其中须覆盖5％-95％的基线值。使用试剂盒标准曲线确定il-12基线水平。如图35a所示，110名受试者的所有给药前il-12水平均低于定量限(blq)(lloq＝0.367pg/ml)。如图35b所示，几乎所有ifn-γ水平均在lloq(lloq＝1.08pg/ml)之上可定量，大多数在低pg/ml范围内。五个高端(highend)异常值显示ifn-γ的基线水平>23pg/ml，包括受试者1033和1055。具体实施方式i.nm-il-12：替代免疫治疗剂在本发明之前存在的问题是未能认识到与诸如慢性病、损伤或伤口、衰老、感染性疾病和癌症等疾病相关的看似多种多样的病况是相关的，即，这些病况导致il-12表达的抑制，从而导致无数不良影响。令人惊讶地发现，通过施用生理剂量的il-12可以解决与内源性il-12产生的缺乏相关的不良影响。具体地，诸如慢性病、损伤或伤口以及衰老等疾病抑制关键免疫细胞，即抗原呈递/树突细胞，并抑制il-12产生(图6)。该问题的解决方法是施用生理剂量的外源性il-12，因为生理剂量的外源性nm-il-12重新激起多效性修复反应、抗感染反应和抗肿瘤反应，从而恢复关键的免疫作用，从而改善患有疾病和具有伤口的患者的结果(图7)。还参见图8，其可视化地示出了nm-il-12如何作为替代免疫治疗剂恢复内源性il-12多效免疫和造血作用。总而言之，nm-il-12是一种替代免疫治疗剂，其重新给予身体在健康时能够提供的功效。许多疾病状态、损伤和衰老导致产生内源性il-12的细胞变得功能失调并且不再能够产生il-12。本发明涉及il-12作为关键因子的发现，其可以在许多不同的疾病状态中作为替代免疫治疗剂。在本发明的一个方面，在施用一个或多个生理剂量的外源性il-12之前，待治疗的患者群体具有小于约5pg/ml、小于约4pg/ml、小于约3pg/ml、小于约2pg/ml或小于约1pg/ml的il-12表达水平。通常，患者群体具有低于检测限或定量限(llpq)的il-12水平。患有疾病(如慢性病)或具有伤口的患者群体中的这样的il-12表达水平表明受试者无法产生期望或必需水平的内源性il-12。用作内源性因子的替代物的里程碑式蛋白质药物包括胰岛素(在20世纪60年代引入)、人生长激素(hgh)(在20世纪80年代引入)和epo(在20世纪90年代引入)。我们设想，nm-il-12将在21世纪20年代发挥同样的作用，既可作为独立治疗，也可与慢性病、损伤和衰老的标准护理治疗相结合。修复、再生和根除：几种模型适应症可用于证明il-12在修复、再生和根除中和作为有用的替代免疫治疗剂的广度。具体地，通过il-12在治疗年龄相关性黄斑变性(amd)、慢性肾病(ckd)、伤口愈合和骨质疏松症(下文详述)中的有效性可证明修复和再生。树突细胞是体内il-12的主要产生者，但是这些细胞在某些疾病状态下变得功能失调并且不再释放il-12或释放量不足。外源性il-12可以替代内源性il-12(例如，“替代免疫治疗剂”)以在遭受体内il-12产生缺乏的病况下刺激修复和再生，例如amd、伤口愈合、骨质疏松症和ckd中的治疗剂。安全性：il-12是独特的细胞因子。已经证明重组人il-12(本文中也称为“nm-il-12”、“il-12”和hemamaxtm(rhuil-12))是安全的。例如，已经在三项研究中的>200名健康志愿者和几项临床试验中的患者中证明了il-12的安全性。参见例如，(i)clinicaltrials.gov识别号nct02542124的“nm-il-12incutaneoust-celllymphoma(ctcl)undergoingtotalskinelectronbeamtherapy(tsebt)”(临床试验进行中)；(ii)clinicaltrials.gov识别号nct02544061的“nm-il-12(rhuil-12)insubjectswithopensurgicalwounds”(临床试验进行中)；(iii)clinicaltrials.gov识别号nct02343133的“safetystudyofhemamaxtm(rhuil-12)totreatacuteradiationsyndrome”(临床试验已完成)；以及(iv)clinicaltrials.gov识别号nct01742221，关于“safetyandtolerabilityofhemamaxtm(rhuil-12)asradiationcountermeasure”(临床试验已完成)。nm-il-12是唯一被证明对各类血细胞减少症有强效的分子，通过骨髓再生显著提高骨髓消融后的存活率。进一步地，il-12已被证明能减少感染和出血，在头对头研究中提供优于的存活益处，现在正处于3期临床研究中。已完成美国生物制剂许可申请(usbiologicslicenseapplication，bla)批准的疗效研究。虽然nm-il-12是安全且耐受良好的，但制药领域的传统观点是il-12是有毒的。这主要是由于2期试验设计中的错误导致两名患者死亡，而确定nm-il-12的最大耐受剂量和给药方案的1期试验已成功完成。早期制药研究人员不了解il-12生物学，这导致了试验设计中的错误。随后，il-12已经被40多项临床试验中的研究者评估，发现其耐受性良好(1389名患者)。损伤/修复/再生的新作用：il-12是免疫和造血的主要调节因子。因为il-12是主要调节因子，所以它在体内不是组成型产生的。il-12仅在受伤后被需要时产生，因此il-12在体内受到高度调节。然而，衰老、损伤和许多疾病状态如癌症和感染性疾病，并且尤其是慢性病状态，会影响产生il-12的细胞并抑制其产生。因此，在慢性病、损伤和老年人中，如ckd、骨质疏松症、amd和糖尿病伤口愈合中，外源il-12可以作为内源性因子的替代物来修复损伤组织。nm-il-12在辐射暴露(例如，骨髓消融)方面已经取得了临床成功，显示出显著提高的存活率(图2)。此外，nm-il-12在证明组织损伤的修复方面已经取得了临床成功，该分子显示出对由手术切口引起的组织损伤的显著加速闭合(100％)(图2)。最后，nm-il-12在根除癌症生长方面已经显示出临床成功，其中il-12用于治疗皮肤淋巴瘤，导致根除和完全持久的反应(图2)。nm-il-12具有独特的作用机制。具体地，il-12在造血干细胞的水平下作用于再生骨髓中的细胞并使这些祖细胞和干细胞从骨髓动员到外周血以及损伤的组织和器官中。进一步地，该分子使关键的细胞毒性免疫细胞cd8+细胞和nk细胞增殖并激活，以对抗病理入侵者，例如感染和癌症。因此，nm-il-12独特地提供有效的抗感染和抗肿瘤作用以及骨髓的造血再生。此外，独特的il-12受体同时存在于成熟的免疫效应细胞(cd8+细胞、cd4+细胞、nk细胞和b细胞)以及未成熟的骨髓祖细胞和干细胞上，这一事实强调了它在体内的重要性，其允许新的前体细胞从骨髓中涌现，从而产生成熟的效应细胞进行重复多轮的免疫活动。如图1所示，nm-il-12是一种干细胞、造血细胞和免疫细胞因子，其具有再生(通过干细胞和祖细胞，起到补充所有血细胞谱系的作用)、根除(通过先天免疫(nk细胞)和适应性免疫(cd8+和cd4+细胞)根除病毒、细菌和肿瘤)以及修复(伤口愈合、组织修复和免疫监视)的作用。因此，nm-il-12通过刺激骨髓中的诸如cd34+细胞、干细胞、祖细胞、巨核细胞、淋巴母细胞、成粒细胞、未成熟nk细胞和网织红细胞等细胞而刺激血细胞生成。nm-il-12还促进细胞向组织中迁移，以帮助伤口愈合和组织修复。参见图3。作为il-12作为替代免疫治疗剂的有效性的实例，已经发现nm-il-12加速糖尿病足溃疡(dfu)中的伤口愈合，减慢慢性肾病(ckd)的进展，并减少骨质疏松症中的骨丢失。具体地，在dfu中，已经发现nm-il-12(i)再生免疫细胞、血小板、干细胞和祖细胞(例如，再生)，(ii)减少感染(例如，根除)，以及(iii)改善伤口闭合，增加伤口侧的代谢活动，并增加胶原沉积(例如，修复)。类似地，在ckd中，已经发现nm-il-12(i)再生免疫细胞、干细胞和祖细胞(例如，再生)，(ii)减少ckd相关的贫血，并降低epo抵抗(例如，根除)，以及(iii)增加来自il-12rβ2阳性小管细胞的epo并增加肾修复和再生(例如，修复)。最后，在治疗骨质疏松症中，已经发现nm-il-12(i)引发成骨细胞增殖(例如，再生)；(ii)减少骨丢失(例如，根除)，以及(iii)增加nf-κb配体(rankl)的抑制并增加成骨细胞数目。参见图4。还发现nm-il-12在弥漫性大b细胞性淋巴瘤(dlbcl或dlbl)中增加治愈率并降低化疗相关的毒性，还发现其抑制年龄相关性黄斑变性(amd)的进展。具体地，在dlbcl中，已经发现il-12(i)恢复免疫能力，增加造血作用，并动员免疫细胞(例如，再生)；(ii)减少b细胞淋巴瘤，增加抗原呈递和t细胞克隆，并增加细胞毒性(例如，根除)；(iii)增加完全反应并降低血液毒性(例如，修复)。进一步地，关于amd，已经发现nm-il-12(i)增加免疫平衡并增加衰老巨噬细胞的替代(例如，再生)；(ii)减少il-17的产生并减少血管生成和新血管形成(例如，根除)；(iii)使视力丧失最小化并减少il-17诱导的视网膜细胞死亡(例如，修复)。参见图5。因此，nm-il-12提供了革命性的再生方法，具有三个主要作用：再生、根除和修复。在血液学中，nm-il-12可以治疗例如各类血细胞减少症、嗜中性白细胞减少症、贫血症、血小板减少症和/或淋巴细胞减少症(同时或其任何组合)。il-12不仅减轻了首选疗法引起的血液毒性，而且还在肿瘤患者中提供了协同作用、根除(抗肿瘤)反应。当使用联合治疗时，患者还获得额外的益处，相对于首选疗法毒性很小或没有毒性。预计用nm-il-12治疗产生超过单独的首选疗法的存活益处。没有已知的其他因子可以具有这些革命性作用。施用外源性il-12作为替代免疫治疗剂可以与针对待治疗病况的任何常规治疗联合。联合治疗可以包括顺序施用、同时施用或分开任何所需的时间段(包括数小时、数天、数周或数月)的共同施用。