利用核酸适体的防止抗氧化物质被氧化的方法、物质、其用途与流程

本发明涉及利用核酸适体的防止抗氧化物质被氧化的方法、物质、其用途。
背景技术：
：在抗氧化物质中作为代表性的成分之一的抗坏血酸(ascorbicacid)(维生素c(vitaminc))由于通过其自由基的中性化的抗氧化活性，广泛使用于医药、化妆品、食品以及饮料产业中。据报道，当用作食品补充剂和/或医药活性成分时，aa的优点为通过供给添加有aa的饮用水来抑制会在产业灾害(轮胎及橡胶工厂、化妆品制备工厂)中发生的因吸收znonps而引起的急性肺细胞氧化过程。在规模达数十兆韩元的这些产业中，以共同使用维生素c作为主要解决方案。aa由于其抗氧化能力而本质上可通过氧化容易被分解。影响aa的氧化的主要因素为温度、ph、氧、金属离子、光以及酶等。在使用aa作为主要成分的产业中，由于这种氧化分解的特性而对产品的保存时间及效果都产生影响，因此这很久以前开始就被认为是所面临的问题。因而，在这些产业中，不仅是在对aa的氧化性分解的理解的方面，而且在开发并发现更新的且更优秀的方法的方面上投入研究和费用。另一方面，促进老化的原因有多种，但在这些原因中被认为活性氧类(reactiveoxygenspecies，ros)为相当重要的原因之一。这种活性氧的生成在能量代谢过程、免疫反应等中不可或缺且由外界的有害环境引起的不可避免的刺激。活性氧的反应性非常大，从而在体内引起dna变性、过度的信号传递诱发以及蛋白质变性等，因此会产生累积对健康有害的影响的一系列反应。但是，这种有害反应通过存在于体内的抗氧化物质(尿酸(uricacid)、vit.c、vit.e等)或抗氧化酶(谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxidase)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase)、过氧化氢酶(catalase)等)精细地维持其稳态。然而，基于内源性老化的抗氧化体统的衰老和基于持续性的有害刺激的活性氧的积累破坏这种均衡而损害健康并促进老化，且诱发如皮肤疾病、皮肤癌、动脉硬化以及血栓等各种疾病(laurerittieetal.，ageingresearchreviews，1，705-720，2002；cutlerrg，annalsofthenewyorkacademyofsciences，1055，93-135，2005)。因此，对抑制活性氧类的形成或者去除所形成的活性氧类的抗氧化物质的关注度日益增加。抗氧化物质可分为在人体内自然存在的抗氧化物质和从外界给药的抗氧化物质，作为在人体内自然存在的抗氧化物质，有过氧化抑制酶(超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，sod))，谷胱甘肽(glutathione)，过氧化物酶(peroxidase)以及过氧化氢酶(catalase)等酶，作为从外界给药的抗氧化物质，有堪非醇(kaempferol)、儿茶酚(catechin)以及染料木黄酮(genistein)等植物化学素(phytochemical)；维生素e、维生素c以及β-胡萝卜素；以及硒等矿物质。细胞受由于从日光照射的紫外线a(uva)和紫外线b(uvb)、污染物质、压力、吸烟、饮酒、脂肪性食物等而产生的自由基(freeradical)和活性氧(oxygenfreeradical)等的攻击，在从这种物质不能够受到适当保护的情况下，引起细胞老化或凋亡。由于这种物质而皮肤所生成的胶原蛋白或弹性蛋白等物质减少或变性，因此皮肤丧失弹性且产生皱纹。为了防止这些现象，在皮肤涂敷包含维生素a、维生素c、维生素e等抗氧化物质的制剂或将其吸收至皮肤内，从而利用防止由这种有害活性物质引起氧化的方法来防止老化为很重要是已公知的事实。但是，存在合成维生素c在空气中容易被氧化而丧失其抗氧化作用的问题，因此无法制备保管时间长的多种剂型。并且，还原力非常高的维生素c对氧化电位高的物质非常敏感而产生反应，因此维生素c被急剧氧化。由于维生素c被氧化而丧失其功效是众所周知的。当然，因氧化电位高而维生素c非常敏感地进行反应，从而被急剧氧化。因此，对抑制包含维生素c的抗氧化物质的氧化的新的方法或物质的需求是很久以前开始就存在的。并且，相比于以往的方法，利用核酸适体来防止抗氧化物质被氧化的方法为安全且创新的新的概念，能够以将其适用于各种产业中而使效果极大化的方式制备。尤其，将成为将以往的基于化学方法(chemical)制备的化妆品、膳食补充剂、食品市场飞跃性地改变为基于dna(bio)的市场的导火索。而且，在各种产业中能够以多种方式利用。