一种大白鼠肋骨缺损模型的构建方法与流程

本发明涉及生物医学研究
技术领域：
，特别涉及一种稳定的大白鼠肋骨缺损模型的构建方法。
背景技术：
：人类疾病的动物模型(animalmodelofhumandisease)是指各种医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表现的动物。动物疾病模型主要用于实验生理学、实验病理学和实验治疗学研究。人类疾病的发展十分复杂，以人本身作为实验对象来深入探讨疾病发生机制，推动医药学的发展来之缓慢，临床积累的经验不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。而借助于动物模型的间接研究，可以有意识地改变那些在自然条件下不可能或不易排除的因素，以便更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于更方便、更有效地认识人类疾病的发生发展规律，研究防治措施。骨缺损的结构完整性被破坏，是临床常见病，也是骨科治疗的难题之一。骨缺损主要包括骨缺损和缺损修复两大部分，先天性因素是唇腭裂是常见因素之一，后天的病因有常见的有工伤、烧伤、爆炸伤及交通事故等所造成的颌骨、耳、鼻、眼及肢体的损伤。感染、肿瘤、骨髓炎手术清创也是导致骨缺损的主要原因。目前，治疗骨缺损的方法有自体骨和异体骨移植、组织工程技术和基因治疗法及生长因子、物理治疗法的辅助治疗等。在骨折的人类身上做探究实验往往不太现实，这就在一定程度上限制了医疗技术的进步。研究者在骨缺损模型的建立上已经有一些探索，专利“一种股骨中下段骨缺损模型及其构建方法和应用”申请号（201510627050.7）中提出了一种构建动物股骨中下段骨缺损模型的方法，麻醉动物后，于动物的股骨中下前外侧作切口，显露股骨中下段，在股骨中下段切除不同尺寸的股骨，制造骨缺损，冲洗伤口，缝合包扎，即得到股骨中下段骨缺损模型。在该建模方法中，动物处理过于简单，未考虑后续给药处理问题，未为骨缺损治疗过程中的配合治疗方法打下基础，一定程度上背离了目前临床骨缺损治疗过程中的常用恢复手段，模型的建立对临床医学治疗的参考价值有限。为进一步探明骨缺损发生的病因、病理学、临床等方面的机制，有必要构建稳定的类骨缺损发生的动物模型，最大程度的模拟人骨康复的全过程，寻找更有效的治疗骨缺损的方案。技术实现要素：鉴于以上问题，本发明提供了一种安全、快捷、操作简便、重复性高的大白鼠肋骨缺损模型的构建方法，为探明骨缺损发生的病因及有效的临床治疗方案提供与人类更为相关的实验数据。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种大白鼠肋骨缺损模型的构建方法，包括以下步骤：S1：实验鼠的准备将实验动物饲养在普通级动物房中饲养，保持室内温度为20-25℃，相对湿度40-70%，动物自由取食，自由饮水，饮用水均为经净水器净化后的自来水，符合WHO饮用水规范。S2：麻醉将实验鼠分成两组，一组为手术处理组，一组为对照组。首先肌肉注射0.05mg/kg阿托品。5min后，肌肉注射4mg/kg氯胺酮，进行麻醉。此后使用含1.0%异氟烷的0.8-1.5L/min氧气做维持麻醉。S3：手术过程动物接受手术的当天，将手术部的毛发剃除，并使用碘伏及乙醇清洁消毒围手术区域。随后实验鼠被放在手术台上，四肢固定。将手术部四周悬浮固定，使用碘伏360度消毒备皮。在手术部位上，于肋骨末端用手术刀做一个小型刺切口，对照组实验鼠仅进行此步操作，无后续操作。用一根1.2mm直径，5cm长的克氏针从肋骨末端插入，在确保克氏针固定后，将其插入肋骨骨髓腔0.5cm。随后在肋骨上做一个1-2cm长的正面切口，钝性分离其上的肌肉，使肋骨暴露。