a.慢性肾病如上所述，ckd是证明il-12作为替代免疫治疗剂的有用性的模型适应症。迄今为止，ckd市场或渠道中没有可以实际减慢ckd进展的药物。因此，nm-il-12满足了本领域未满足的需求。nm-il-12诱导内源性epo产生，增加正常人和猴中的网织红细胞和红细胞，并且在非人灵长类动物中致死辐射后增加网织红细胞和红细胞。但是nm-il-12不仅可以给予epo来增加红细胞群体——nm-il-12的多效作用也有望导致肾脏的修复和再生，从而减慢ckd的进展。初步数据表明，nm-il-12是ckd患者尤其是早期患者的肾性贫血的新型治疗，其可以减慢ckd的进展。nm-il-12在ckd中的多效作用预计会减慢ckd进展，特别是由于其在骨髓中的干细胞活性和其使干细胞(如cd34+细胞和间充质细胞)从骨髓动员到外周组织用于修复和再生的能力。nm-il-12还诱导epo从il-12rβ2+ve肾小管细胞释放并减少ckd相关的贫血。进一步地，nm-il-12动员造血祖细胞和干细胞以及成熟的免疫细胞，导致肾脏修复和再生。最后，nm-il-12恢复免疫平衡，降低epo抵抗，并降低感染率。使用nm-il-12成功治疗ckd的可测量终点是ckd进展减慢。或者，epo的产生及其相关的血液参数(如血红蛋白水平)变化也可作为临床终点。ckd进展的减慢可以通过例如受试者中的以下一项或多项来证明：肌酸酐减少、血尿素氮(bun)减少、蛋白尿减少或肾小球滤过率(gfr)增加。在本发明的一个实施方案中，例如，通过测量肾功能，肌酸酐测量值，血红蛋白水平，epo、bun、gfr、蛋白尿的产生或其任何组合，用nm-il-12治疗使ckd的进展减慢约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。下表1详述了慢性肾病的五个阶段，包括每个阶段肾功能的保留量，以及与每个阶段相关的描述和症状。表1慢性肾病的五个阶段如上所述，ckd进展的减慢可以例如通过受试者中的肌酸酐减少、血尿素氮(bun)减少、蛋白尿减少或肾小球滤过率(gfr)增加的一种或多种来证明。下表2详述了如通过gfr和蛋白尿类别确定的ckd的预后。表2il-12受体(il-12rb2)的独特亚基在人和恒河猴的肾髓质小管细胞上表达。将包含肾单位的髓质小管细胞(而不是皮质肾小管)中的il-12rβ2高度染色。这一点很重要，因为据表明epo的表达是由肾髓质小管引起的(图9)。单次低剂量的nm-il-12诱导恒河猴中的epo并导致网织红细胞(红细胞的前体)的增加(图10)。进一步地，在没有支持性护理的情况下，单次低剂量的nm-il-12显著降低了猴中骨髓消融(致死辐射)后主要血细胞类型的最低点。nm-il-12通过对造血干细胞的活性显示出独特的多谱系再生作用，并且显示出对红细胞生成的积极作用。参见表3。表3细胞类型nm-il-12与对照网织红细胞0.056*红细胞0.012**血小板0.012**白细胞0.022**淋巴细胞0.068*嗜中性白细胞0.028**通过wilcoxonrank-sum检验进行统计学评价。**统计学上显著*趋向于显著此外，单次低剂量的nm-il-12(12mg)直接诱导人体内的epo(图11)。发现单次低剂量皮下注射nm-il-12动员所有的成熟外周血细胞和未成熟的cd34+造血祖细胞用于体内所需的组织修复和再生(图12)。这些结果证明了nm-il-12的独特的多能且一致的动员作用。因此，虽然epo是目前ckd的标准治疗，但在ckd中nm-il-12提供比epo更广泛和更独特的多效性益处(表4)。表4在本发明的一个实施方案中，nm-il-12与ckd的常规治疗如epo联合使用。如本文详述的证明il-12活性的示例性文献支持包括，例如，(1)教导il-12和epo处于内源性反馈回路，以及低il-12水平与epo抵抗之间存在负相关的出版物，包括“erythropoietinenhancesimmunostimulatorypropertiesofimmaturedendriticcells,”clin.andexp.immunology,165:202–210(2011)；和“roleofcytokinesinresponsetoerythropoietininhemodialysispatients”,kidneyinternational,54:1337-43(1998)；(2)教导尿毒症毒性损害适应性免疫应答和先天免疫应答以及il-12的释放，从而导致免疫功能障碍的出版物，包括“characteristicsandcausesofimmunedysfunctionrelatedtouremiaanddialysis.”proceedingsofthe3rdasianchaptermeetingoftheispd,28(3)2008年6月和kidneyinternational,54:1337-43(1998)；以及(3)教导可表达内源性il-12的透析患者具有更长的存活期的出版物，包括“cytokinepatternsandsurvivalinhaemodialysispatients”,nephrol.dial.transplant,25:1239–1243(2010)。b.伤口免疫疗法il-12还可用于组织修复，特别是用于辅助和改善伤口愈合。用于证明il-12在组织修复中的有用性的模型损伤是糖尿病患者和老年患者的伤口，其可能特别难以治疗。在其他实施方案中，受试者是老年受试者并患有压力性溃疡，或者受试者是糖尿病受试者并患有足溃疡。迄今为止，没有能显著改善糖尿病患者和老年患者中的伤口愈合缓慢的药物。本文所述的新发现显示，il-12受体见于皮肤的祖细胞中，并且该受体在伤口表面上调，并且鼠il-12加速无免疫应答的糖尿病鼠模型中的伤口闭合。这些发现大体上为nm-il-12用于伤口免疫疗法，特别是用于见于糖尿病患者和老年人中的缓慢愈合的伤口铺平了道路。参见例如图13，其可视化地示出了il-12在加速糖尿病患者和老年人的缓慢愈合伤口的闭合中的预期有用性。特别地，预计il-12(i)通过对免疫细胞如nk细胞、细胞毒性t细胞(ctl)和巨噬细胞的关键作用减少感染；(ii)增加伤口部位的胶原沉积和代谢活动；以及(iii)动员免疫细胞、血小板和骨髓祖细胞和干细胞至伤口。造口拆除患者中术后的伤口愈合加速代表了nm-il-12在伤口免疫疗法中的作用的概念验证，这可为糖尿病足溃疡患者(dfu)的2b期试验铺平道路。没有可以有效预防或治疗糖尿病足溃疡的药物。考虑到远未满足的需求，dfu患者中伤口闭合改善的临床终点将有资格获得加速、有条件的批准。在本发明的一个实施方案中，与没有施用外源性il-12时观察到的愈合速率相比，施用外源性il-12导致伤口愈合加速约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。伤口免疫疗法中的科学支持：il-12受体在真皮和皮脂腺的祖细胞中表达，并且在伤口和辐射后的伤口表面中上调。在正常的图14a和受伤的经照射的皮肤组织(图14b和图14c)中证明了il-12在刺激伤口愈合中的先前未确定的作用。在正常的未损伤的皮肤中，发现il-12受体在真皮的基底膜(bm)和毛囊下的皮脂(se)腺中的祖细胞上高度表达。这些祖细胞是皮肤损伤后上皮再形成的主要介质。在全层损伤(相当于三度烧伤)后，看到il-12受体在伤口表面的表达高度上调。这些数据为皮肤损伤后通过nm-il-12刺激伤口愈合提供了基础。进一步地，已发现局部nm-il-12在全层免疫抑制鼠模型中加速伤口愈合。参见图15。特别地，图15示出了伤口面积(第0天的百分比)与损伤后天数的图像，其中比较了通过向雄性小鼠和雌性小鼠局部施用媒介物(雄性和雌性)和重组鼠il-12(15ng)而获得的结果。在损伤时和损伤后第3天和第6天，与媒介物治疗的小鼠相比，向被给予tbi(500cgy)和全层皮肤损伤的雄性和雌性小鼠施用rmuil-12(15ng，局部)加速了伤口愈合并使伤口完全闭合。另外的数据显示，局部nm-il-12在全层糖尿病鼠模型中加速伤口愈合。具体地，如图16所示，与媒介物治疗的大鼠相比，在损伤时向具有全层皮肤损伤的糖尿病大鼠施用rmuil-12(15ng和474ng，局部)加速了伤口愈合(图16示出了伤口面积(第0天的百分比)与损伤后天数的图像，其中比较了通过局部施用媒介物和两种不同剂量的重组鼠il-12而获得的结果。)。伤口愈合数据不限于局部施用。特别地，发现单次皮下注射鼠nm-il-12加速全层鼠模型中的伤口愈合并且优于局部给药。参见例如，图17和图18。与媒介物单次施用(局部)相比，全层皮肤损伤给药后24小时单次施用(皮下)rmuil-12(20ng)或三次施用(局部)rmuil-12(15ng，损伤后24小时、第3天和第5天)加速了伤口愈合。图17示出了以下4组的伤口面积(第0天的百分比)与损伤后天数的图像：媒介物，15ngrmuil-12局部3x/天，15ngrmuil-12局部1x/天和20ngrmuil-12皮下1x/天。接受20ngrmuil-12皮下1x/天的动物显示出最快的伤口愈合，而接受15ngrmuil-12局部3x/天的动物具有第二快的愈合速率。图18a示出了局部施加媒介物后的伤口的图片，而示出了伤口的显著愈合的图18b描述了通过皮下rmuil-12获得的结果。还发现单次注射鼠nm-il-12在全层小鼠切割伤口中引发显著更快速和更大的代谢反应。示出荧光寿命(ps)与研究天数的图像的图19示出了愈合期间受伤皮肤中的代谢活动的动力学。在第2天，与有伤口的安慰剂组相比，rmuil-12+伤口组具有明显更长的荧光寿命(p<0.05)。在第3天，与无伤口组相比，rmuil-12+伤口组具有明显更长的荧光寿命(p<0.05)。最后，(*)与第0天相比，rmuil-12+伤口组在第2天和第3天具有明显更长的荧光寿命(p<0.05)。参见例如，li等人,biomedicalopticsexpress,6:243477(2015)。