本发明涉及疫苗领域，具体而言，涉及一种疫苗稀释液及其制备方法、应用和疫苗制品。
背景技术：
疫苗免疫是防控传染病的最佳手段。目前市场上使用的疫苗株主要分类2个大类，一类是弱毒活疫苗，另外一类为灭活苗或亚单位疫苗。其中弱毒活疫苗免疫后进入动物机体能够感染宿主细胞继续复制。而在临床实践中仔猪出生后可以通过初乳获得被动免疫，存在被动免疫的情况下，仔猪获得的母源抗体会干扰弱毒活疫苗在体内的复制，从而导致免疫失败。在群体中，因个体差异往往很难找到一个平衡点，因此需要多次免疫才能达到较高的免疫覆盖率，从而减少免疫失败的个例。
另外活疫苗通常使用磷酸盐缓冲液或者生理盐水作为稀释液，以伪狂犬病毒为例，疫苗免疫后28天才能提供100％的免疫保护力，而免疫后1、2、3周免疫保护率分别为5％、67％和92％。因此存在着长时间的免疫空白期，而此免疫空白期是伪狂犬病毒感染和发病的高峰期。
为了解决上述母源抗体干扰和免疫空窗期较长的问题，提高疫苗免疫效力，提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服上述现有技术缺陷，提供一种活疫苗稀释液，以解决猪瘟、猪伪狂犬病等动物活疫苗免疫时易受母源抗体干扰，免疫后抗体效价低、产生时间长、抗体维持时间短等问题。
本发明的另一目的在于提供上述的活疫苗稀释液的制备方法，该方法简单、易于操作。
本发明的另一目的在于提供上述的活疫苗稀释液在稀释活疫苗中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种疫苗制品。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一方面，本发明提供了一种活疫苗稀释液，其含有以下组份：
0.01％-1％(w/v，即g/ml，除另有说明外，本发明上述w/v均指质量体积比即g/ml，每100ml活疫苗稀释液含有0.01-1g卡波姆)卡波姆、0.1％-5％(w/v)左旋咪唑以及0.0001％-0.01％(w/v)皂苷；
上述活疫苗稀释液的溶剂为水、生理盐水或磷酸盐缓冲液中的任一种。
上述活疫苗稀释液中的卡波姆，包括但不限定于以下型号：71gnf、971pnf、974pnf、980nf、981nf、5984ep、etd2020nf、ultrez10nf、934nf、940nf、941nf、1242nf、pemulentr-1和tr-2nf聚合物。
上述活疫苗稀释液中的皂苷(saponin)是苷元为三萜或螺旋甾烷类化合物的一类糖苷，主要分布于陆地高等植物中，也存在于海星和海参等海洋生物中。许多中草药如人参、远志、桔梗、甘草、知母和柴胡等的主要有效成分都含有皂苷，具有抗菌的活性或解热、镇静、抗癌等有价值的生物活性。皂苷中广泛用于疫苗佐剂的皂苷是来源于南美quillaj皂莫利纳的树皮中提取的三萜皂苷(quila)或其馏分产物如qs-7、qs-17、qs-18及qs-21(见美国专利no.5057540和中国专利cn201510098559.7)。quila及其馏分产物具有表面活性，因此对囊膜病毒具有灭活作用，因此要将皂苷用于活疫苗需要消除皂苷对囊膜病毒的灭活作用。为了达到这一目标，本发明对皂苷浓度和剂型进行了优化，通过降低皂苷浓度，同时添加聚合高分子材料卡波姆后使用该稀释液稀释猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、鸡新城疫病毒、禽流感病毒冻干病毒等后在常温处理4小时，2-8度处理24小时，相应病毒效价与阴性对照组差异不显著，与皂苷阳性对照组差异显著。
本发明通过添加合适比例的卡波姆、左旋咪唑和皂苷作为活疫苗稀释液，采用该稀释液的活疫苗免疫后，可以在短时间内提高动物体抗体含量，有利于降低动物体在免疫空白期的感染和发病率。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，如上上述的活疫苗稀释液含有以下组份：0.05％-1％(w/v)卡波姆、1％-5％(w/v)左旋咪唑以及0.001％-0.01％(w/v)皂苷。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，如上上述的皂苷为人参皂苷、三七皂苷、大豆皂苷或皂树皂苷的总皂苷或其单体。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，如上上述的活疫苗稀释液所用溶剂为含有如下组份的磷酸盐缓冲液：100-150mm氯化钠、0.5-4mm氯化钾、1-100mm磷酸氢二钠以及0.1-10mm磷酸二氢钾。