今后，可预期提供dna市场的爆发性的增加和创新的解决方案。现有专利文献韩国专利公告第10-1197677号技术实现要素：技术问题本发明鉴于如上所述的必要性而提出，本发明的目的在于，提供防止抗氧化物质被氧化的方法。本发明的再一目的在于，提供具有防止抗氧化物质被氧化的作用的物质。本发明的另一目的在于，提供利用具有防止与抗氧化成分相结合的抗氧化成分被氧化的作用的物质进行功能化的水凝胶。其化合物质具有调节皮肤活性成分的释放(release)速度并根据从皮肤分泌的特定物质的量调节皮肤活性物质的释放成分的功能。本发明的还有一目的在于，提供防止抗氧化成分被氧化的作用的物质在化妆品、头发营养剂、染发剂以及局部皮肤治疗剂或膳食补充剂中的用途。本发明的又一目的在于，提供通过维持维生素c的还原状态来长时间维持其抗氧化功能的物质。本发明的又一目的在于，通过在水等液体中长时间维持维生素c的还原状态的方法来制备饮料及食品。解决问题的手段为了实现如上所述的目的，本发明提供对抗氧化物质处理核酸适体来降低抗氧化物质的氧化速度，从而维持其还原力的方法。在本发明的一实例中，优选地，上述抗氧化物质为选自由维生素c、维生素a、视黄醇、维生素e、虾青素、白藜芦醇、多酚、辅酶q10、肽以及油组成的组中的物质，但并不限定于此。在本发明的一实例中，作为上述核酸适体的一例，优选地，上述核酸适体由序列1或序列2中所记载的碱基序列构成，但除此之外，如通过本发明的实施例等所证实，上述核酸适体还具有其他序列，而且达成本发明所要实现的效果的所有核酸适体包括在本发明的保护范围内。在本发明的另一实施例中，优选地，在上述抗氧化物质为维生素c的情况下，核酸适体抑制维生素c的内酯环的第二个oh基及第三个oh基的氧化，但并不限定于此。在本发明中，将aptamin定义为抗氧化物质和核酸适体的复合体。例如，aptaminc是指维生素c和核酸适体的复合体。1.利用基于核酸适体(aptamer)的水凝胶(hydrogel)的化妆品应用例，本发明提供降低抗氧化物质的氧化速度的核酸适体。本发明提供捕获有核酸适体的水凝胶的制备方法，包括：步骤a)，将胺基与上述本发明的核酸适体相结合；步骤b)，将水凝胶单体的羟(hydroxyl)基硅烷化为具有环氧(epoxy)基的3-缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷(3-glycidoxypropyltrimethoxysilane，3-gptms)后，在环氧基结合与上述核酸适体相结合的胺基；以及步骤c)，聚合上述水凝胶单体。在本发明的一实例中，上述捕获有核酸适体的水凝胶的制备方法的特征在于，包括如下的步骤：在与上述步骤a)的核酸适体相结合的胺基结合生物素后与具有链霉亲和素的粒子进行反应之后，当进行水凝胶聚合反应时，将具有上述核酸适体的粒子与水凝胶单体混合。在本发明的其他实例中，优选地，上述捕获有核酸适体的水凝胶的制备方法的特征在于，通过化学方法将附着于核酸适体的胺基或羧基与水凝胶的羟基相结合，但并不限定于此。并且，本发明提供通过上述本发明的捕获有核酸适体的水凝胶的制备方法制备而成的水凝胶。在本发明的一实例中，上述水凝胶的特征在于，在水凝胶表面附着有核酸适体，且在上述核酸适体的末端附着有特定成分，优选地，上述特定成分的特征在于，为具有防止皮肤老化、去除皱纹、美白、保湿效果的成分，但并不限定于此。并且，本发明的特定成分可使用在化妆品中使用的所有原料，而与任何种类的提取物、活性物质无关。例如，适用有助于美白的绿茶提取物、甘草提取物、楮树提取物、桑白皮提取物、黄金提取物、葛根提取物、红参提取物；有助于预防老化的杏提取物、油提取物、橙子提取物、柠檬提取物、竹子提取物、番石榴提取物、迷迭香提取物、山茱萸提取物、灵芝提取物、银杏提取物、西施玉容散提取物、玉竹(polygonatumodoratum)提取物；有助于保湿的木瓜提取物、白木莲提取物、彩椒提取物、芦荟提取物、丝瓜络提取物、海草提取物；具有抗氧化效果的胡萝卜提取物、大豆提取物、西柚籽提取物、葡萄籽提取物、马齿苋提取物；有助于改善皱纹的鱼子酱、石榴、人参提取物；有助于皮肤再生的桃提取物、川芎提取物；对过敏性皮肤具有效果的积雪草提取物、黄春菊提取物、紫草根提取物、苦参提取物、当归提取物；有助于祛痘的薄荷提取物、三白草提取物、鱼腥草提取物、芍药提取物；有助于抗炎及抗菌的牧草液、蒲公英提取物、金盏花提取物、黄檗皮提取物、枳实提取物、黄金提取物、茴香提取物、紫草提取物；有助于收缩毛孔的栗皮提取物、绿茶提取物；具有保湿功能的甘油、泛酰醇、透明质酸、神经酰胺、β-葡聚糖；具有美白效果的熊果素、维生素c、美白剂(whitense)、视黄醇、虾青素、白藜芦醇、多酚；有助于弹性的弹性蛋白、胶原蛋白、辅酶q10、双甲苯喘定、egf；作为抗炎症抗菌剂的蜂胶、尿囊素、植物甾醇(phytostan)、inflacin；作为抗氧化剂的维生素e(天然生育酚)、roe(迷迭香油提取物)、西柚籽提取物等多种提取物。