目前正在结肠造口术拆除后具有开放性手术伤口的患者中进行2a期概念验证研究。在结肠造口术拆除后具有开放性手术伤口的受试者中，允许二期愈合。该研究利用在手术后24-36小时单次皮下施用12μg单位。次要终点是手术造口部位(伤口)闭合大于50％的中位时间。图20图示了nm-il-12如何作为替代免疫治疗剂恢复内源性il-12的多效免疫和造血作用以愈合伤口(根据lasek等人,cancerimmunol.immunother.,63:419(2014)修改)。其他研究支持关于il-12在帮助和加速伤口愈合(特别是缓慢愈合伤口)中的有用性和有效性的分析和结论。参见例如，(1)详述il-12具有强效抗感染作用的参考文献，包括“interleukin-12ininfectiousdiseases”,clin.microbiologyrev.,10(4):611-36(1997)；(ii)详述nm-il-12的独特之处在于其动员所有主要的外周血细胞(包括cd34+骨髓细胞)至组织的参考文献，包括“singlelow-doserhuil-12safelytriggersmultilineagehematopoieticandimmune-mediatedeffects”,exp.hematology&oncology,3:11(2014)；(iii)详述g-csf动员不影响感染或伤口愈合，但在dfu中显示出下肢手术干预减少的参考文献，包括“granulocyte-colonystimulatingfactorsasadjunctivetherapyfordiabeticfootinfections”,cochranedatabaseofsystematicreviews,第8期.文章编号:cd006810.doi:10.1002/14651858.cd006810.pub3(2013)；(iv)详述在致死辐射暴露后nm-il-12对骨髓再生显示出强效作用的参考文献，包括“recombinantinterleukin-12,butnotg-csf,improvessurvivalinlethallyirradiatednonhumanprimatesintheabsenceofsupportivecare”,2014年5月22日,wileyonlinelibrary(wileyonlinelibrary.com)doi:10.1002/ajh.23770；以及(v)详述在全层伤口后鼠il-12显示出代谢活动和胶原沉积增加的参考文献，包括“effectofril-12onmurineskinregenerationandcelldynamicsusinginvivomultimodalmicroscopy”,biomedicalopticsexpress,6(11)(2015年11月)doi:10.1364/boe.6.004277。c.年龄相关性黄斑变性年龄相关性黄斑变性(amd)，特别是湿性amd，被认为是由老化眼睛中的血管异常生长(血管生成)引起的。目前在湿性amd中批准的产品是抗vegf抗体(lucentis，eyelea)。这些药物已经显示出疗效有限，三分之一的经治疗人群的结果不佳且视力下降。正在开发的后续湿性amd产品也靶向相关的抗血管生成因子，即用抗pdgf抗体靶向pdgf。il-12具有强效的抗血管生成作用，显示出在癌症模型和癌症患者中具有减少血管生成的活性(减少vegf和相关因子)，并在几种模型系统中具有减少角膜新血管形成(湿性amd)的活性。还有报道称免疫功能障碍可能是amd的核心，衰老巨噬细胞的il-12的产生下降。因此，nm-il-12是一种有吸引力的新药，它带来作为单一药剂或与其他药物联合治疗amd患者的另外机制。如图21中可视化地描述，预测nm-il-12在amd中的多效作用通过(i)减少新血管形成，因为il-12对多种血管生成因子具有广泛的抗血管生成作用；以及(ii)通过补充衰老的巨噬细胞恢复免疫平衡来减慢或逆转进展。在本发明的一个实施方案中，与没有施用外源性il-12时观察到的进展相比，施用外源性il-12导致amd的进展减慢或逆转约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。在另一个实施方案中，il-12可以(i)经由眼内途径以外的任何途径施用，(ii)经由皮下注射施用，或(iii)经由眼内注射施用。非常需要针对amd的改进治疗。具体地，在雷珠单抗疗法约7年后进行的长期评估显示，三分之一的患者结果不佳。并且与基线相比，虽然大约一半的眼睛稳定，但三分之一的眼睛下降了15个字母或更多。“seven-yearoutcomesinranibizumab-treatedpatientsinanchor,marina,andhorizon.”ophthalmology,1e8(2013)。因此，即使在治疗过程的后期，渗出性amd患者仍然存在实质性视力下降的风险。目前批准的用于湿性amd的药物通过抑制vegf而靶向血管生成。显然，这种方法不是对所有患者都有帮助，从而留下了大量未满足的对新药的需求。nm-il-12为湿性amd的治疗提供了新的方向和独特而新颖的作用机制，提供抗血管生成作用以及多效免疫和造血作用；这些总体的作用是vegf抑制剂或任何单一靶向疗法的机制所无法实现的。其他数据支持本文提出的il-12在治疗和改善amd方面有用的分析和结论。具体地，judahfolkman在1995年首先阐明了血管生成在癌症中的作用，提供了证据表明il-12在角膜新血管形成模型中是一种强效的血管生成抑制剂。参见图22a-f，其示出了重组鼠il-12对碱性成纤维细胞生长因子诱导的小鼠角膜新血管形成的作用。图22a-f示出在植入碱性成纤维细胞生长因子沉淀(p)后5天，表示媒介物治疗的(对照)c57bl/6小鼠(图22a)、scid小鼠(图22b)和米色小鼠(图22c)的角膜或il-12治疗的c57bl/6小鼠(图22d)、scid小鼠(图22e)和米色小鼠(图22f)的角膜的图像。在对照角膜中存在大量的新血管，而在用il-12治疗后几乎没有观察到血管反应。j.ofthenationalcan.institute,87(8)(1995年4月19日)。近20年后，本发明显示，可以使用单次低剂量0.1ng/眼的鼠il-12来防止激光诱导的眼损伤(实验性脉络膜新血管形成)。图23示出了鼠il-12对平均病变体积的剂量反应。图24a-d示出了在给定剂量的鼠il-12下病变的可视化(0.1ng和1ng相对于0ngil-12，均*p<0.02)(图24a＝媒介物；图24b＝0.1ngil-12；图24c＝0.1ngil-12；而图24d＝1ngil-12)。本发明人表明，在实验性脉络膜新血管形成鼠模型中，鼠il-12(0.1ng/眼)可以减少激光诱导的眼损伤的影响，与抗vegf(15mcg/眼)相同。预期nm-il-12与常规amd治疗如(雷珠单抗注射)或(阿柏西普)的联合将提供协同效应或至少提供累加效应。参见例如图25，其示出了用媒介物(约2.6)、抗vegf(约1.7)和il-12(约1.75)治疗后的平均血管病变体积(μm3x106)的图像。还参见图26，其示出了用媒介物(约112)、抗vegf(约60)和il-12(约60)治疗后的平均iba-1阳性体积(μm3x103)的图像。nm-il-12在体外显著抑制il-17。添加到pbmc的nm-il-12有效限制致病性th17/il-17反应。在该研究中，将人pbmc与0、1和10pm的nm-il-12一起培养2天。制备裂解物并探测(pcr)ifn-γ和il-17的mrna。数据是平均值±sem，p值是学生t检验。如所预测的，il-12治疗显示出显著增加抗血管生成ifn-γ(图27a)，并显著降低破坏性il-17(图27b)；预计这些作用会减少血管生成并恢复体内免疫平衡。因此，il-12是老化眼睛中的“缺失环节”；通过外源性nm-il-12恢复免疫平衡解决了用现有技术amd治疗所遇到的问题。图28示出了正常巨噬细胞与衰老巨噬细胞在眼部新血管形成中的作用。在激光诱导的视网膜损伤后，在幼龄(<2个月)和老龄(>18个月)小鼠中发生巨噬细胞浸润。然而，该巨噬细胞浸润仅与较老小鼠的新血管形成有关。从较老小鼠的视网膜分离的巨噬细胞的rt-pcr分析显示il-12、tnf-α、fasl和il-6的表达水平低于较年轻小鼠视网膜中的巨噬细胞中的表达水平。所有小鼠的视网膜中都观察到il-10表达的增加，但在老龄小鼠中的基线水平更高。这些数据表明，小鼠变老时，il-10表达增加和细胞因子表达改变限制了衰老巨噬细胞调节眼睛中损伤诱导的新血管形成的能力。如下表5中所总结的，与目前上市的产品相比，nm-il-12在amd中提供广泛且独特的机制益处。表5d.骨质疏松症癌症治疗，即辐射、化疗和类固醇，可导致骨密度降低。此外，其他患者群体如老年人和服用某些药物的受试者，可能患有骨密度降低和骨质疏松症。本发明人已经表明，单次注射低剂量nm-il-12可以显著降低高剂量全身照射(tbi)后猴骨中的破骨细胞水平，并且在小鼠tbi后，在骨髓中的成骨细胞上发现il-12受体，提示再生作用。据报道，il-12增加成骨细胞形成，并是破骨细胞形成的强效抑制剂，从而表明il-12可能是骨形成的关键调节因子。然而，衰老和终身暴露于抗原和氧化应激的影响损害了生理反调节免疫过程，该过程允许释放il-12以抑制骨吸回。本发明人的数据建议在经历癌症治疗的患者中以及由于衰老或其他因素而骨量不足的患者中使用nm-il-12。在本发明的一个实施方案中，与没有施用外源性il-12时观察到的情况相比，施用外源性il-12导致骨丢失减少和/或破骨细胞形成降低约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约100％。如图29中图示的，nm-il-12作为rankl的天然抑制剂减少骨丢失，增加骨髓中的成骨细胞，并在抗原呈递和向肿瘤运输以及cd8+和nk激活方面具有抗肿瘤作用。癌症患者由于癌症治疗(即辐射、化疗和类固醇)以及潜在的疾病而经历更高的骨丢失率。