本发明涉及一种多价肺炎球菌结合物组合疫苗的处方及其制备方法。通过选择适合不同型别多糖的结合方法制备结合物原液，并将它们进行组合制备疫苗。该组合疫苗，用于预防非上市肺炎球菌多糖结合疫苗血清型肺炎球菌引起的感染性疾病。所述组合疫苗由选自血清型2、8、9n、10a、11a、12f、15b、17f、20、22f和33f的肺炎球菌荚膜多糖与生理上可接受的载体蛋白质制备而成。
背景技术：
肺炎球菌是脑膜炎、菌血症、肺炎和中耳炎的最重要致病菌，同时可引起全身感染。肺炎球菌对青霉素和其他常用抗微生物药物的耐药性使治疗方案日趋复杂，并由此导致治疗失败。接种免疫制剂视为安全有效的预防措施。
预防肺炎球菌感染的免疫制剂分为多糖疫苗和结合疫苗两种，目前上市使用的多糖疫苗为“23价肺炎球菌多糖疫苗”，上市使用的结合疫苗为“10价肺炎球菌结合疫苗”和“13价肺炎球菌结合疫苗”。肺炎球菌多糖疫苗可用于2岁以上人群，主要用于65岁以上老年人对疾病的免疫预防。肺炎球菌结合疫苗具有优于多糖疫苗的众多优势，基本适用于各年龄人群，是目前肺炎球菌疫苗的一个主要研究方向。
“10价肺炎球菌结合疫苗”含有肺炎血清型1、4、5、6b、7f、9v、14、18c、19f和23f，“13价肺炎球菌结合疫苗”含有肺炎血清型1、3、4、5、6a、6b、7f、9v、14、18c、19a、19f和23f。已知的肺炎血清型有90种，随着“10价肺炎球菌结合疫苗”和“13价肺炎球菌结合疫苗”在全球的使用，免疫接种降低疫苗血清型肺炎球菌带菌率的同时，会导致非疫苗血清型肺炎球菌带菌率的增加。
“7价肺炎球菌结合疫苗”上市前研究期间，有9例由非疫苗血清型肺炎球菌导致的侵袭性疾病，其中对照组6例，试验组3例[blacks，etal，2000]。以色列一项研究中，结合疫苗能够有效降低疫苗血清型肺炎球菌鼻咽部带菌率，但非疫苗血清型肺炎球菌带菌率从接种前的15％-20％增加到32％-39％，总的肺炎球菌带菌率没有变化[daganr，etal，1996]。表明血清型分布发生了转换。疫苗血清型疾病的减少同时伴随着非疫苗血清型导致疾病的增加，这种情况称为“替代疾病”。替代疾病的最早证据来自一项评价7价肺炎球菌结合疫苗预防芬兰儿童(小于2岁)中耳炎(aom)的临床试验[eskolaj，etal，2001]。疾病预防控制中心(cdc)的abcs项目数据表明，非疫苗血清型肺炎球菌导致的儿童(小于5岁)侵袭性疾病例数在1998/1999和2003年间平均增加了21％[centersfordiseasecontrolandprevention，2005]。分析表明，肺炎球菌可能为了适应疫苗的使用，正通过不断获得基因物质而改变荚膜血清型。芬兰一项中耳炎研究中，肺炎球菌结合疫苗能够降低疫苗血清型带菌率，从而为中耳炎打开一个生态小境，可被非疫苗血清型肺炎球菌侵入[kilpit，etal，2003][eskolaj，etal，2001][straetemansm，etal，2003]。
迄今为止，非疫苗血清型肺炎球菌导致的疾病增加幅度与疫苗血清型肺炎球菌导致疾病的降低幅度相比还很小，但其趋势不容忽视，其危害不容小觑。非疫苗血清型肺炎球菌在人群中传播，意味着非疫苗血清型肺炎球菌将成为侵袭性肺炎的主要病原。为遏制此趋势的蔓延，需要考虑将非疫苗血清型肺炎球菌结合物组合，用于预防非疫苗血清型肺炎球菌导致的感染性疾病。