并且，本发明提供包含上述本发明的捕获有核酸适体的水凝胶的化妆品组合物。并且，本发明提供如下的方法，即，通过向皮肤涂敷上述本发明的捕获有核酸适体的水凝胶，使与成分相结合的核酸适体从上述水凝胶向皮肤内渗透后，根据使与上述成分相结合的核酸适体与靶物质相结合后从皮肤分泌的靶物质的量调节皮肤活性物质的释放的方法。在本发明的一实例中，优选地，上述靶物质为腺嘌呤核苷三磷酸(atp)，但并不限定于此。将利用本发明的核酸适体进行功能化的抗氧化物质捕获在水凝胶，从而抑制维生素c、肽、视黄醇等皮肤美白、改善皱纹、防止老化等以证实卓越的功效的物质的氧化，并从胶质体缓慢地释放，因此可期待更好的效果。下面，概括本发明的利用核酸适体-水凝胶的化妆品原料/材料的用途。众所周知，用作维生素c、肽、视黄醇等功能性化妆品的主要材料的物质为非常不稳定的物质，因此在暴露于空气中的情况下，容易与氧相结合(氧化)而迅速丧失其功能。通过核酸适体捕获这些物质来抑制这些物质与氧相结合(氧化作用)，从而赋予最大限度地使这些物质稳定地持续(功能的持续)的作用。在大部分为水凝胶的情况下，由于它们的结构不够紧密而对多种种类的物质的透过率高，因此容易释放所包含的物质。在水凝胶包含与特定皮肤活性物质产生反应的核酸适体的情况下，通过实验已证实，可通过调节核酸适体对物质的结合力来调节此物质的分泌速度。以根据从皮肤分泌的特定物质的量调节皮肤活性物质的释放成分作为功能。称为适配子传感(aptasensing)的此技术为更快地感测皮肤的各种状态并根据其状态向皮肤释放必要的物质的方法，是在美容及治疗等多个方面上可利用的方法。核酸适体感测到根据皮肤的温度而以其他浓度分泌的atp或者根据皮肤的状态而分泌的细胞因子(cytokines)等后据此可体现分泌皮肤活性成分的系统。因此，可设计为可通过分泌适当量的抗老化物质来调节持续时间或者减少对皮肤造成不必要的过负荷。核酸适体具有与抗原-抗体反应相似但物质的大小非常小且可通过利用单链dna(singlestranddna)或rna的三维结构检测特定物质的方法等多种方法调节其活性并在生产和保管方面上比抗体更容易的优点。并且，与抗体不同地，可合成与大小非常小的化学物质(维生素)等相结合的核酸适体，并通过化学合成来制备，因此，一定程度上容易地维持其功效。维生素c作为水溶性的6个碳化合物，有呋喃(furan)环的3-、4-、碳以二羟基(dihydroxy)形态存在的还原型和其部位分别被氧化的半脱氢抗坏血酸(semi-dehydroascorbicacid)以及脱氢抗坏血酸(dehydroascorbicacid)。通过构成本发明的核酸适体(rna或dna)的碱基与维生素c的羟基(hydroxylgroup)的氢键结合来维持维生素c的还原状态(图1)。可将与本发明的核酸适体相结合而维持还原状态的维生素c使用于包含胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸、肽等的乳霜型或水凝胶型等多种剂型的皮肤美容组合物和膳食补充剂。本发明还包括通过根据皮肤或外界刺激(例如，紫外线或皮肤的温度或酸度)而引起不同反应的核酸适体(适配子传感)并根据皮肤的多种状态慢慢释放维生素c的方法。例如，包括如下的方法，即，若核酸适体的结构随着对皮肤的紫外线照射而改变，则所结合到的维生素c被释放，或者若atp量随着皮肤的温度或酸度的变化而改变，则与其相结合的核酸适体的结构改变，从而释放维生素c。并且，在本发明中，使用包含上述本发明的核酸适体和抗氧化物质复合体作为有效成分的多种剂型(美容液(serum)、凝胶(gel)、乳液(lotion)、乳霜(cream)、tone(化妆水)、maskpack(面膜)等)化妆品、头发营养剂以及染发剂。在本发明的一实例中，优选地，上述化妆品组合物还包含胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸以及肽中的一种以上，但并不限定于此。2.利用核酸适体或核酸适体-抗氧化成分复合体的膳食补充剂，本发明提供包含上述本发明核酸适体和抗氧化物质复合体或者单独包含核酸适体作为有效成分的膳食补充剂组合物。作为适用于本发明膳食补充剂的维生素的例，有维生素a、维生素c、维生素d、维生素e、维生素k、维生素b6、维生素b12、硫胺素、核黄素、生物素，叶酸、烟酸、泛酸、它们的混合物等。