预计nm-il-12在接受癌症治疗的癌症患者中具有双重益处：(1)减少骨丢失和骨折，同时(2)提供与癌症治疗(即辐射或化疗)的协同抗肿瘤机制。接受骨盆区辐射的癌症患者的骨丢失减少的临床终点，作为骨折率降低的替代终点，可以有资格加速、获得有条件批准。对于能够提供骨丢失减少以及对癌症的伴随抗肿瘤作用的双重益处的药物的未满足的需求预计使得nm-il-12可以获得相对短的上市途径。辐射诱导破骨细胞形成。与对照相比，单次sq注射低剂量nm-il-12减少了猴中骨伤害剂量的tbi后破骨细胞的形成。参见图30，其示出了两个治疗组(0ng/kg和250il-12ng/kg)的trap计数-股骨，例如总股骨面积的trap(抗酒石酸酸性磷酸酶)部分。trap是破骨细胞的酶标志物。类似地，图31示出了两个治疗组(0ng/kg和250il-12ng/kg)的trap计数-肋骨，例如总肋骨面积的trap(抗酒石酸酸性磷酸酶)部分。施用il-12导致在股骨和肋骨中测量的破骨细胞形成显著降低(图30和图31)。il-12rβ2见于骨髓中的正常鼠成骨细胞上，并且在致死辐射后存在受体；然而，在接受辐射的对照小鼠中不存在受体，这表明在辐射后，nm-il-12可通过其受体使成骨细胞激活/增殖。参见例如图32，其示出了针对il-12rβ2染色的股骨骨髓的代表性切片。图32显示，mnm-il-12促进经照射小鼠的造血恢复。具体地，图32a和图32b示出了未照射和未治疗的正常股骨切片，其中可见成熟和未成熟的巨核细胞以及晚幼粒细胞。图32c和图32d示出了照射和用媒介物治疗后的股骨切片。最后，图32e和图32f示出了照射和用mnm-il-2治疗后的股骨切片。成骨细胞在图32e中清晰可见。对于经照射的小鼠，mnm-il-12产生造血重建和il-12rβ2+ve巨核细胞、祖细胞和成骨细胞的存在。il-12及其诱导的下游因子ifn-γ和il-18是rankl的天然抑制剂。图33可视化地示出了骨髓中il-12、ifnγ和il-18诱导的破骨细胞凋亡的机制。在健康人中单次sq注射nm-il-12(12mg)可以诱导inf-γ和il-18，因此仅需要il-12来抑制rankl。参见图34，其示出了以下治疗组的ifn-γ与时间的图像：安慰剂和nm-il-12，以及相同治疗组的il-12与时间的图像。因此，如表6中总结的，nm-il-12独特地在癌症患者中提供骨保存以及伴随抗肿瘤作用的双重益处。另外，在未经历癌症治疗的受试者中，可以给予il-12以预防或减少骨质疏松症早期至晚期受试者的骨丢失。表6nm-il-12地舒单抗抑制rankl√√抑制成骨细胞√√成骨细胞增殖√×抗肿瘤作用：肿瘤抗原呈递√×淋巴细胞迁移√×nk细胞的细胞毒性√×cd8+/til的细胞毒性√×抗血管生成√×ii.nm-il-12nm-il-12(也称为hemamaxtm(rhuil-12))是由通过二硫键连接的两个亚基组成的异二聚体蛋白质。两个亚基是a亚基和b亚基，分别称为p35和p40。异二聚体il-12含有503个氨基酸。该蛋白质可以在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中通过重组蛋白质产生技术产生，总分子量为约75.0kda，并且与内源性il-12一样，最终形式为糖蛋白。nm-il-12的糖基化模式不同于内源性il-12。nm-il-12在体外有效地引发人免疫细胞中的药效学反应(干扰素-γ[ifn-γ])，并且在体外和体内有效地引发非人灵长类动物(恒河猴)中的药效学反应(干扰素-γ[ifn-γ])。表7提供了nm-il-12的研究产品剂量/施用。nm-il-12(rhuil-12)：nm-il-12已显示出优秀的血细胞恢复(包括血小板恢复)，鼠模型中骨髓抑制性或骨髓消融疗法后的恢复，以及非人灵长类动物(nhp)模型中骨髓消融治疗后的恢复。事实上，在概念验证的致死辐射nhp研究中，80％的媒介物治疗的猴需要血小板输注，而只有25％的nm-il-12治疗的猴需要血小板输注(p<0.007，卡方分析)。nm-il-12的作用机制(moa)涉及在造血干细胞(hsc)水平上使血细胞生成再生。作为该moa的支持，neumedicines在人hsc的几个关键亚群上发现了il-12受体，它与已知的干细胞标志物如cd34、c-kit和kdr共表达。hemamax的作用机制与众所周知的造血生长因子的作用机制之间没有重叠。hemamax的作用机制涉及在其他造血因子活动的上游激活造血干细胞。因此，hemamax可以在消融后补充和再生造血和免疫系统，而这些下游作用因子却不能，因为它们靶向前体细胞而产生单一血细胞类型。通过这种早期作用(上游)机制，hemamax对原始造血干细胞的激活可以恢复所有主要的血细胞类型。独特的il-12受体在骨髓的祖细胞和干细胞上，也在成熟的免疫效应细胞如cd8+、cd4+、nk和b细胞以及其他细胞如嗜酸性粒细胞上。这种独特的受体也在许多组织的细胞上，并且将在组织和器官受损时出现，如在图14所示的伤口愈合环境中观察到的。与外源性il-12相互作用的独特il-12受体的作用是il-12作为替代免疫治疗剂的核心。总的来说，在体内需要时如损伤后或疾病期间il-12受体的上调，加上在体内需要时il-12的外源性递送用于根除、修复和再生，是本发明的基础。在一个方面，hemamax(rmuil-12)的鼠相对物促进暴露于亚致死或致死全身照射(tbi)的正常小鼠和荷瘤小鼠中的全谱系血细胞恢复，包括白血病和红细胞以及血小板。hemamax的活性开始于存在于骨髓腔中的原始细胞(造血干细胞和非造血干细胞)的水平。这些原始细胞的激活导致在由辐射或化疗引起的骨髓消融或骨髓抑制后骨髓腔的再生。“白细胞介素-12(il-12)”是指产生本文公开的至少一种造血特性的il-12分子，包括天然il-12分子、变体il-12分子和共价修饰的il-12分子，其是现在已知的或是将来开发的，以现有技术中已知的或将来开发的任何方式生产。il-12分子可以以基本上分离的形式存在。应当理解，产品可以与不会干扰产品的预期目的的载体或稀释剂混合，并且仍然被认为是基本上分离的。本发明的产品也可以是基本上纯化的形式，在这种情况下，它通常将构成制剂的肽或干质量的约80％、85％或90％，包括例如至少约95％、至少约98％或至少约99％。通常，用于本发明实施方案的il-12分子的氨基酸序列衍生自待通过本发明的方法治疗的具体哺乳动物。因此，为了说明起见，对于人类，在本发明的方法中通常将人il-12或重组人il-12施用于人，类似地，对于猫，在本发明的方法中将例如猫il-12或重组猫il-12施用于猫。然而，本发明还包括某些实施方案，其中il-12分子的氨基酸序列并不衍生自作为本发明治疗方法的受试者的哺乳动物。为了说明起见，人il-12或重组人il-12可用于猫科哺乳动物。本发明的其他实施方案包括这样的il-12分子，其中il-12的天然氨基酸序列改变自天然序列，但该il-12分子起到产生本文公开的il-12的造血特性的作用。从il-12的物种特异性天然氨基酸序列的改变包括il-12的一级序列的改变，并且包括一级氨基酸序列的删除和添加以产生变体il-12分子。高度衍生化的il-12分子的实例是由maxygen,inc.(leongsr等人,proc.natl.acad.sci.,usa.,100(3):1163-8(2003))产生的重新设计的il-12分子，其中变体il-12分子通过dna改组方法产生。在本发明的方法中还包括修饰的il-12分子，例如对il-12分子的共价修饰以便增加所述其保质期、半衰期、效价、溶解度、递送等，以美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所述的方式添加聚乙二醇基团、聚丙二醇等。通过使il-12多肽的靶向氨基酸残基与有机衍生剂反应，将对il-12分子的一类共价修饰引入该分子中，所述有机衍生剂能够与il-12多肽的选定的侧链或n-或c-末端残基反应。天然il-12序列和il-12的氨基酸序列变体均可被共价修饰。而且如本文所提到的，il-12分子可通过本领域已知的各种方法产生，包括重组方法。本公开内容中包括的其他il-12变体是标准序列经翻译后修饰(例如糖基化修饰)的那些变体。在某些实施方案中，il-12在哺乳动物表达系统或细胞系中表达。在一个实施方案中，il-12通过在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中表达而产生。由于通常难以提前预测变体il-12多肽的特征，因此应当理解，需要对回收的变体进行一些筛选以选择最佳变体。评估变体il-12分子的血液学刺激或增强特性的变化的优选方法是通过下文公开的致死照射救援方案。通过本领域公知的方法测定蛋白质或多肽性质的其他潜在修改，如氧化还原或热稳定性、疏水性、对蛋白质水解降解的敏感性或与载体聚集或聚集成多聚体的趋势。通常，il-12的产生刺激inf-γ的产生，inf-γ进而增强il-12的产生，从而形成正反馈回路。在体外系统中，据报道il-12可与其他细胞因子(例如il-3和scf)协同作用，以刺激早期造血祖细胞的增殖和分化(jacobsense等人,1993,j.expmed2:413-8；ploemacherre等人,1993,leukemia7:1381-8；hiraoa等人,1995,stemcells13:47-53)。施用nm-il-12的方法本公开内容提供了通过向受试者施用一个或多个生理剂量的il-12持续一段时间来实现所需治疗效果的治疗方法。受试者优选是哺乳动物，包括但不限于如牛、猪、马、鸡、猫、犬等动物，并且最优选是人。nm-il-12的“生理剂量”是这样的剂量，不管施用途径如何，都在外周血中产生通过针对il-12p70的标准elisa测量的一定范围的nm-il-12，该范围大于约1皮克/ml，但优选在约10至约100皮克/ml之间。