预防非疫苗血清型肺炎球菌导致的感染性疾病的一种思路是将尽可能多血清型的肺炎球菌荚膜多糖结合到一种结合疫苗中，如包含24个肺炎球菌血清型的多糖结合疫苗，从而一劳永逸地解决预防肺炎球菌感染问题。虽然结合疫苗中所含多糖的种类越多越好，但在技术上存在着一定的挑战。其中部分原因是生产工艺较为困难。此外，疫苗配方中载体蛋白质总量必须限制，太多载体蛋白质会影响对多糖抗原免疫应答[herzenbergla，etal，1982][renjifox，etal，1998][daganr，etal，1998]。t细胞对载体蛋白质的免疫性对在多糖的免疫应答中很重要，但b细胞对载体蛋白质的免疫性可能不利于载体抗体的诱发[baringtont，etal，1994][baringtont，etal，1993]。当多糖和蛋白质特异性b细胞在竞争夺取结合物的情况下，大量抗载体蛋白质抗体可能抑制对多糖的免疫应答[daganr，etal，1998][fattoma，etal，1999][inselra，1995][peeterscc，etal，1991][baringtont，etal，1993]。如果将结合疫苗用于年龄较大的儿童和成人，则必须考虑作为加强疫苗的载体蛋白质的潜在作用。在一项研究中，结合疫苗能够诱发成年人和幼儿对破伤风和白喉载体蛋白质明显加强的免疫应答[0landerrm，etal，2001]。
本发明选用未纳入目前任何一种上市的肺炎球菌结合疫苗、但包含在“23价肺炎球菌多糖疫苗”血清型的肺炎球菌多糖，采用适合的方法制备各型结合物，再将结合物配制为多价肺炎球菌结合疫苗，所述结合疫苗所含组分少，其生产工艺也较为简单，同时涵盖了“23价肺炎球菌多糖疫苗”中致病性和流行性较高的肺炎球菌血清型，与已上市肺炎球菌结合疫苗配合使用，可有效预防非上市结合疫苗血清型肺炎球菌导致的感染性疾病，对控制肺炎球菌的感染具有重要价值。
技术实现要素：
本发明涉及一种多价肺炎球菌结合物组合疫苗的处方及其制备方法。通过选择适合不同型别多糖的结合方法制备结合物原液，并将它们进行组合制备疫苗。该组合疫苗，用于预防非上市肺炎球菌结合疫苗血清型肺炎球菌引起的感染性疾病并具有协同增效作用。所述组合疫苗由选自血清型2、8、9n、10a、11a、12f、15b、17f、20、22f和33f的肺炎球菌荚膜多糖与生理上可接受的载体蛋白质制备而成。
本发明所述的多价肺炎球菌结合物组合疫苗的制备方法，是由选自血清型2、8、9n、10a、11a、12f、15b、17f、20、22f和33f的肺炎球菌多糖结合物组合制备而成。
其中，所述肺炎球菌结合物为相应肺炎球菌血清型荚膜多糖与生理上可接受的载体蛋白质制备的多糖蛋白结合物。
其中，所述肺炎球菌荚膜多糖为：2、8、9n、10a、11a、12f、15b、17f、20、22f和33f血清型。
其中，所述肺炎球菌结合物组合疫苗为：2、8、9n、10a、11a、12f、15b、17f、20、22f和33f血清型中任意两种或多种结合物的组合。
为此，本发明提供一种多价肺炎球菌结合物组合疫苗，所述组合疫苗由选自肺炎球菌血清型2、8、9n、10a、11a、12f、15b、17f、20、22f和33f的肺炎球菌结合物组合制备而成，所述肺炎球菌结合物中的多糖蛋白质量比例为1∶1-1∶2之间。
优选的，本发明所述的组合疫苗，含有肺炎球菌血清型2、8、9n、10a、11a、12f。
或者
含有肺炎球菌血清型11a、15b、17f、20、22f、33f。
或者
含有肺炎球菌血清型8、9n、10a、20、22f、33f。
其中，所述肺炎球菌结合物中的多糖蛋白质量比例为1∶1，或者各组合中所有肺炎球菌结合物多糖浓度均为4μg/ml。