作为膳食补充剂组合物所包含的适合的矿物质营养素的例，具有选自钠、钾、钙、镁、磷、硫、氯、铁、铜、碘、锌、硒、锰、铬、钼、氟、钴、它们的化合物中的一种以上的元素。多种香草也可以用作膳食补充剂。通常，香草选自具有多种医药或饮食补充剂特性的香草。一般而言，香草为医药用或风味用芳香族植物或植物的一部分。并且，本发明提供通过将核酸适体与抗氧化物质相结合来维持抗氧化物质的还原状态，从而延迟氧化速度的方法。以下，说明本发明。在本发明中，和维生素c一样，可将如维生素a(retinol)、维生素e、虾青素、白藜芦醇、多酚、辅酶q10、肽(peptide)、油(oil)等对氧化非常不稳定的抗氧化物质与核酸适体相结合来用作膳食补充剂。像这样防止物质的氧化(腐败)，从而最大限度地维持这些物质所要求的效果。并且，通过适配子传感在目的条件下将其释放，从而可最大限度地增加其效果。并且，本发明提供根据其抗氧化成分开发的核酸适体和抗氧化成分复合体，或者单独提供活性状态的核酸适体和抗氧化成分。在本发明的一实例中，优选地，上述抗氧化物质为选自由维生素c、维生素a、视黄醇、维生素e、虾青素、白藜芦醇、4'-乙酰氧基白藜芦醇(acetoxyresveratrol)、儿茶酚、各种多酚类、表没食子儿茶素没食子酸酯、辅酶q10、泛醇、泛醌、欧美加3以及油组成的组中的物质，但并不限定于此。3.利用核酸适体和/或抗氧化物质复合体的饮料及食品组合物本发明提供包含上述本发明的核酸适体和抗氧化物质复合体作为有效成分或者在饮料中单独包含核酸适体的饮料组合物。在本发明的一实例中,优选地，上述组合物还包含胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸以及肽中的一种以上，但并不限定于此。并且，本发明提供包含上述本发明的核酸适体和/或抗氧化物质作为有效成分的食品组合物。在本发明的一实例中，优选地，上述食品组合物还包含胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸以及肽中的一种以上，但并不限定于此。在本发明的一实例中，优选地，上述食品组合物为饼干类、糖果类、乳制品、口香糖类、酱类、面包类或冰淇淋，但并不限定于此。并且，本发明提供在食品中添加上述本发明的核酸适体来制备食品的方法。在本发明的其他实例中，优选地，若上述食品、饮料组合物被体内吸收而核酸适体的结构发生变化，则所结合到的维生素c被释放，或者若atp量随着体内的环境变化而改变，则与其相结合的核酸适体的结构改变，从而释放维生素c，但并不限定于此。发明的效果通过本发明可知，本发明的核酸适体具有防止如同维生素c的抗氧化物质被氧化的效果，且可预期捕获有本发明的核酸适体的水凝胶具有通过核酸适体调节皮肤活性成分的释放速度并根据从皮肤分泌的特定物质的量来调节抗氧化物质的释放成分的功能。本发明的核酸适体具有防止如同维生素c的抗氧化物质被氧化的效果，利用本发明的核酸适体自身或者核酸适体和抗氧化物质的复合体，例如，选择性地与维生素c(抗坏血酸)相结合的核酸适体来维持维生素c还原状态，来使其抗氧化功能维持长时间，从而可利用于多种剂型的功能性化妆品和口服用膳食补充剂(dietarysupplements)等。若利用选择性地与维生素c相结合的核酸适体，则即使用少量的维生素c也可以期待持续且极大化的抗氧化效果。并且，通过本发明可知，本发明利用选择性地与维生素c(抗坏血酸)相结合的核酸适体来维持维生素c等生理活性成分的还原状态，来使其抗氧化功能维持长时间，从而可利用于多种健康饮料、抗氧化饮料以及抗氧化食品等。并且，相比于以往的方法，利用核酸适体来防止抗氧化物质被氧化的方法为安全且创新的新的概念，能够以将其适用于各种产业中而产生效果的方式制备。尤其，将成为将以往的基于化学方法(chemical)制备的化妆品、膳食补充剂、食品市场飞跃性地改变为基于dna(bio)的市场的导火索。今后，可预期提供dna市场的爆发性的增加和创新的解决方案。附图说明图1为通过构成核酸适体(rna或dna)的碱基与维生素c的羟基的氢键结合来维持维生素c的还原状态的图；图2-图4为与核酸适体a、核酸适体b、核酸适体c相关的实验数据，图2为示出dha检测妨碍分析的图，是在各核酸适体存在的条件下dha检测(opda荧光)的时间经过曲线图。