使用手持牵开器将肋骨周围软组织牵开，形成约1cm宽的开口。使用无菌笔在肋骨上标记出需要行截骨术的部位。用牙科钻的震荡锯头在实验鼠肋骨上切除1cm长的部分。截骨术完成后，检查骨断端，确保没有残余骨膜覆盖在骨截面处。将此前置于肋骨末端的克氏针继续插入，横跨截断处，插入对侧断端1cm深。切断远端肋骨外露的克氏针，将切断后的断端使用冲头和骨科锤钉入肋骨内，在肋骨截骨部位的软组织处使用可吸收线做连续缝合，缝合的密度可根据后续所给的阳性药物的颗粒大小或试剂的粘稠度来确定，以保证阳性药物不外漏掉落为宜，可吸收线做缝合部位的一侧不拉紧，使其部位形成一个口袋，使得合适的针头可以插入或是给药装置能伸入其中并到达克氏针周围区域以方便给药。S4：术后护理术后3天，实验鼠将持续接受丁丙诺啡至少0.02mg/kg肌肉注射，每天两次，间隔约8小时。如有必要可继续给与。手术结束时及术后3天，使用头孢曲松钠50mg/kg肌注，以防止感染。术后3天，每天至少2次监测动物的疼痛，不舒适和其它生命体征。S5：体重检测每三天测量一次动物体重并进行记录，并对术后实验鼠进行活动能力评分。S6：取材分析手术60天后，将动物安乐死并取出截骨术后修复的骨段。该骨段暴露后，使用振动锯从克氏针上方处将肋骨截断。用经无菌生理盐水浸泡过的纱布海绵将该骨段包裹，放置于5mL离心管中，保存于-20℃。以便后续进行扭转生物力学检测。在进行骨生物力学检测前，使用微型CT生成骨片段的三维成像及体积骨矿密度。优选的，所述步骤S2，需要保证所有手术过程均在麻醉和严格的无菌条件下进行，动物接受手术的当天，将手术肢端的毛发剃除，并使用碘伏及70%乙醇清洁消毒周围手术区域。优选的，所述步骤S3，在切除过程中，使用带针无菌注射器向肋骨及其周边喷撒无菌盐水降温，以防切割处温度过高引起断端的热损伤。优选的，所述步骤S4，待动物从麻醉中恢复后，允许实验鼠正常活动，食物和水将被置于笼底，以保证动物可以容易获取，在食物中额外添加诱食剂帮助实验鼠更多进食。优选的，所述造模完成后，选用微型CT扫描，触诊，生物力学测试及病理切片指标等对模型进行评价，均证明造模成功，与临床一致性很高。更进一步的，所述动物骨缺损模型在用于研究过程中，在给药后将肋骨截骨部位的软组织肌层缝线拉紧，皮肤层也用可吸收线做皮下连续缝合，肋骨远端的克氏针入口也用可吸收线做非连续缝合。本发明制作的骨缺损模型重复性高，同时在肋骨截骨部位的软组织处使用可吸收线做连续缝合，使其部位形成一个口袋，以方便给药，一方面将克氏针保留在肋骨截骨部位之间，最大程度的模拟了人类骨缺损治疗过程，克服了现有技术中单纯的进行骨切除术后不进行任何处理，未考虑进一步模拟人骨康复全过程的问题；另一方面本发明中动物模型中的口袋式非连续缝合方式也为探究一种新型肋骨骨缺损给药方案提供证据，更为探明骨缺损发生的病因及有效的临床治疗方案提供与人类更为相关的实验数据。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为体重测量数据。图2为术后实验鼠活动能力评分。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。实施例1.实验动物准备将实验动物饲养在普通级动物房中饲养，保持室内温度为20℃，相对湿度40-70%，动物自由取食，自由饮水，饮用水均为经净水器净化后的自来水，符合WHO饮用水规范。实施例2.麻醉将实验鼠分成两组，一组为手术处理组，一组为对照组。首先肌肉注射0.05mg/kg阿托品。5min后，肌肉注射4mg/kg氯胺酮，进行麻醉。此后使用含1.0%异氟烷的0.8-1.5L/min氧气做维持麻醉。实施例3.