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，如上上述的活疫苗稀释液所用溶剂为含有如下组份的磷酸盐缓冲液：130-140mm氯化钠、2-3mm氯化钾、1-30mm磷酸氢二钠以及1-5mm磷酸二氢钾。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，如上上述的活疫苗稀释液含有以下组份：0.05％(w/v)卡波姆、1％(w/v)左旋咪唑以及0.001％(w/v)quila；
上述活疫苗稀释液的溶剂为含有如下组份的磷酸盐缓冲液：137mm氯化钠、2.7mm氯化钾、10mm磷酸氢二钠以及2mm磷酸二氢钾；ph＝6.8-7.4。
另一方面，本发明提供了如上上述的活疫苗稀释液的制备方法，其包括：将卡波姆、左旋咪唑以及皂苷溶解于溶剂后，灭菌即得。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，上述灭菌的条件为：106℃-121℃高压灭菌15min-30min。
本发明提供的活疫苗稀释液的制备方法步骤简单、易于操作。
再一方面，本发明提供了如上上述的活疫苗稀释液在稀释活疫苗中的应用；上述活疫苗为动物活疫苗。
进一步地，在本发明的一些实施方案中，动物活疫苗为猪瘟活疫苗或猪伪狂犬病活疫苗。
采用本发明的活疫苗稀释液可以提高活疫苗的免疫效果，短时间内提高动物体抗体，减少动物体在免疫空白期的感染率和发病率。
另一方面，本发明提供了一种疫苗制品，其包括动物活疫苗和如上上述的活疫苗稀释液。
本发明提供的疫苗制品可以短时间内提高动物体抗体，减少动物体在免疫空白期的感染率和发病率。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种活疫苗稀释液，包括：
将卡波姆、左旋咪唑以及人参皂苷溶于生理盐水中，控制终浓度为：卡波姆1％(w/v)、左旋咪唑5％(w/v)以及人参皂苷0.01％(w/v)，使用氢氧化纳或盐酸调节ph至7.2，得到活疫苗稀释液。
按一定体积分装后于121℃高压灭菌15min后备用。
实施例2
本实施例提供了一种活疫苗稀释液，包括：
将卡波姆、左旋咪唑以及三七皂苷溶于水中，控制终浓度为：卡波姆0.02％(w/v)、左旋咪唑1％(w/v)以及三七皂苷0.001％(w/v)，使用氢氧化纳或盐酸调节ph至7.0，得到活疫苗稀释液。
按一定体积分装后于121℃高压灭菌20min后备用。
实施例3
本实施例提供了一种活疫苗稀释液，其含有：0.01％(w/v)卡波姆、0.1％(w/v)左旋咪唑、0.0001％(w/v)大豆皂苷、100mm氯化钠、0.5mm氯化钾、100mm磷酸氢二钠以及0.1mm磷酸二氢钾。
该活疫苗稀释液的制备方法为：
根据配方，将以上物质溶解于注射用水中，添加氢氧化纳调节ph至7.2，按一定体积分装后于121℃高压灭菌25分钟后备用。
实施例4
本实施例提供了一种活疫苗稀释液，其含有：0.03％(w/v)卡波姆、1％(w/v)左旋咪唑、0.001％(w/v)quila、150mm氯化钠、0.5mm氯化钾、1mm磷酸氢二钠以及10mm磷酸二氢钾。
该活疫苗稀释液的制备方法为：
根据配方，将以上物质溶解于注射于水中，添加氢氧化纳调节ph至6.8，按一定体积分装后于121℃高压灭菌25分钟后备用。
实施例5
本实施例提供了一种活疫苗稀释液，其含有：0.04％(w/v)卡波姆、1％(w/v)左旋咪唑、0.001％(w/v)quila、130mm氯化钠、2mm氯化钾、30mm磷酸氢二钠以及5mm磷酸二氢钾。
该活疫苗稀释液的制备方法为：
根据配方，将以上物质溶解于注射用水中，添加氢氧化纳调节ph至6.8，按一定体积分装后于121℃高压灭菌25分钟后备用。
实施例6
实施例1-5所述的活疫苗稀释液的使用方法：
取制备的稀释液稀释冻干活疫苗，按照疫苗标明头份进行稀释，1-2ml/头份，稀释后滴鼻免疫或肌肉注射免疫。
实验例1
猪伪狂犬病活疫苗免疫比对实验
1材料
疫苗：猪伪狂犬病活疫苗sa215株，批号201701005四川华神兽用生物制品有限公司。
实验动物：猪伪狂犬病gb抗体阴性断奶仔猪。
猪伪狂犬病gb抗体检测试剂盒购于美国爱德士生物科技公司。
疫苗稀释液：实施例6制备的疫苗稀释液；常规疫苗稀释液为疫苗自带的磷酸盐缓冲液。
2动物免疫实验