在本发明的其他实施方案中，外源性生理剂量的il-12在外周血中产生的nm-il-12的量大于约1皮克/ml或大于约10pg/ml，且小于约100、小于约95、小于约90、小于85、小于约80、小于约75、小于约70、小于约65、小于约60、小于约55、小于约50、小于约45、小于约40、小于约35、小于约30、小于约25、小于约20、小于约15、小于约10或小于约5皮克/ml，或其任何组合，例如，大于约1pg/ml且小于约50pg/ml；或大于约1pg/ml且小于约15pg/ml；或大于约1pg/ml且小于约10pg/ml；或大于约10pg/ml且小于约50pg/ml；或大于约10pg/ml且小于约20pg/ml等等。各种递送系统是已知的并且可以用于根据本发明的方法施用il-12，例如，包封在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达il-12的重组细胞，受体介导的内吞作用(参见例如，wu和wu,1987,j.biol.chem.262:4429-4432)，构建包含il-12基因的核酸作为逆转录病毒或其他载体的一部分，等等。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。il-12可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注，通过上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身或局部的。局部递送的实例是amd的实例中的眼部递送。此外，可能需要通过包括脑室内注射和鞘内注射在内的任何合适途径将包含il-12的药物组合物引入中枢神经系统；脑室内注射可以通过脑室内导管来促进，例如，该导管附接到储液器如ommaya储液器。也可以采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器和具有雾化剂的制剂。可能需要将包含il-12的药物组合物局部施用于需要治疗的区域；这可以例如但不限于通过局部施加、通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物来实现，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜如硅橡胶(sialastic)膜，或纤维。il-12施用的其他模式涉及在囊泡特别是脂质体中递送(参见langer,science249:1527-1533(1990)；treat等人,inliposomesinthetherapyofinfectiousdiseaseandcancer,lopez-berestein和fidler(编著),liss,newyork,pp.353-365(1989)；lopez-berestein,同上,pp.317-327；通常参见同上)。施用il-12的其他模式涉及在控制释放系统中递送。在某些实施方案中，可以使用泵(参见langer,见上文；sefton,crccrit.ref.biomed.eng.14:201(1987)；buchwald等人,surgery88:507(1980)；saudek等人,n.engl.j.med.321:574(1989))。另外，可以使用聚合物材料(参见medicalapplicationsofcontrolledrelease,langer和wise(编著),crcpres,bocaraton,fla.(1974)；controlleddrugbioavailability,drugproductdesignandperformance,smolen和ball(编著),wiley.n.y.(1984)；ranger和peppas,j.macromol.sci.rev.macromol.chem.23:61(1983)；还参见levy等人,science228:190(1985)；during等人,ann.neurol.25:351(1989)；howard等人,j.neurosurg.71:105(1989))，或者控制释放系统可以放置在治疗靶标即大脑附近，从而仅需要全身剂量的一部分(参见例如，goodson,inmedicalapplicationsofcontrolledrelease,见上文,vol.2,pp.115-138(1984))。langer的综述(science249:1527-1533(1990))中讨论了其他控制释放系统。在一个方面，一个或多个有效剂量的il-12在局部、皮下、皮内、静脉内、腹腔、肌内、硬膜外、肠胃外、眼内、鼻内和/或颅内给药。nm-il-12的形式和剂量用于本发明实施方案的nm-il-12的合适剂型包含生理上可接受的、本质上是无毒和非治疗性的载体。这样的载体的实例包括离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白质如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物，水，盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶体硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素基物质和peg。用于局部或基于凝胶形式的il-12多肽的载体包括多糖如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、peg和木蜡醇。对于所有施用都适合使用常规的储库形式。这样的形式包括，例如微胶囊、纳米胶囊、脂质体、膏药、吸入剂形式、鼻喷雾剂、舌下片剂和持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有该多肽的固体疏水聚合物的半渗透性基质，该基质是成型制品例如薄膜或微胶囊的形式。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，langer等人(见上文)和langer(见上文)所述的聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)，或聚(乙烯醇)，聚乳酸(美国专利号3,773,919))、l-谷氨酸和γ-乙基-l-谷氨酸酯的共聚物(sidman等人，见上文)、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯(langer等人，见上文)、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如luprondepottm(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)和聚-d-(-)-3-羟丁酸。诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子持续超过100天，而某些水凝胶释放蛋白质持续较短的时间段。当包封的il-12多肽长时间保留在体内时，它们可能由于暴露于37℃的水分而变性或聚集，从而导致生物活性的丧失和免疫原性的可能变化。可以根据所涉及的机制设计合理的策略以实现稳定化。例如，如果发现聚集机制是通过硫-二硫化物交换形成分子间s—s键，则可以通过改变巯基残基，从酸性溶液冻干，控制水分含量，使用适当的添加剂以及开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。含有持续释放il-12的组合物还包括脂质体包埋的多肽。含有il-12多肽的脂质体通过本领域已知的方法制备，如eppstein等人,proc.natl.acad.sci.usa82:3688-3692(1985)；hwang等人,proc.natl.acad.sci.usa77:4030(1980)以及美国专利号4,485,045和4,544,545中所述。通常，脂质体是小(约200-800埃)单层类型，其中脂质含量大于约30mol.％胆固醇，调整所选比例以获得最佳wnt多肽疗法。具有增加的循环时间的脂质体在美国专利号5,013,556中公开。对于疾病的治疗，il-12多肽的合适剂量将取决于待治疗的疾病类型，如上所定义，疾病的严重程度和病程、先前的疗法、患者的临床病史和对本文公开的il-12治疗方法的反应以及主治医师的判断。根据本发明，il-12适合一次或经一系列治疗施用于患者。基于体重或固定的nm-il-2剂量：根据疾病的类型和严重程度，约10ng/kg至2000ng/kg的il-12是施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次单独施用，还是通过连续输注。或者，可以使用固定剂量的nm-il-12，如约40μg、约35μg、约30μg、约25μg、约20μg、约19μg、约18μg、约17μg、约16μg、约15μg、约14μg、约13μg、约12μg、约11μg、约10μg、约9μg、约8μg、约7μg、约6μg、约5μg、约4μg、约3μg、约2μg或约1μg。示例性剂量范围包括但不限于(i)大于约1μg且小于约20μg；(ii)约8μg直至约15μg；以及(iii)约10μg至约12μg。初始施用后nm-il-12的示例性维持剂量为约5μg至约10μg，然而，本文所述的任何剂量均可用于初始剂量或维持剂量。人可以安全地耐受约500ng/kg的重复剂量，至多约200ng/kg的单次剂量应该不会产生毒副作用。例如，该剂量可以与其他细胞因子如g-csf、gm-csf和epo的剂量相同。对于经过数天或更长时间的重复施用，根据病况，持续治疗直至出现所需的疾病症状抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的。通过常规技术和测定可以容易地监测该疗法的进展。本发明的另一方面涉及鉴定需要外源性il-12作为替代免疫治疗剂的受试者的方法。