与核酸适体b及核酸适体c有关的曲线图与对照组相比具有区别，核酸适体a在对照组的范围内，因此表示22号核酸适体不妨碍检测分析；图3为示出通过与氧化剂有关的核酸适体保护aa的氧化性保护的图，示出在10.3μm的cuso4、103.3μm的naio4、10.3μm的h2o2以及103.3μm的tempol对照组和核酸适体a的覆盖，图4为示出对aa的核酸适体的滴定的图，滴定数据表示aa的氧化性保护随着核酸适体浓度的增加而增加；图5为示出在中根据时间经过的aa保护的图，是在中核酸适体a存在以及不存在的条件下比较aa的分析168h的曲线图；图6-图14为与核酸适体#1、核酸适体#2、核酸适体#3相关的实验数据，图6-图8为示出本发明的三个核酸适体借助过氧化氢水而防止维生素c被氧化的图，图9-图14为与本发明的核酸适体的aa(ascorbicacid)及dha(dehydroascorbicacid)有关的离解常数(kd)曲线图；图15-图16为示出利用本发明的核酸适体的功能性智能水凝胶的制备方法的图；图17-图19为示出对捕获有本发明的核酸适体的水凝胶进行适配子传感过程的图。具体实施方式以下，通过非限定性实施例详细说明本发明。但是，下述实施例仅为了例示本发明而记载，不应解释为本发明的范围限定于下述实施例。在本发明中，为了使靶(aa)不被迅速氧化，所有缓冲液和溶液在100resin(biorad)中搅拌1小时，通过0.2μm的过滤器(sarstedt)过滤，利用氮气(n2gas)(praxair)喷洒10分钟并使用去除偶然产生的金属的分子生物学级水(phenixresearch)来制备。实施例1：dna核酸适体筛选及序列分析抗坏血酸selex：使用由～1015特别的低聚核苷酸构成的dna文库(dnalibrary)(basepairbiotechnologies)执行与抗坏血酸有关的selex九回。所使用的缓冲液的组分为如下：50mm的乙酸钠(sodiumacetate)ph5.5(sigma)、1mm的mgcl2(sigma)、0.05％的tween20(sigma)、1％的bsa(sigma)以及1mm的谷胱甘肽(glutathione)(sigma)。通过selex的严格性(stringency)来减少与靶有关的核酸适体的结合时间，通过变更缓冲液的组分并减少自由分子洗脱中的靶的浓度来进行变更。为了从丰富的(enriched)文库去除与氧化形态的抗坏血酸相结合的核酸适体而执行与dha有关的阴性选择。实施例2：与抗坏血酸氧化产物有关的荧光分析对记载于vislisel等(vislisel，j.m.，schafer，f.q.andbuettner，g.r.(2007)analyticalbiochemistry，365，31-39)的方法进行变形来对通过抗坏血酸的氧化得到的产物脱氢抗坏血酸(dha)进行逆向检测。综上所述，在添加氧化剂(10.3μm的cuso4(emscience)及h2o2(sigma)、103.3μm的tempol(sigma)及naio4(sigma))之前，将核酸适体(41.3μm)在常温、4x的浓度条件下用aa(10.3μm)培养30分钟。在添加opda染料(dye)(sigma)之前且在添加氧化剂样品之后，在常温下培养10分钟。在添加染料(954.6μm)样品之后，利用i3x酶标仪(moleculardevices)在激发波长345nm、释放波长425nm的条件下每隔60秒钟进行读取45分钟，直到对照组被收敛。筛选数据呈现出aa保护，为了确认没有氧化产物(dha)或分析染料(opda)的干扰，利用将dha(10.3μm)(sigma)在aa的位置培养的选定的核酸适体反复进行荧光分析。改为50mm的乙酸钠(sigma)、1％的bsa(sigma)、0.05的％tween20(sigma)、1mm的mgcl2(sigma)并调整到(adjustedto)ph5.5来进行所有分析。在黑色384孔板(greinerbio-one)进行所有荧光分析。对各样品反复进行3次。实施例3：与aa有关的核酸适体滴定为了决定最佳核酸适体(a)的有效浓度而将其滴定至aa(10.3μm)。与aa有关的核酸适体的相对浓度为10x、5x、2x、1x、0.5x、0.25x以及0.1x(在103μm中核酸适体为1.03μm)。在向10.3μm的cuso4中添加所有核酸适体/aa混合物之前，在常温下培养30分钟，在向954.6μm的opda添加样品之前，在常温下进一步培养10分钟。在ex：345nm、em：425nm的条件下读取板45分钟，每隔60秒钟收集数据。对各样品反复进行3次。实施例4：核酸适体亲和度检测抗坏血酸及脱氢抗坏血酸等物质从sigma-aldrich(st.louis，mo)购买。使用mst(microscale-thermophoresis)检测对与aa及dha有关的核酸适体的亲和度(jerabek-willemsenmetal.assayanddrugdevelopmenttechnologies.2011；9(4)：342-53)。终上所述，在50um至1.53nm对cy5-共轭(cy5-conjugated)核酸适体(5nm)进行靶(aa或dha)的16连续稀释和培养。