其中，所述生理上可接受的载体蛋白质选自：白喉类毒素(dt)及其交叉反应物质(crm)，crm是一类与白喉抗毒素形成反应的物质，含有如crm197、crm9、crm173、crm228和crm45；破伤风类毒素(tt)、百日咳类毒素(pt)、霍乱毒素b亚单位、不耐热大肠杆菌肠毒素(lt)、耐热大肠杆菌肠毒素(st)、绿脓杆菌外毒素a(epa)；外膜蛋白复合物(ompc)、肺炎球菌溶血素(ply)、肺炎球菌表面蛋白a(pspa)、肺炎球菌粘附蛋白a(psaa)、流感嗜血杆菌蛋白d。载体蛋白质优选dt、tt和crm197，最优选dt。
本发明所述的多价肺炎球菌结合物组合疫苗的制备方法，可以采用以下结合方法：
1.直接结合法：
利用多糖结构上固有的反应基团直接或通过间隔剂与载体蛋白质偶联。如利用多糖结构中的羧基，通过碳二亚胺介导，与己二酰二肼结合，再与载体蛋白质上的羧基反应，形成多糖蛋白结合物。
2.氰基活化法：
通过氰根活化多糖结构上的邻羟基，再与间隔剂己二酰二肼相连，制备出衍生多糖。衍生多糖和载体蛋白质在碳二亚胺介导下，由碳二亚胺与载体蛋白质上的羧基形成o-酰基异脲中间体，再与衍生多糖上的胺基反应形成多糖蛋白结合物。
这种氰基活化方式采用的氰化物试剂通常为溴化氰、1氰基4二甲基氨基吡啶四氟化硼等。采用的间隔剂包括丁二酸二酰肼、己二酰二肼等二肼类化合物，还包括二氨基乙烷、二氨基丙烷、二氨基丁烷、二氨基己烷等二氨基烷类化合物，也包括己二酸二琥珀酰亚胺酯等酯类化合物，还包括含反应官能团不一致的间隔剂，如氨基硫醇。也有不采用间隔剂，以cdap活化多糖后，直接与载体蛋白质的氨基反应制备多糖蛋白结合物。
3.胺还原法：
多糖经氧化或水解后，可在末端生成醛基，醛基可与氨基反应形成希夫碱结构，再经还原剂还原，形成稳定的c-n结构，形成多糖蛋白结合物。
多糖氧化多采用高碘酸钠法，高碘酸是一种氧化剂。多糖含有丰富的二醇基(choh-choh)，被高碘酸氧化后，断裂形成二个末端醛基。高碘酸的特点是不再进一步氧化已生成的醛基。
4.其它结合方法：
包括肟化学反应、重氮化反应、二硫键连接反应等。n-琥珀酰亚胺-3-二硫代吡啶丙酸(spdp)是常用的二硫键连接反应试剂，先将spdp连接到含氨基的组份上，与含巯基的组分发生巯基交换反应，形成以二硫键连接的多糖蛋白结合物。
本发明所述的多价肺炎球菌结合物组合疫苗的制备方法，肺炎球菌结合物中多糖与蛋白质的质量比例为1∶1-1∶2之间，其中所述质量以荚膜多糖的质量计算。例如，在本发明的多价肺炎球菌结合物组合疫苗中，单位剂量中，各型荚膜多糖的含量可以为0.1-10μg；优选含量为0.5-5μg；最优选含量为1-4μg。本发明的结合物组合疫苗中，各型多糖的含量可以相同，也可以不同。
本发明所述的多价肺炎球菌结合物组合疫苗的制备方法，还可包括疫苗制剂所需要的必要辅料，如可包含佐剂和/或缓冲液。所述的佐剂选自铝佐剂，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；或者水包油或细菌细胞壁成份，如mf59、sae、ras等；或者皂角类佐剂，如quila、qs-21；或者细菌脂多糖或合成类脂a佐剂；或者细胞因子，如白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、共刺激分子b7-1、b7-2等；或者毒素亚单位类佐剂，如霍乱毒素及亚单位、百日咳毒素、大肠杆菌不耐热肠毒素等。所述的缓冲液选自磷酸缓冲液或tris缓冲液，也可以是生理氯化钠溶液。缓冲液浓度可以是0.01-0.05mol/l，优选0.01-0.02mol/l，最优选0.01mol/l。