对体内细胞、组织或器官的根除、修复或再生具有确定的需要的受试者适合接受如本文所述的外源性il-12。然而，有需要的受试者具有小于约5pg/ml或小于约3pg/ml或小于约1pg/ml的il-12表达基线水平。通常，有需要的受试者的基线水平低于使用如本文所述的用于检测il-12p70的经验证测定法的检测限。因此，本发明鉴定了受益于本文所述方法的特定患者群体。在本发明的一个方面，治疗方法包括使用两种生理剂量水平(可以是不同的或相同的)的il-12：(i)治疗剂量的il-12和(ii)维持剂量的il-12。在一个实施方案中，il-12的治疗剂量大于约1μg且小于约20μg，然而，本文所述的任何il-12剂量均可用作治疗il-12剂量。在一个实施方案中，il-12的维持剂量大于约1μg且小于约10μg，然而，本文所述的任何il-12剂量均可用作维持il-12剂量。在示例性实施方案中，il-12的治疗剂量可以在外源性il-12的施用开始时定期给予，例如约每周一次、约每2周一次、约每3周一次、约每4周一次、约每5周一次或约每6周一次。在示例性实施方案中，il-12的维持剂量可以在初始施用期完成后给予，并且以例如约每1个月、约每2个月、约每3个月、约每4个月、约每5个月或约每6个月的频率给予。在本发明的另一个方面，施用于有需要的受试者的外源性生理剂量的il-12在外周血中产生一定范围的nm-il-12，如通过针对il-12p70的标准elisa所测量的，该范围大于约1皮克/ml且小于约200皮克/ml。值得注意的是，外周血中超过200pg/ml的il-12p70的水平可能没有益处。在其他实施方案中，外周血中nm-il-12的范围可大于约1pg/ml且小于约200pg/ml、小于约175pg/ml、小于约150pg/ml、小于约125pg/ml、小于约100pg/ml、小于约75pg/ml、小于约50pg/ml、小于约25pg/ml、小于约15pg/ml或小于约10pg/ml。在本发明的另一方面，在施用il-12后，除了受试者外周血中可测量的il-12水平外，外周血中ifn-γ也会伴随增加；并且/或者受试者外周血中可测量的il-12水平也显示外周血中ifn-g的增加，其中il-12给药后伴随的ifn-γ水平在约20pg/ml至约1000pg/ml的范围内。在其他方面，在il-12给药后ifn-γ的范围可为约1000pg/ml或更小、约900pg/ml或更小、约800pg/ml或更小、约700pg/ml或更小、约600pg/ml或更小、约500pg/ml或更小、约400pg/ml或更小、约300pg/ml或更小、约200pg/ml或更小、约100pg/ml或更小、约75pg/ml或更小或约50pg/ml或更小。本发明的另一方面是外周血中伴随的il-12p70和ifn-γ水平可以被认为是作为替代免疫治疗剂的疗效的标志物。如果在nm-il-12给药后，任一因子在血液中的水平从初始水平显著降低，则替代疗效的治疗性可能较低。在这种情况下，可以减少随后的nm-il-12剂量。下表8示出了在12μg的单次il-12剂量后，在患者血液中观察到的il-12量的范围。(这是在健康受试者中进行的药代动力学/药效学分析的一部分。)可以使用任何常规测定方法来测定人血浆中il-12的浓度。作为实例，并且并不旨在限制，可以通过酶联免疫吸附测定(elisa)或通过电化学发光免疫测定(msd)来确定人血浆中il-12(例如，nm-il-12)的浓度。elisa：该方法利用定量夹心酶联免疫吸附测定(elisa)测量人k2edta血浆中nm-il-12的浓度。将含有nm-il-12的标准物、对照和测试样品与预先用il-12捕获抗体包被的96孔板一起温育。温育后，然后洗去未结合的物质，并用人il-12检测抗体缀合物检测nm-il-12。温育后，然后洗去未结合的物质，并将底物溶液添加到孔中。最后，将放大溶液(amplifiersolution)添加到所有孔中，并且颜色与初始步骤中结合的nm-il-12的量成比例地显现。停止显色，并在490nm处测量颜色强度，波长校正设定为650nm。msd：在示例性测定中，将50微升标准物和验证样品添加到mesoscalediscoveryv-plex人il-12p70平板上的适当孔中。用盖子盖住平板并在平板振荡器(设定2-4)上室温温育约2小时。然后将平板用每孔约300μl的msd洗涤缓冲液洗涤三次。向平板添加25微升检测抗体。用盖子盖住平板并在平板振荡器(设定2-4)上室温温育约2小时。在与检测抗体温育后，将平板用每孔约300μl的msd洗涤缓冲液洗涤三次，并将2x读取缓冲液t分配到平板的每个孔中。立即在sectorimager6000(mesoscalediscovery)平板读取器上读板。使用log10转化数据(gen5securesoftware,biotekinstruments)的4-参数对数曲线拟合产生标准曲线。进一步地，任何常规测定均可用于本发明的方法中以测量ifn-γ的水平。实例如下：通过电化学发光免疫测定(msd)进行ifn-γ检测。将50微升的标准物和人血浆样品添加到mesoscalediscoveryproinflammatorypanel1(人)平板上的适当孔中。用盖子盖住平板并在平板振荡器(设定2-4)上室温温育约2小时。然后将平板用每孔约300μl的msd洗涤缓冲液洗涤三次。向平板添加25微升sulfo-tag抗-hu-ifn-γ抗体检测抗体。用盖子盖住平板并在平板振荡器(设定2-4)上室温温育约2小时。在与检测抗体温育后，将平板用每孔约300μl的msd洗涤缓冲液洗涤三次，并将2x读取缓冲液t分配到平板的每个孔中。立即在sectorimager6000(mesoscalediscovery)平板读取器上读板。使用log10转化数据(gen5securesoftware,biotekinstruments)的4-参数对数曲线拟合产生标准曲线。il-12可以与其他细胞因子一起通过直接共同施用或顺序施用来施用。当一种或多种细胞因子与il-12共同施用时，可以使用较少剂量的il-12。其他细胞因子(即除il-12外的细胞因子)的合适剂量为约1ug/kg至约15mg/kg的细胞因子。例如，该剂量可以与其他细胞因子如g-csf、gm-csf和epo的剂量相同。其他细胞因子可以在施用il-12之前、同时或之后施用。细胞因子和il-12可以组合形成药物组合物以同时施用于哺乳动物。在某些实施方案中，il-12和细胞因子的量使得在施用il-12和其他细胞因子后，在哺乳动物中出现血细胞的协同再增殖(repopulation)(或造血细胞增殖和/或分化的协同增加)。换句话说，两种或更多种药剂(即il-12和一种或多种细胞因子)在血细胞再植(或造血细胞的增殖/分化)方面的协同作用大于这些分子的单独效果的加和。通过将具有所需纯度等级的il-12与任选的生理学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(remington’spharmaceuticalsciences,第16版,osol,a编著,(1980))混合来制备il-12治疗制剂以供以冻干饼或水溶液形式的储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如edta；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；成盐反离子如钠；和/或非离子表面活性剂如pluronicstm或聚乙二醇(peg)。如本文所用，术语“缓冲剂”表示药学上可接受的赋形剂，其稳定药物制剂的ph。合适的缓冲剂是本领域公知的并且可见于文献中。药学上可接受的缓冲剂包括但不限于组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、精氨酸缓冲剂或其混合物。上述缓冲剂通常以约1mm至约100mm、约5mm至约50mm，和约10-20mm的量使用。缓冲溶液的ph可为至少4.0、至少4.5、至少5.0、至少5.5或至少6.0。缓冲溶液的ph可为小于7.5、小于7.0或小于6.5。缓冲溶液的ph可为约4.0至约7.5、约5.5至约7.5、约5.0至约6.5和约5.5至约6.5，具有本领域已知的酸或碱，例如盐酸、乙酸、磷酸、硫酸和柠檬酸，氢氧化钠和氢氧化钾。如本文所用，当描述ph时，“约”意指加或减0.2个ph单位。如本文所用，术语“表面活性剂”可包括药学上可接受赋形剂，其用于保护蛋白质制剂免受机械应力如搅拌和剪切。药学上可接受的表面活性剂的实例包括聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(吐温)、聚氧乙烯烷基醚(brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(triton-x)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，pluronic)和十二烷基硫酸钠(sds)。合适的表面活性剂包括聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，如聚山梨酸酯20(以商标tween出售)和聚山梨酸酯80(以商标tween出售)。合适的聚乙烯-聚丙烯共聚物是以名称f68或poloxamer出售的那些。合适的聚氧乙烯烷基醚是以商标出售的那些。合适的烷基酚聚氧乙烯醚以商品名triton-x出售。当使用聚山梨酸酯20(tween)和聚山梨酸酯80(tween)时，它们通常以约0.001％至约1％、约0.005％至约0.2％和约0.01％至约0.1％w/v(重量/体积)的浓度范围使用。如本文所用，术语“稳定剂”可包括药学上可接受的赋形剂，其在制造、储存和应用期间保护活性药物成分和/或制剂免于化学和/或物理降解。