用扫描毛细管(4ul/管)装入之前，培养混合物15分钟。在使用monolithnt.115mst装置(nanotempertechnologies)暴露于热梯度的期间对各样品的荧光进行检测来制作结合曲线。各分析反复进行3次。实施例5：质量分光法制备样品在(kiwi-strawberry)(glaceau，coca-cola)中培养核酸适体a(50um)。在常温下培养样品并在0h、1h、2h、4h、8h、24h、48h、72h、96h以及168h收集10ul。在进行lc-ms/ms分析期间为了监测aa及dha的稳定性而在各时间点前后注射抗坏血酸(cerilliantcat#v-038)及脱氢抗坏血酸(sigma-aldrichcat#261556)对照组。利用抗坏血酸内部标准物质c13(torontoresearchchemicalscat#a786992)以200ng/ml的最终浓度添加各样品及对照组。将aa储备溶液(cerilliant1mg/mlinacetonitrile：h2o，50：50)以10ug/ml并用aa-c13稀释至1000ng/ml。将10ul的aa(2ug/ml)用90ul的aa-c13稀释至1000ng/ml来分别从aa及aa-c13得到最终浓度1000ng/ml及900ng/ml。将dha对照组用900ng/ml的aa-c13制备成1ug/ml的最终浓度。将各时间点的样品在相同的内部标准物质溶液中以1：200进行稀释并用lc-ms/ms进行分析。lc-ms/ms参数(mrm)：利用eksigentμuhplc(eksigent，redwoodcity，ca，usa)耦合获得物(acquisition)，并利用具有设有50μmid毛细管的电子喷雾接口的absciexqtrap6500(absciex，fostercity，ca，usa)执行。在“lowmasshardwareconfiguration”调节analyst1.6.3软件并为了数据加工及识别而使用。为了监测抗坏血酸、抗坏血酸-c13以及dha而使用优化的mrm参数。样品2μl的定量管以定量过度填充的方式注射样品并用lc-ms/ms进行分析。在维持45℃的geminic18fromphenomenex50mmx0.5mm上进行分离。在3.5minlc梯度内，流动相由溶剂a(10mm的tba及15mm的溶解于水中的乙酸(aceticacidinwater))及溶剂b(10mm的tba及15mm的溶解于甲醇中的乙酸(aceticacidinmethanol))构成，流速为30μl/min。梯度从100：0a：b开始。使用离子对试剂作为tba，各样品反复分析3次。上述实施例的结果为如下。dna核酸适体筛选通过根据selex方法产生的丰富的文库生物信息分析来获得候选核酸适体，从其中的前20个筛选从氧化中保护aa的能力。基于候选核酸适体的aa的氧化性保护核酸适体全部筛选在此分析中，dha的积累/检测表示aa的氧化。因此，若核酸适体从氧化中保护aa，则所生成的信号比阳性(no核酸适体)对照组更低。由aa及氧化剂、阳性对照组(aaplusoxidizer)以及阴性对照组(aaminusoxidizer)混合而成的各候选核酸适体的覆盖曲线图示出在图2中，各方块表示几个核酸适体候选物质。20个核酸适体中，由于具有未满阳性对照组的显著的区别，因此筛选出aa的保护效果明显的三个(核酸适体a、核酸适体b以及核酸适体c)，这些在30分钟内对22号、27号以及44号的aa氧化分别减少了35±13％、43±9％以及25±8％(n＝3)。确定妨碍检测分析的核酸适体为了确定通过筛选获得的前三个核酸适体(a、b以及c)自身是否妨碍检测分析，对作为氧化而成的aa产物的dha进行分析。暗示了核酸适体a在dha对照组曲线图范围内且其不妨碍检测方法。但是，核酸适体b及核酸适体c与对照组曲线图相比有所区别，这暗示着在对这些核酸适体的筛选中所生成的数据不可靠(图2)。为了得到可靠的数据，在所有实验中只使用了核酸适体a。对氧化剂的核酸适体筛选评价了核酸适体a对4种氧化剂(cuso4(10.3μm)、naio4(103.3μm)、h2o2(10.3μm)以及tempol(103.3μm)的保护aa的能力。为了在阳性及阴性对照组之间制作用于确定最低浓度的适当的测试窗对aa(10.3μm)进行了各氧化剂的滴定(未图示数据)。22号核酸适体虽然在naio4存在的条件下对氧化的保护失败(图3，右上(topright))，但对h2o2及tempol的aa的相对氧化分别减少了19±6％及51±7％(图4，bottompanels)。