手术过程动物接受手术的当天，将手术部的毛发剃除，并使用碘伏及70%乙醇清洁消毒围手术区域。随后实验鼠被安放在手术台上，四肢固定。将手术部四周悬浮固定，使用碘伏360度方位消毒备皮。在手术肢上，于肋骨末端用手术刀做一个小型刺切口，对照组实验鼠仅进行此步操作，无后续操作。用一根1.2mm直径，5cm长的克氏针从肋骨末端插入，在确保克氏针固定后，将其插入肋骨骨髓腔0.5cm。随后在肋骨上做一个1-2cm长的正面切口，钝性分离其上的肌肉，使肋骨暴露。使用手持牵开器将肋骨周围软组织牵开，形成约1cm宽的开口。使用无菌笔在肋骨上标记出需要行截骨术的部位。用牙科钻的震荡锯头在实验鼠肋骨上切除1cm长的部分。在切除过程中，使用带针无菌注射器向肋骨及其周边喷撒无菌盐水降温，以防切割处温度过高引起断端的热损伤。截骨术完成后，检查骨断端，确保没有残余骨膜覆盖在骨截面处。将此前置于肋骨末端的克氏针继续插入，横跨截断处，插入对侧断端1cm深。切断远端肋骨外露的克氏针，将切断后的断端使用冲头和骨科锤钉入肋骨内。在肋骨截骨部位的软组织处使用可吸收线做连续缝合，但并不拉紧，使其部位形成一个口袋，使得4.5号的针头可以插入其中并到达克氏针周围区域以方便给药；在给药后将肋骨截骨部位的软组织肌层缝线拉紧，皮肤层也用可吸收线做皮下连续缝合，肋骨远端的克氏针入口也用可吸收线做非连续缝合。实施例4.术后护理术后3天，实验鼠将持续接受丁丙诺啡至少0.02mg/kg肌肉注射，每天两次，间隔约8小时。如有必要可继续给与。手术结束时及术后3天，使用头孢曲松钠50mg/kg肌注，以防止感染。术后3天，每天至少2次监测动物的疼痛，不舒适和其它生命体征。允许实验鼠正常负重及活动。食物和水将被置于笼底，以保证动物可以容易获取，可在食物中额外添加诱食剂帮助实验鼠更多进食。实施例5.体重和步态变化评分每三天测量一次动物体重。体重测量数据如图1所示。相对来说，动物在整个40天的实验周期中体重呈先降后生的趋势，从手术结束后即开始减轻，在术后第9天达到体重最低水平，并与术后第21天开始逐渐体重有所回升，有望超过术前体重。对照组实验鼠恢复速度及程度都明显高于手术处理组。由分析可得是由于术后恢复期消耗了动物的体能并且降低了实验鼠的进食欲，而手术对照组在进入短暂的体重下降期后，随身体的恢复逐渐回到正常体重。同时对小鼠的步态变化进行评分，评分表如图2所示，对照组和手术处理组实验鼠均未出现鼠体不能活动的现象，整体步态随时间发展逐渐改善，对照组实验鼠在术后15天后趋于正常，手术处理组实验鼠在术后20天后趋于正常。实施例7.取材分析手术60天后，将动物安乐死并取出截骨术后修复的骨段。该骨段暴露后，使用振动锯从克氏针上方处将肋骨截断。用经无菌生理盐水浸泡过的纱布海绵将该骨段包裹，放置于5mL离心管中，保存于-20℃。以便后续使用MTS858材料试验机进行扭转生物力学检测。在进行骨生物力学检测前，使用微型CT生成骨片段的三维成像及体积骨矿密度。微型CT的测量数据：骨体积分数（BVF），骨矿含量（BMC）和骨矿密度（BMD）见表1。BMC显示实际的矿化组织含量，可以看见手术显著减少了骨缺损部位的矿化组织，手术处理组内各实验鼠之间数据差别小，足以证明该建模方式比较稳定，重复性高。表1微型CT数据动物组别BVF(%)BMC(mg)BMD(mg/cc)手术处理组0.27454.52147.6363对照组0.62548.71280.1473生物力学测试的结果进一步验证了微型CT观测到的结果，手术愈合后的骨组织的力学数据，包括最大扭矩，刚度以及断裂能相比正常组有显著降低。证明造模成功，成模典型，与临床一致性很高。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3