(1)猪伪狂犬病gb抗体阴性断奶仔猪35头，随机分为7组，分别标记1、2、3、4、5、6、7组；
免疫剂量按照疫苗说明书使用，其中1-5组分别使用实施例6中制备的稀释液，6组使用疫苗自带稀释液，7组只免疫疫苗稀释液对为阴性对照。
免疫前及免疫后7、14、21、28日采集猪前腔静脉血，分离血清后测定猪伪狂犬病gb抗体。
免疫后每天观察所有猪的体温(连续测定7日)、采食、精神状况，记录相对于对照组正常的和异常的猪。
3实验结果
3.1免疫后各组临床表现情况
使用不同稀释剂免疫后，每天测定仔猪体温，连续测定7日期间所有仔猪体温均低于40.0℃，未见体温异常者。所有实验猪采食、饮水、精神状态均正常。统计结果表1所示。
表1免疫后临床症状观察结果统计
3.2免疫后猪伪狂犬病gb抗体变化规律
免疫前和免疫后均采集血清，按照猪伪狂犬病gb抗体测定试剂盒说明书测定所有采集血清的gb抗体。根据试剂盒说明书计算s/n值，其中s/n值低于0.6判定为阳性，s/n在0.6-0.7之间判定为可疑，s/n大于0.7判定为阴性。s/n值越低表示抗体含量越高。表2结果显示免疫后7日所有免疫猪抗体变为阳性，实施例6稀释液免疫组抗体滴度在免疫后7、14、21、28日均高于常规疫苗稀释组，未注射疫苗仔猪抗体持续为阴性。
表2免疫后抗体测定结果
实验例2
猪瘟活疫苗免疫比对实验
1、材料
(1)疫苗：猪瘟耐热保护剂活疫苗(细胞源)，批号201707006四川华神兽用生物制品有限公司。
(2)实验动物：猪瘟抗体阴性龄断奶仔猪。
(3)猪瘟抗体阻断elisa检测试剂盒购于美国爱德士生物科技公司。
疫苗稀释液：实施例6制备的疫苗稀释液；常规疫苗稀释液为疫苗自带的生理盐水。
2、动物免疫实验
(1)猪瘟抗体阴性断奶仔猪35头，随机分为7组，分别标记1、2、3、4、5、6、7组；
免疫剂量按照疫苗说明书使用，其中1-5组分别使用实施例6中制备的稀释液，6组使用疫苗自带稀释液，7组只免疫疫苗稀释液对为阴性对照。
免疫前及免疫后7、14、21、28日采集猪前腔静脉血，分离血清后进行猪瘟抗体的测定。
免疫后每天观察所有猪的体温(连续测定7日)、采食、精神状况，记录相对于对照组正常的和异常的猪。
3、抗体的测定
按照猪瘟阻断elisa抗体试剂盒说明书进行猪瘟抗体的测定。以组为单位进行数据统计。
4结果统计
4.1免疫后各组临床表现情况
使用不同稀释剂免疫后，每天测定仔猪体温，连续测定7日期间所有仔猪体温均低于40.0℃，未见体温异常者。所有实验猪采食、饮水、精神状态均正常。统计结果表3所示。
表3免疫后临床症状观察结果统计
4.2免疫后抗体变化规律
免疫前和免疫后均采集血清，按照试剂盒说明书进行抗体效价测定，结果发现，免疫后7日所有猪抗体均为阴性，使用实施例6稀释液组免疫后14日有部分猪变为阳性，免疫后21、28日均为阳性，抗体阻断率高于常规稀释液组，而对照组在免疫前、免疫后7、14、21、28日均为阴性。测定结果统计数据如表4所示。
表4免疫后猪瘟抗体测定结果(阻断率)
实验例3
猪伪狂犬病高母源抗体仔猪免疫实验
1材料
疫苗：猪伪狂犬病活疫苗sa215株，批号201701005四川华神兽用生物制品有限公司。实验动物：猪伪狂犬病gb抗体阳性断奶仔猪。猪伪狂犬病gb抗体检测试剂盒购于美国爱德士生物科技公司。
疫苗稀释液：实施例6制备的疫苗稀释液；常规疫苗稀释液为疫苗自带的磷酸盐缓冲液。
2、动物免疫实验
(1)猪伪狂犬病gb抗体阳性断奶仔猪35头，随机分为7组，分别标记1、2、3、4、5、6、7组。
(2)免疫剂量按照疫苗说明书使用，其中1-5组分别使用实施例6中制备的稀释液，6组使用疫苗自带稀释液，7组只免疫疫苗稀释液对为阴性对照。
(3)免疫前及免疫后7日、14日、21日、28日、2月、3月、4月时采集猪前腔静脉血，分离血清后测定猪伪狂犬病gb抗体。
3、实验结果
免疫前和免疫后均采集血清，按照猪伪狂犬病gb抗体测定试剂盒说明书测定所有采集血清的gb抗体。根据试剂盒说明书计算s/n值，其中s/n值低于0.6判定为阳性，s/n在0.6～0.7之间判定为可疑，s/n大于0.7判定为阴性。s/n值越低表示抗体含量越高。结果显示使用本发明中配备的稀释液免疫后抗体持续维持为阳性，而对照疫苗组和对照组在免疫后逐渐变为阴性。比结果表明，本发明中所配置的疫苗稀释液可以避免母源抗体的干扰。
表5猪伪狂犬病gb抗体阳性仔猪免疫后抗体测定结果
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。