并且，在重新对cuso4所进行的分析(增加装置)中氧化比初期筛选减少了19％以上，即减少了54±5％(图3，左上(topleft))(n＝3)。对aa的核酸适体a的滴定在10x、x、2x、1x、0.5x、0.25x以及0.1x的相对浓度下培养核酸适体a及抗坏血酸。对阳性及阴性对照组滴定书序以覆盖方式制图(图4)。滴定容量起到依赖性作用。在最低的两个浓度(0.1x及0.25x)中未观察到氧化保护效果，氧化保护效果随着aa与核酸适体的比例增加而增加。氧化保护程度在所测试的范围内未呈现出稳定状态，因此，基于核酸适体a的aa的最大保护效果在aa的10x以上的浓度中产生。核酸适体亲和度检测利用mst检测核酸适体a对aa及dha的结合亲和度，对aa及dha所检测到的kd值分别为987.9nm及189.7nm(n＝3)。在中aa的氧化保护使用曲线下面积(auc)并利用multiquantsoftware(absciex)来执行数据整合和定量化。基于aa的定量化经过168小时进行检测(图5)。当该时间结束时，在对照组及处理了核酸适体a的样品中分别留有初期aa的21.9±6.6％及47.5±0.5％(n＝3)。aa半衰期在对照组及处理了核酸适体a的样品中分别为84±10h及141±14h。这表示核酸适体a的添加使在中的aa的半衰期增加168％。并且，上述vitaminwater饮料为ph2.5，因此，表示aptamin在此ph浓度中也起作用。实施例6：与还原状态的维生素c相结合的核酸适体组构建在如下的条件下进行通过selex(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment)过程从由1013个构成的dna核酸适体文库查找选择性地与还原状态的抗坏血酸相结合的核酸适体的实验。为了在维持抗坏血酸的还原状态的状态下进行selex，维持～ph5.5程度并投入谷胱甘肽。在此条件下维生素c不是以被氧化99％以上的脱氢抗坏血酸(dha)维持，而是以被还原的l-抗坏血酸状态维持。对在如上所述的反应条件下进行selex来选择的全部核酸适体进行下一代测序(nextgenerationsequencing)后进行分析，由此可获得由3000个以上的二级结构组组成的核酸适体。实施例7：通过核酸适体防止维生素c被氧化的定量分析根据二级结构的种类选择20个单独的核酸适体来进行防止维生素c被氧化的实验。溶解于退火缓冲液(annealingbuffer)中的核酸适体加热至95℃后，将温度缓慢地降至常温并制作核酸适体的二级结构后，反应约30分钟，以与被还原的l-抗坏血酸混合来使核酸适体可与l-抗坏血酸相结合。之后，添加过氧化氢形成氧化条件后，通过添加作为荧光染料的邻苯二胺(opda，o-phenylenediamine)来检测l-抗坏血酸的氧化。可通过对作为l-抗坏血酸的氧化物的dha与opda进行反应而生成的dha-opda的荧光量进行检测来对dha的生成程度进行定量分析。在如上所述的条件下，每隔34秒钟检测dha-opda的荧光量25分钟。其中三个核酸适体均防止了维生素c被过氧化氢氧化。12号核酸适体产生了防止约40％的氧化的效果，8号核酸适体产生了防止约20％的氧化的效果，10号核酸适体产生了防止约40％的氧化的效果。根据这种实验及其他经验，可作出三个核酸适体直接与维生素c进行反应而防止维生素c被氧化的结论(参照图6至图8)。实施例8：确定与本发明的核酸适体的抗坏血酸(aa)及脱氢抗坏血酸(dha)有关的steady-state溶液离解常数(kd)使用mst(microscalethermophoresis)确定离解常数。在本实施例中，与两个靶有关的分析缓冲液包含与三个核酸适体有关的mst数据及算出的kd。包含抗坏血酸及脱氢抗坏血酸的所有试剂从sigma-aldrich(st.louis，mo)购买。在制备缓冲液之前，用chelex-100树脂处理去离子水1小时来去除偶然产生的金属。用chelex处理后，为了使氧最小化利用氮气对该水喷洒10分钟并进行保管。将该水使用于所有水溶液中。最终缓冲液为50mm的乙酸钠、ph5.5、1mm的mgcl2以及0.05％的tween-20，aa及dha均在缓冲液中在e5um中153pm(最终)(对核酸适体#10&#12)或者在50um中1.53nm(最终)(对核酸适体#8)中以1：1进行继代稀释并进行分析。各cy5-共轭核酸适体的最终浓度为20nm。在nanotempertechnologiesgmbh(munich，germany)公司的monolithnt.115mst装置对各所描述的两次中的稀释物进行检测两次。其结果示出在图9至图14中。各数据点与平均和拟合曲线(fittedcurve；黑线)一起示出在图中。