蛋白质药物的化学和物理降解途径由cleland等人,crit.rev.ther.drugcarriersyst.,70(4):307-77(1993)；wang,int.j.pharm.,7s5(2):129-88(1999)；wang,int.j.pharm.,203(1-2):1-60(2000)；和chi等人,pharm.res.,20(9):1325-36(2003)综述。稳定剂包括但不限于糖、氨基酸、多元醇、环糊精，例如羟丙基-β-环糊精、磺丁基乙基-β-环糊精、β-环糊精，聚乙二醇，例如peg3000、peg3350、peg4000、peg6000，白蛋白，人血清白蛋白(hsa)，牛血清白蛋白(bsa)，盐，例如氯化钠、氯化镁、氯化钙，螯合剂，例如edta，如后文所定义的。如上文所提及的，稳定剂可以约10mm至约500mm的量、约10mm至约300mm的量或约100mm至约300mm的量存在于制剂中。在一些实施方案中，示例性il-12可以溶解在合适的药物制剂中，其中它是稳定的。il-12也可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)，包埋在胶体药物递送系统中(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)，或包埋在粗乳液中。这样的技术在remington’spharmaceuticalsciences(见上文)中公开。用于体内施用的il-12必须是无菌的。这可以通过在冻干和重构之前或之后通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。il-12以冻干形式或在溶液中储存。通常将治疗性il-12组合物置于具有无菌入口的容器中，例如具有可由皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射溶液袋或小瓶。当局部施加时，将il-12适当地与其他成分如载体和/或佐剂组合。对这样的其他成分的性质没有限制，但它们必须是生理学上可接受的并且对于它们的预期施用有效，并且不能降低组合物的活性成分的活性。合适的媒介物的实例包括具有或没有纯化胶原的软膏、乳膏、凝胶或悬浮液。组合物还可以浸渍到经皮贴剂、膏药和绷带中，优选呈液体或半液体形式。为了获得凝胶制剂，可以将配制在液体组合物中的il-12与有效量的水溶性多糖或合成聚合物如peg混合以形成适当粘度的凝胶，用于局部施加。可以使用的多糖包括，例如，纤维素衍生物如醚化纤维素衍生物，包括烷基纤维素、羟烷基纤维素和烷基羟烷基纤维素，例如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素和羟丙基纤维素；淀粉和分馏淀粉；琼脂；海藻酸和藻酸盐；阿拉伯树胶；pullullan；琼脂糖；卡拉胶；葡聚糖；糊精；果聚糖；菊粉；甘露聚糖；木聚糖；阿拉伯聚糖；壳聚糖；糖原；葡聚糖；和合成生物聚合物；以及胶如黄原胶；瓜尔豆胶；刺槐豆胶；阿拉伯胶；西黄蓍胶；和刺梧桐树胶；及其衍生物和混合物。本文优选的胶凝剂是对生物系统呈惰性，无毒，易于制备，并且不太流动或粘稠的胶凝剂，并且不会使保持在其中的il-12分子不稳定。优选地，多糖是醚化纤维素衍生物，更优选在usp中明确定义、纯化和列出的多糖，例如甲基纤维素和羟烷基纤维素衍生物如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。本文最优选的是甲基纤维素。可用于胶凝的聚乙二醇通常是低分子量和高分子量peg的混合物，以便获得适当的粘度。例如，当以适当的比例混合以获得糊剂时，分子量400-600的peg与分子量1500的peg的混合物对此目的是有效的。应用于多糖和peg的术语“水溶性”意指包括胶体溶液和分散体。通常，纤维素衍生物的溶解度由醚基基团的取代程度度决定，并且用于本文的稳定化衍生物在纤维素链中的每个脱水葡萄糖单元应具有足够量的这种醚基以使衍生物具有水溶性。每个脱水葡萄糖单元具有至少0.35个醚基基团的醚取代程度通常是足够的。另外，纤维素衍生物可以是碱金属盐的形式，例如li、na、k或cs盐。如果在凝胶中使用甲基纤维素，其优选构成凝胶的约2-5％、更优选约3％，并且il-12以约300-1000mg/ml凝胶的量存在。治疗上使用il-12的有效量将取决于例如治疗目标、施用途径和患者的病况。因此，治疗者需要滴定剂量并根据需要改变施用途径以获得最佳治疗效果。通常，临床医生将施用il-12直至达到实现所需效果的剂量。根据上述因素，全身治疗的典型剂量可以为约10ng/kg至高达2000ng/kg或更高的范围。在一些实施方案中，剂量范围可以为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19至约20、至约30、至约50、至约100、至约200、至约300或至约500ng/kg。在一个方面，剂量低于500ng/kg。在另一个方面，剂量低于300ng/kg。在另一个方面，剂量低于约200ng/kg。在另一个方面，剂量低于约100ng/kg。在另一个方面，剂量低于约50ng/kg。在其他方面，剂量可以为约10至300ng/kg、20至40ng/kg、25至35ng/kg、50至100ng/kg的范围。在一个方面，本文所述的示例性治疗组合物可以以分次剂量施用。在一个实施方案中，在每一次前给予治疗有效剂量。在一个实施方案中，治疗有效剂量与施用每个化疗剂量或剂量部分大约同时给予。在一个实施方案中，治疗有效剂量在每一次前给予，在每一次前5、10、15、20、25、30、35、40、50或60分钟；或每一次后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个小时；或每一次前1、2、3、4、5、6、7天。在一个实施方案中，治疗有效剂量在每一次后给予，在每一次后5、10、15、20、25、30、35、40、50或60分钟；或每一次后2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个小时；或每一次后1、2、3、4、5、6、7天；或在化疗和/或联合化疗/放疗期间或之后每周、每两周或每两个月1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次。在另一个实施方案中，一个或多个示例性剂量的il-12在每次化疗剂量之前或之后的约5、10、15、20、30、40、50、60分钟、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天施用(1至100ng/kg)。作为替代的一般性建议，配制il-12受体并将其以能够在组织中建立大于约0.1ng/cc的il-12水平的剂量直至有效但没有过度毒性的最大剂量递送至靶位点或组织。如果可能，应通过施用方案维持组织内浓度，包括通过连续输注、持续释放、局部施加或以经验确定的频率注射。通过常规测定可以容易地监测该疗法的进展。“接近治疗的施用时间”是指在治疗的施用之前和/或之后的任何合理时间段施用il-12，例如约一个月、约三周、约两周、约一周、数天、约120小时、约96小时、约72小时、约48小时、约24小时、约20小时、数小时、约一小时或数分钟。接近治疗的施用时间还可以指治疗和il-12的同时或几乎同时施用，即在数分钟至一天内施用。iii.定义为了本公开内容的目的，以下定义应当以其整体用于定义技术术语以及定义在权利要求书中寻求保护的物质组合物的范围。如本文所用，术语“约”将是本领域普通技术人员所理解的，并且在某种程度上根据其使用的上下文而变化。如果该术语的使用在其所用于的上下文中对本领域普通技术人员来说是不明确的，则“约”将意指特定术语的加或负减至多10％。“骨髓保存”是指受辐射、化疗、疾病或毒素损害的骨髓维持在其正常或接近正常状态的过程；“骨髓恢复”是指受辐射、化疗、疾病或毒素损害的骨髓恢复到其正常、接近正常状态的过程，或者获得骨髓功能的任何可测量的改善的过程；骨髓功能是从造血(血液)干细胞产生适当水平的各种血细胞类型或谱系的过程。“骨髓衰竭”是一种病理过程，其中受辐射、化疗、疾病或毒素损害的骨髓不能恢复正常，并且因此无法产生足够的血细胞来维持哺乳动物的正常血细胞生成。“化疗”是指包括医学领域中现在已知或有待开发的天然或合成药剂的任何疗法。化疗的实例包括目前可获得的众多抗癌药物。然而，化疗还包括旨在治疗疾病状态的任何天然或合成药物。在本发明的某些实施方案中，化疗可包括施用旨在治疗疾病状态的几种现有技术药物。实例包括针对患有局部晚期头部鳞状细胞癌的患者的采用多西紫杉醇、顺铂和5-氟尿嘧啶的联合化疗(tsukuda,m.等人,intjclinoncol.2004年6月；9(3):161-6)以及用于难治性和复发性缓慢进展淋巴瘤的氟达拉滨和苯达莫司汀(konigsmannm等人,leuklymphoma.2004；45(9):1821-1827)。“放疗”是指其中使用任何形式的辐射来治疗疾病状态的任何疗法。产生用于放疗的辐射的仪器是目前可获得的或将来可获得的那些仪器。如本文所用，放疗“治疗方式”可包括电离辐射源和非电离辐射源。示例性电离辐射治疗方式可包括，例如外线束放疗；调强放疗(imrt)；图像引导放疗(igrt)；x线照射(例如光子束疗法)；电子束(例如β照射)；质子辐照；高线性能量转移(let)颗粒；立体定向放射外科；伽玛刀；线性加速器介导的无框架立体定向放射外科；机械臂控制的x线照射输送系统；放射性同位素放疗，用于器官特异性或癌细胞特异性摄取；放射性同位素与单克隆抗体结合用于肿瘤靶向放疗(或放射免疫疗法，rit)；近距离放射疗法(间质或腔内)高剂量率放射源植入；永久放射性粒子植入，用于器官特异性剂量输送。“改善缺陷”是指造血缺陷的减少(即，缺陷的改善)或当前医学实践所定义的正常状态的部分或完全恢复。因此，造血缺陷的改善是指广泛或特定地增加、刺激、增强或促进造血作用。可以观察到造血缺陷的改善是广泛的，即，增加两种或更多种造血细胞类型或谱系，或特异性的，即增加一种造血细胞类型或谱系。“骨髓细胞”通常是指存在于和/或归巢于哺乳动物骨髓腔的细胞。