本发明所述的多价肺炎球菌结合物组合疫苗的制备方法，还可包含稳定剂和/或分散剂。稳定剂选自氨基酸，氨基酸可以是组氨酸，优选l-组氨酸，使用浓度1-00mmol/l，优选2-50mmol/l，更优选3-10mmol/l，最优选5mmol/l。组氨酸可以组氨酸缓冲液的形式出现。分散剂选自多聚山梨醇酯，优选tween80，使用浓度0.01-1％，更优选0.01-0.1％，最优选0.02-0.05％。
本发明所述的多价肺炎球菌结合物组合疫苗的制备方法，可以制成供临床用的各种制剂形式，所述的制剂形式选自液体剂型、冻干剂型，优选液体剂型。
本发明所述的多价肺炎球菌结合物组合疫苗，其接种途径包括肌肉注射、皮下注射、皮内注射途径。
本发明所述的多价肺炎球菌结合物组合疫苗，在免疫小鼠和大鼠后，能产生针对各血清型肺炎球菌多糖的特异性igg抗体，产生的各血清型特异性抗体滴度较高，阳转率基本都能达到100％，未出现免疫干扰情况。
以下通过实验数据说明本发明的有益效果：本发明制备多价肺炎球菌结合物组合小鼠免疫力实验：
本发明比对了3个肺炎球菌结合物组合，为6价结合物组合，载体蛋白质均为dt，所有结合物都采用胺还原法制备。其中组合1含有肺炎球菌血清型2、8、9n、10a、11a、12f，组合2含有肺炎球菌血清型11a、15b、17f、20、22f、33f，组合3含有肺炎球菌血清型8、9n、10a、20、22f、33f。各组合中所有肺炎球菌结合物多糖浓度均为4μg/ml。同时各组设置磷酸铝佐剂组对照。将3个结合物组合与3个对照组分别皮下免疫nih小鼠，每只小鼠免疫0.1ml，共免疫3针，每针间隔2周，末次免疫后4周，取血测定各肺炎球菌血清型特异性igg抗体滴度，以阴性对照平均值加2倍sd作为cutoff值判定血清抗体滴度，抗体滴度取对数后分析处理；以抗体4倍以上增长评定阳转率，结果见表1。发现3个组合产生的各肺炎球菌血清型特异性抗体滴度较高，阳转率都达到100％；含佐剂和不含佐剂组诱导抗体滴度的情况，未发现明显差异。
表1.多价肺炎球菌结合物组合小鼠免疫原性
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例1：多价肺炎球菌结合物组合处方
每0.5ml剂量含各型肺炎球菌多糖共22μg(多糖总量)，其中2、8、9n、10a、11a、12f、15b、17f、20、22f和33f各2μg。各型多糖与白喉类毒素结合后吸附于磷酸铝佐剂(铝含量0.125mg)，溶剂为生理氯化钠溶液。
实施例2：纯化肺炎球菌多糖检定结果
对11种肺炎球菌荚膜多糖分别进行纯化，每型3批，各批的质量检定结果如表2：
实施例3：肺炎球菌结合物检定结果
以胺还原法制备的11种型别的肺炎球菌结合物，各型肺炎球菌多糖与白喉类毒素结合，每个型别3批，各批次结合物的检定结果见表3：
实施例4：11价肺炎结合物组合小鼠免疫原性
组合中各型肺炎球菌结合物多糖浓度均为4μg/ml，各型多糖与白喉类毒素结合后吸附于磷酸铝佐剂(铝含量0.25mg/ml)。皮下免疫nih小鼠，每只小鼠免疫0.1ml，共免疫3针，每针间隔2周，末次免疫后4周，分离血清测定各肺炎球菌血清型特异性igg抗体滴度，以阴性对照平均值加2倍sd作为cutoff值判定血清抗体滴度，抗体滴度取对数后分析处理；以抗体4倍以上增长评定阳转率，结果见表4。
表4.11价肺炎球菌结合物组合小鼠免疫原性