各曲线图的垂直波线表示kd。通过上述结果推论出如下的结论：1)核酸适体#2&1对aavsdha具有更优秀的选择性，与此相反，#8对dha比对aa具有更优秀的选择性。2)三个核酸适体中核酸适体#3对aavsdha具有最优秀的选择性。3)核酸适体#1从氧化中保护aa的效果最好，但对aavsdha的选择性最差。实施例9：核酸适体和水凝胶的捕获在本发明的核酸适体捕获于水凝胶的方法中，首先，在粘贴在核酸适体的胺基粘贴生物素(biotin)，然后，利用具有与其相结合的链霉亲和素的粒子进行功能化后，当烧成水凝胶时以20％的比率进行混合来在水凝胶捕获核酸适体粒子。在此方法中，核酸适体与水凝胶之间不产生化学键且比较容易实现，因而此方法简单。在其他方法中，通过化学方法将粘贴在核酸适体的胺基或羧基粘贴在水凝胶的羟基，此方法为通过化学方法将核酸适体与水凝胶相结合的方法。此外，可通过调节水凝胶的化学成分或者更换与核酸适体相结合的官能团来形成多种形态的键。可通过包括将胺基与核酸适体相结合的步骤a)、将水凝胶单体的羟基硅烷化为具有环氧基的3-缩水甘油醚氧基丙基甲基二乙氧基硅烷后在环氧基结合与上述核酸适体相结合的胺基的步骤b)以及聚合上述水凝胶单体的步骤c)的具体捕获方法来制备捕获有核酸适体的水凝胶。另一方面，通过如上所述的方法将目前为了保湿效果而广泛使用的胶原蛋白水凝胶制备成核酸适体-胶原蛋白水凝胶，可增加感测(sensing)后以更慢的速度释放成分的功能。例如，缓慢地向皮肤供给为了防止皮肤老化所使用的替普瑞酮(teprenone)或辛酸(caprylicacid)等作为核酸适体-胶原蛋白水凝胶，或者根据从细胞分泌的与皮肤老化相关的细胞因子的量进行分泌，从而可增加智能感测功能。实施例10：制备含有基于本发明的核酸适体的维生素c的饮料向1000g的灭菌纯化水中添加1g的本发明的核酸适体维生素c复合体、500g的低聚糖、2g的甘氨酸、2g的牛黄酸、0.2g的柠檬酸钠并混合后，再添加纯化水，以使总重量达到2000g。然后，添加有如上所述的成分的溶液以80rpm搅拌1小时后，在真空状态下填充至容器中，从而制备含有与核酸适体相结合的维生素c的维生素饮料。作为比较例，除了使用1g的维生素c(英国dsm)代替本发明的核酸适体维生素c复合体之外，以与上述实施例10相同的工序制备饮料。实验例1：官能检验对在上述实施例10中制备的本发明的维生素饮料和比较例的饮料进行如味、香、整体嗜好度等官能检验，其结果示出在下列表1中。如上所述的官能检验中，由20名(男女各10名)在食品相关领域从事3年以上的官能检验员通过五点尺度法进行检测，与各个项目有关的数值通过将官能检验员给出的分数的总和除以官能检验员人数后对得出的数值在小数点后第二位上进行四舍五入来表示。表1表1为实施例饮料及比较例饮料的官能检验结果官能检验表示数值越高官能性越优秀。从上述表1可知，以往的维生素饮料和本发明的维生素饮料在官能检验中没有很大的区别，但本发明的饮料呈现出略高的检验结果。实验例2：本发明的饮料的疲劳改善效果使50名具有慢性疲劳症状的人(男性20名，女性30名)每天摄取150ml的在上述实施例4中制备的本发明的维生素饮料和比较例的饮料两周后，对疲劳改善效果进行问卷调查，其结果示出在下列表2中。表2项目abc合计(名)实施例4453250比较例3510550表2为与实施例4及比较例的疲劳改善效果(单位：名)有关的表，在表中，a：有疲劳改善效果，b：无疲劳改善效果，c：不清楚从上述表2可知，在实施例10中制备的维生素饮料及通过以往的方法制备的比较例的饮料均具有疲劳改善效果，但相比于比较例的饮料，在本发明的实施例4中制备的维生素饮料的疲劳改善效果更佳。这暗示着通过维持维生素c的抗氧化活性来使本发明的饮料具有更好的疲劳改善效果。如上所述，虽然参照本发明的优选实施例进行说明，但本
技术领域：
的普通技术人员可理解，在不脱离本发明的要求保护范围中所记载的本发明的思想及领域的范围内，可对本发明进行多种修改及变更。序列表<110>（株）纳斯摩仕<120>利用核酸适体的防止抗氧化物质被氧化的方法、物质、其用途<130>ipc1903kr0522<150>pct/kr2016/011740<151>2016-10-19<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1agagctcgcgccggagttctcaatgcaagagc32<210>2<211>32<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtggaggcggtggccagtctcatacgcggcag32当前第1页12