术语“骨髓细胞”不仅包括来源于造血细胞的细胞，包括但不限于造血再植细胞、造血干细胞和/或祖细胞，还包括可能来源于骨髓的任何细胞，如内皮细胞、间充质细胞、骨细胞、神经细胞、支持细胞(基质细胞)，包括但不限于这些和其他细胞类型和谱系的相关干细胞和/或祖细胞。“造血细胞类型”通常是指各种类型的分化的造血细胞，但也可以包括来自产生特定造血细胞类型的造血祖细胞，例如指代与血细胞产生相关的所有细胞类型的各种胚细胞，包括干细胞、祖细胞和各种谱系细胞，如髓样细胞、淋巴样细胞等。“造血细胞谱系”通常指分化的造血细胞的特定谱系，例如髓样细胞或淋巴样细胞，但也可以指更分化的谱系如树突细胞、红细胞等。细胞的“il-12促进的增殖”是指血细胞生成的增加、刺激或增强，其至少部分归因于通常存在于或归巢于哺乳动物骨髓中的细胞(如造血祖细胞和/或干细胞)的扩张或增加，但该细胞包括组成骨髓壁龛的微环境的其他细胞。“血细胞生成的刺激或增强”通常是指一种或多种造血细胞类型或谱系的增加，并且尤其涉及在哺乳动物缺乏一种或多种造血细胞类型或谱系的情况下刺激或增强一种或多种造血细胞类型或谱系。“造血长期再植细胞”通常是骨髓中最原始的血细胞；它们是血液干细胞，负责提供各种血细胞类型和谱系的终身产生。“造血干细胞”通常是血液干细胞；有两种类型：如上定义的“长期再植”和可以在短周期(数周、数个月甚至有时数年，取决于哺乳动物)产生“祖细胞”的“短期再植”。“造血祖细胞”通常是从血液干细胞分化(即成熟)的第一类细胞；然后它们分化(成熟)成各种血细胞类型和谱系。“造血支持细胞”是骨髓的非血细胞；这些细胞为血细胞产生提供“支持”。这些细胞也称为骨髓基质细胞。如本文所用，“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。“动物”包括冷血和温血的脊椎动物和无脊椎动物，如鱼、贝类、爬行动物，特别是哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠；大鼠；兔；豚鼠；犬；猫；绵羊；山羊；牛；马；灵长类动物，如猴、黑猩猩、猿，以及胎儿、儿童和成年人。如本文所用，“预防”或“保护”意指全部或部分地预防，或改善或控制。如本文所用，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防范性措施，或施用疑似具有治疗潜力的药剂。如本文所用，术语“药学有效量”是指在研究人员、兽医、医生或其他临床医生正在探索的在组织、系统、动物或人中引发生物或药物反应的活性化合物或药剂的量，该反应包括所治疗疾病的症状的缓解或减轻。如本文所用，关于本公开内容的药物组合物的“有效量”是指足以具有效用并提供所需治疗终点的量。在一个实施方案中，治疗方式/方案是加速分次疗法。在加速分次疗法中，每次剂量不变而每日剂量增加，并且治疗的总时间减少。联合(顺序或同时)疗法可以是共同施用或共配制。实施例现在根据以下实施例描述本发明。提供这些实施例仅出于说明的目的，并且本发明不限于这些实施例，而是包括由于本文提供的教导而显而易见的所有变化。实施例1：图32描述了鼠il-12促进经照射小鼠的造血恢复。针对il-12rβ2染色(橙色)的来自未经照射的未治疗小鼠的股骨骨髓的代表性切片在图32a和图32b中示出。动物经受tbi(8.0gy)，并且随后在照射后的指定时间皮下接受媒介物(图32b和图32c)或rmuil-12(20ng/小鼠)(图31d和图32e)。在照射后12天对股骨骨髓进行针对il-12rβ2的免疫组织化学染色(橙色)。用媒介物治疗的小鼠的骨髓缺乏表达il-12rβ2的细胞并且没有显示出造血再生的迹象(图32c)，而用rmuil-12治疗的小鼠显示出造血重建并存在表达il-12rβ2的巨核细胞、髓样祖细胞和成骨细胞(图32e和图32f)。实施例2：示例性首次人体(fih)临床研究的总结和设计题为hemamaxtm(rhuil-12)在健康成人志愿者中的安全性、耐受性、药代动力学和药效学的1期、双盲、安慰剂对照、单次上升剂量研究(aphase1,doubleblind,placebo-controlled,singleascendingdosestudyofthesafety,tolerability,pharmacokinetics,andpharmacodynamicsofhemamaxtm(rhuil-12)inhealthyadultvolunteers)(ind104,091)的研究被设计用于确定安全性和耐受性，次要目标是评估单次上升皮下(sc)剂量的hemamaxtm在健康成人受试者中的药代动力学和免疫原性。招募多达30名年龄在18-45岁的健康男性和女性成人受试者进入4个连续的群组，每个群组6名受试者，并且在每个剂量水平使用前哨(sentinel)受试者。在腹部施用单次皮下注射的研究产品(hemamaxtm或安慰剂)，剂量水平为2、5、10和20μg。每个剂量水平以双盲方式评估6个受试者的群组(安慰剂n＝2，hemamaxtmn＝4)。可以招募n＝6名受试者(2名安慰剂和4名hemamaxtm)的另外的扩展群组来接受在研究的递增剂量部分中施用的最高剂量(或安慰剂)。实施例3：nm-il-12药剂师以填充注射器的形式制备hemamaxtm给药溶液，用于向受试者注射。在该试验中，研究产品(ip)由在2ml透明小瓶中的hemamax(rhuil-12)药物产品组成。hemamax(rhuil-12)药物产品小瓶含有0.65ml在含0.1％(w/v)泊洛沙姆188的10mm磷酸钠、150mm氯化钠(ph6.0)中的20μg/mlrhuil-12蛋白质(抽取体积0.50ml)。这些溶液澄清无色。从冰箱中取出小瓶，在准备给药前让其在室温下静置至少15分钟。带有分离的25g5/8针头的具有聚丙烯针筒的bd注射器，或bd结核菌素注射器(目录号305553，附有27g1/2针头)已被证明是兼容的。具有制备的溶液的注射器可以在室温下保持6小时。如果需要更长的储存时间，注射器可以在2-8℃下储存24小时。如果使用带有单独针头的注射器，将给药注射器过量填充约0.1ml，然后取下针头并更换新的针头，轻轻地排出，直至达到适当的剂量。实施例4：如本实施例所证明的，il-12不是在体内组成型产生的。测试了110名受试者，并且没有发现高于定量下限(lloq)的il-12的水平。il-12和ifn-γ基线水平：图35a和图35b中示出的盒须图描述了110名受试者的il-12和ifn-γ基线水平，其中须覆盖5％-95％的基线值。使用试剂盒标准曲线确定il-12基线水平。如图35a所示，110名受试者的所有给药前il-12水平均低于定量限(blq)(lloq＝0.367pg/ml)。几乎所有ifn-γ水平均在lloq(lloq＝1.08pg/ml)之上可定量，大多数在低pg/ml范围内。五个高端异常值显示ifn-γ的基线水平>23pg/ml，包括受试者1033和1055。虽然已经根据具体实施方案公开了本发明，但显而易见的是，本领域技术人员可以在不脱离本发明的真实精神和范围的情况下设计出本发明的其他实施方案和变化形式。所附权利要求包括所有这样的实施方案和等同变化形式。***本文引用或提及的所有专利、出版物、科学文章、网站和其他文件和材料表明本发明所属领域的技术人员的技术水平，并且每个这样的参考文件和材料均通过引用并入本文，其程度如同单独地以其整体并入本文或以其整体在本文中阐述。申请人保留将来自任何这些专利、出版物、科学文章、网站、电子可用信息和其他参考材料或文件的任何和所有材料和信息实际并入本说明书的权利。本文描述的具体方法和组合物是优选实施方案的代表，并且是示例性的，而不旨在限制本发明的范围。本领域技术人员在考虑本说明书后，将想到其他对象、方面和实施方式，并且它们包含在由权利要求书的范围限定的本发明的精神内。对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，可以对本文公开的发明进行各种替换和修改。本文说明性地描述的发明可以在不存在没有在本文中具体公开为要素的任何要素或限制的情况下适当地实践。因此，例如，在本文的每种情况下，在本发明的实施方案或实施例中，术语“包含”、“基本上由……组成”和“由……组成”中的任何一个在说明书中可以用其他两个术语的任一个替换。此外，术语“包含”、“包括”、“含有”等应被宽泛地理解而没有限制。本文说明性地描述的方法和过程可以适当地以不同的步骤顺序实践，并且它们不一定限于本文或权利要求书中指出的步骤顺序。如本文和所附权利要求书中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。在任何情况下，本专利都不应被解释为受本文具体公开的具体实施例或实施方案或方法的限制。在任何情况下，本专利都不应被解释为受专利商标局的任何审查员或任何其他官员或雇员所作的任何陈述的限制，除非申请人在书面回复中明确采用这样的陈述，且没有任何条件或保留。已采用的术语和表达用作描述性术语而非限制性术语，并且无意使用这些术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应该认识到，在要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方案和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以采用本文公开的概念的修改和变化形式，并且这些修改和变化形式被认为落入由所附权利要求限定的本发明的范围内。本文宽泛且一般性地描述了本发明。落入总体公开内容中的每个较窄的物种和亚属群组也构成本发明的一部分。这包括具有从该属中去除任何主题内容的附带条件或否定限制的本发明的总体描述，无论是否在本文中具体记载了去除的材料。其他实施方案在以下权利要求书内。另外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，本发明也由此对马库什组的任何个体成员或成员亚组进行了描述。当前第1页12